第三章 基因载体的选择与构建.
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基因治疗中基因载体的选择与制备方法基因治疗是一种新兴的生物技术,旨在通过修改患者或被治疗个体的细胞或基因组,从而治疗某些遗传性疾病。
而在基因治疗中,选取适合的基因载体并进行有效的制备是非常重要的环节。
基因载体是将治疗目标基因引入患者细胞中的载体。
常见的基因载体包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体经过改造,使其具备携带外源基因的能力,并可安全地将其传递到目标细胞中。
而非病毒载体则通过物理方法将外源基因直接引入目标细胞。
选择适合的基因载体需要考虑多个因素,包括载体的携带能力、稳定性、毒性、免疫原性和适应性等。
病毒载体由于其自然而强大的感染能力,是最常用的基因载体之一。
常见的病毒载体有腺病毒、乙型肝炎病毒和逆转录病毒等。
腺病毒被广泛应用于基因治疗中,因其较低的免疫原性、能有效传递DNA负载和能稳定地整合到宿主细胞染色体中。
逆转录病毒则常用于基因治疗中的基因编辑,其逆转录酶能将外源基因逆转录为DNA并整合到宿主细胞基因组中。
非病毒载体则由于其较低的免疫原性和不会对宿主细胞的基因组产生影响而备受关注。
常见的非病毒载体包括质粒、合成肽和聚合物。
基因载体的制备方法是基因治疗中不可或缺的步骤之一。
制备病毒载体通常涉及病毒的扩增、负载外源基因、纯化和体积扩增等步骤。
通常,病毒载体的制备是通过细胞培养和转染实现的。
首先,将病毒载体的基因组与负载外源基因的载体进行重组,以构建含有外源基因的载体。
然后,将此载体转染至细胞中,通过细胞进行复制和扩增。
之后,通过离心等方法将病毒粒子从培养基中纯化出来,最终得到纯净、高效的病毒载体。
非病毒载体制备相对病毒载体制备来说较为简单,常用的方法包括钙磷共沉淀、电穿孔、脂质体转染和基因枪等。
钙磷共沉淀法是指将外源基因与钙盐共沉淀,形成核酸盐沉淀颗粒后,将其与细胞一同培养,使其穿过细胞膜进入细胞质。
电穿孔法是通过创造短暂的孔隙,使外源基因直接进入细胞内。
脂质体转染是通过外源基因与脂质体形成复合物,利用脂质体的疏水性与细胞膜相互作用,进入细胞质。
第三章基因载体的选择与构建内容提要•基因载体、报告基因与载体致死效应的概念•细菌质粒载体•噬菌体载体•酵母细胞克隆载体与酵母人工染色体•动物病毒载体•植物病毒载体第一节基因载体、报告基因与载体致死效应的概念一、基因载体外源DNA离开染色体是不能自主进行复制的,必须插入到复制子DNA中,做为复制子的一部分在受体菌中进行复制。
基因载体:指将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具。
根据其来源分为:质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体等。
根据主要用途分为:克隆载体和表达载体。
根据性质分:温度敏感型载体、融合型表达载体、非融合型表达载体等。
载体的功能:1、运载目的基因进入宿主细胞。
2、为外源基因提供复制能力和整合能力。
3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的共性:1、能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。
当外源基因插入其DNA后,仍能保持稳定的复制状态和遗传特性;2、易于从宿主细胞中分离,进行纯化;3、载体DNA序列中有适当的限制性酶切位点,最好是单一的酶切位点,并位于DNA复制的非必需区域内,可以在该位点上任意插入各种外源DNA片段,而不影响载体自身DNA的复制;4、具有能够观察的表性特征(报告基因或选择标记),在插入外源DNA后,这些特征可作为重组DNA的选择标志。
二、载体的报告基因基因工程中常利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因,可证明载体已经进入宿主细胞,并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其它细胞中识别区分甚至挑选出来。
这种具有标志意义的基因就称为报告基因或标记基因。
常用的报告基因:抗药性基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-半乳糖苷酶基因、人生长激素基因以及发光基因等。
三、载体的致死效应利用质粒或噬菌体载体进行基因克隆时,有时大量的克隆化基因(基因的合成消耗宿主细胞的营养和能量)和克隆化基因产物对宿主来说是有害的。
例如,大量表达的目的蛋白质能抑制宿主菌的生长,有的会使宿主菌中毒死亡,这就是载体的致死效应。