腺病毒载体构建 ppt
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腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展,越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。
这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。
腺病毒(Adenovirus)是一种不包含RNA病毒的DNA病毒,其表面包裹着许多蛋白质,使其具有较好的基因导入能力。
这使得腺病毒成为一种常用的基因载体,被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。
腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA,这条DNA上编码了丰富的基因信息,其中大约包含40个基因左右。
腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型,目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。
腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法,分别是端到端的法和质粒基因重组的法。
端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。
这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂,对实验人员的操作技能要求较高。
同时,这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。
质粒基因重组的法对比之下,质粒基因重组的法相对来说较为容易,需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。
通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中,将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组,从而构建出目标腺病毒载体。
质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响,而且富于设计灵活度,从而满足更多的实验需求。
腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。
通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。
基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。
通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除,从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。
目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用,对于生命科学研究者来说具有重要的意义。
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR),在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2],将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞,是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。
在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高,由于脂质体的转染率较低和毒性较大,现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1,以提高转染率和降低毒性。
1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司;PBMC从人血分离;质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela(宫颈癌细胞)及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。
1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。
Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。
质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。
淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。
1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如(图1)。
设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物,PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中,得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。
图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中,约24h后细胞密度达到60%~80%时,用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。
待细胞长满培养板时,将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。
pAAV-‐MCS编号 载体名称北京华越洋VECT10024 pAAV-‐MCSpAAV-‐MCS载体基本信息:载体名称: pAAVMCS, pAAV-‐MCS, p AAV M CS质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点,限制性内切酶载体大小: 4650 b p5' 测序引物及序列: CMV-‐F: 5'-‐CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-‐3'3' 测序引物及序列: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐MCS载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCAAAG C CCGGGCGTC 61 G GGCGACCTT T GGTCGCCCG G CCTCAGTGA G CGAGCGAGC G CGCAGAGAG G GAGTGGCCA 121 A CTCCATCAC T AGGGGTTCC T GCGGCCGCA C GCGTGGAGC T AGTTATTAA T AGTAATCAA 181 T TACGGGGTC A TTAGTTCAT A GCCCATATA T GGAGTTCCG C GTTACATAA C TTACGGTAA 241 A TGGCCCGCC T GGCTGACCG C CCAACGACC C CCGCCCATT G ACGTCAATA A TGACGTATG 301 T TCCCATAGT A ACGTCAATA G GGACTTTCC A TTGACGTCA A TGGGTGGAG T ATTTACGGT 361 A AACTGCCCA C TTGGCAGTA C ATCAAGTGT A TCATATGCC A AGTACGCCC C CTATTGACG 421 T CAATGACGG T AAATGGCCC G CCTGGCATT A TGCCCAGTA C ATGACCTTA T GGGACTTTC 481 C TACTTGGCA G TACATCTAC G TATTAGTCA T CGCTATTAC C 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pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺病毒载体的构建第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知,基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达⽔平较低,但是GH 可以诱导SOCS2稳定⾼表达。
SOCS2⾼表达的同时,GH诱导的脂肪细胞分化因⼦和脂质代谢基因表达发⽣了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响,需要通过⼀种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续⾼表达。
细胞导⼊外源基因是⽬前常⽤的⽅法,但是保证外源基因的⾼效表达需要合适的表达系统。
⽬前常⽤的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导⼊外源基因,但是质粒的转染效率很低,如何把⽬标基因导⼊靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把⽬标基因整合到靶细胞基因组永久表达,但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本⾝对脂肪细胞的感染率⼜⽐较低。
⽽腺病毒滴度⾼,适合外源基因⼤量表达,并且可插⼊较⼤的⽬的⽚段,对细胞类型限制较⼩,可感染⾮分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作⽐较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因,采⽤pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体,为SOCS2在脂肪细胞中⾼效表达,研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取⾃6周龄昆⽩⼩⿏,⼩⿏购⾃第四军医⼤;E.coli DH5α菌株由本实验室保存;pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒,E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌⾁发育实验室赠送;⼈胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中⼼。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋⽩Marker购⾃Fermentas公司;内切酶PmeI和PacI购⾃NEB公司;pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购⾃Takara公司;穿梭质粒⼩提试剂盒购⾃Omega公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒购⾃Bioflux公司;λ/Hin dIII Marker购⾃天根公司;OptiMem优化培养液购⾃Gibico公司;脂质体Lipofectamine TM 2000购⾃Invitrogen公司。
网1.PSI质粒图谱、多克隆酶切位点及质粒特点(摘自_w.stratagene.com)图2.腺病毒骨架质粒及其特点(摘自www.—st—ratagene,com)1.3试剂1.3.1实验试剂1.3.1.1Platinum高保真DNA聚合酶(5U/111):美国Invitrogen公司,共含IOOU酶,货号1313559。
1.3.1.2ExTaqDN^聚合酶(5U/ll1){日本Takara,共含250U聚合酶、Iml10xExTaqbuffer(峭plus)、800n12.5mMdNTPs混合液和Iml6xloadingbuffer,货号DRROOIA。
1.3.L3限制性内切酶SalI(20u/|I1):英国NEB公司,共含1000U内切酶,ImllOxTangobuffer,货号R0138V。
1.3.1.4限制性内切酶XhoI(20u/111):英国NEB公司,共含2500U内切酶。
lmllOxTangobuffer,货号R0146V。
1.3.1.5限制性内切酶PmeI(10U/111):英国NEB公司,共含250U内切酶、500Il110xNEBuffer4、500lll100XBSA,货号R0560V。
1.3.1.6限制性内切酶PacI(IOU/111):英国NEB公司,共含125U内切酶、结果表明序列正确。
如图4所示.M.-眦^MarkerDL2,000I:sTBRIIPCR产物M:^-HindmDNAMarkerl:TA_sTBRⅡ质粒(1号)2:TA_sTBRⅡ质粒(2号)Ml:^-Hind01DNAMarker1:.r_A_sT6RⅡ质粒(1号)的双酶切结果2:TA—sTBRⅡ质粒(2号)的双酶切结果啦:DNAMarkerDL2,000图4、sTBRII和T卜sTBRII质粒鉴定结果1.2测序结果显示插入片段为正确的人sTORⅡ序列。
测序结果如下I测序结果与Nucleotide中所提供的序列在DNAssist2.0软件上分析比对,结果正确。