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透析透析专用专用专用细菌内细菌内细菌内毒毒素检测鲎试剂盒使用说明书(凝胶法)【品名品名】】透析用水及透析液细菌内毒素检测鲎试剂盒【规格规格】】1样份/盒【用途用途】】用于透析用水或透析液细菌内毒素检测。
【原理原理】】该鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品, 鲎试剂中含有C因子、B 因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。
在适宜的条件下，细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。
【试剂盒组成试剂盒组成】】名称 规格/数量 用途 1 鲎试剂（TAL ） 0.5EU/ml ×8支 反应主剂 2 内毒素工作标准品（CSE ） 1EU/支×2支 阳性对照和供试品阳性对照 3 细菌内毒素检查用水（TRW ） 2ml ×3支 鲎试剂与内毒素溶解 4 辅液Ⅰ 0.7ml ×1支 样本稀释 5 采样瓶 10ml ×1支 透析用水或透析液采集 6 空安瓿 2ml ×1支 样本稀释 7 除热原吸头 200µl ×2包，1ml ×1包 移取样本及内毒素溶液 8 使用说明书 1份 操作说明 9 质检报告 1份 质检报告【需准备的材料和设备需准备的材料和设备】】除本试剂盒外需准备旋涡混合器、移液器、试管架、恒温水浴箱或恒温器（37±1℃）。
【用法用法】】1. 供试品溶液及对照制备1.1阴性对照溶液的制备即细菌内毒素检查用水（TRW ）。
1.2阳性对照溶液的制备一般为浓度为2λ的内毒素溶液（λ为鲎试剂的的标示灵敏度）。
例如：取效价为1EU/支的内毒素工作品（CSE ）１支，加入1.0ml 细菌内毒素检查用水（TRW ），在旋涡混合器震摇2-3min 得1.0EU/ml 内毒素阳性对照溶液。
1.3供试品溶液的制备用无热原采样瓶采集适量透析用水或透析液。
若样本的内毒素限值(L )为1.0EU/ml ，按鲎试剂的灵敏度λ及样本的内毒素限值L 计算供试品德最大有效稀释倍数(MVD )，M V D = L /λ当λ= 0.5 EU/ml ，L= 1.0EU/ml 时，M V D =2(倍),取样本0.7ml 于试剂盒配套辅液Ⅰ中，用旋涡混合器混匀1min 后，即为待测供试品溶液。
USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。
本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。
本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。
*1该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
检测时，可用其中任一种方法进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。
直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。
内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。
[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。
]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。
两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。
主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。
使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。
动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。
仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。
]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。
上图所示：鲎，最具特点的就是鲎的血是蓝色的。
鲎（hòu）亦称马蹄蟹。
肢口纲（Merostomata）剑尾目（Xiphosura）海生节肢动物，共4种，见于亚洲和北美东海岸。
虽又称马蹄蟹爬上灶、夫妻鱼、鸳鸯鱼，东方鲎等，但不是蟹，而与蝎、蜘蛛以及已绝灭的三叶虫有亲缘关系。
鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫（现在只有化石）一样古老的动物。
鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有“活化石”之称。
每当春夏季鲎的繁殖季节，雌雄一旦结为夫妻，便形影不离，肥大的雌鲎常驮着瘦小的丈夫蹒跚而行。
此时捉到一只鲎，提起来便是一对，故鲎享“海底鸳鸯”之美称。
鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。
这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。
科学家也使用鲎血研究癌症。
但是，对鲎抽血后，它们就被放生。
鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。
鲎试剂因能与细菌内毒素及β-葡聚糖反应形成凝胶而被广泛用于检测食品、水源、药品、医疗器械、动物体液等不同样品中的内毒素。
使用鲎试剂检测的试验称为鲎试验。
鲎是一种海洋节支动物，其血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。
当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。
检测内毒素血症的一种试验。
鲎系海边栖生的一种大型节肢动物,属蜘蛛纲。
其多功能血细胞(变形细胞)的溶解物中含有一种可凝性蛋白质,在极微量内毒素(0.0005vg/ml)存在时可形成凝胶。
鲎试剂干扰试验检查记录
1.0 干扰试验预试验
将内毒素检查阴性的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大稀释倍数不得超过MVD= C*L/λ0.03(0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度)。
使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。
每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照管（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度）。
另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。
2.0 干扰试验
检验人：检验日期：复核人：复核日期：。
动态显色法内毒素检测鲎试剂盒使用说明书：T7570：48T/盒1.7ml：阴凉处，最佳2-8ºC ，避光保存。
鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品, 鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。
在适宜的条件下(温度，pH 值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA ，λmax=405）。
反应液的吸光度(OD 值)增加, OD 值增加的速度与内毒素浓度成正相关。
换言之，OD 值上升某一预设限值(启动OD)所需要的时间(定义为启动时间)与内毒素浓度成负相关，启动时间的对数与内毒素浓度的对数成线性关系，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。
内毒素工作标准品、鲎试剂、显色基质、细菌内毒素检查用水、除热原试管、除热原吸头、除热原96孔微板（或可拆式板条）、旋涡混合器、移液器、试管架、带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪ELx808及软件TALgent 或Gen5。
① 该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。
② 接触试剂及供试品的所有器皿必须是除热原的。
试验过程应防止微生物的污染。
该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005 EU/ml 。
③ 供试品的pH 值应在6.0 – 8.0之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1M 氢氧化钠或0.1M 盐酸调节。
④ 当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验，参见【供试品的干扰试验】。
1、动态光度测定仪器的设定，以鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU 为例：预热仪器，设置温育温度为37ºC 。
设置模板及程序。
设定读板波长为405nm ，设定动力学参数：读板120分钟， 每30秒读一次。
2、内毒素标准溶液配制（浓度10，1，0.1，0.01EU/ml ）2.1、取内毒素工作标准品1支，用砂轮沿安瓿颈部划痕，开启，加入适量（建议在0.5 ml - 1.2ml 之间）细菌内毒素检查用水，置旋涡混合器上剧烈振摇5分钟。
光度法鲎试剂
光度法鲎试剂是一种用于测定蛋白质浓度的试剂，其原理是利用鲎蛋白与试剂中的染料结合产生吸收峰的变化来测定蛋白质的浓度。
该试剂具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
光度法鲎试剂的原理是基于鲎蛋白与试剂中的染料结合产生吸收峰的变化来测定蛋白质的浓度。
鲎蛋白是一种具有高度稳定性和可重复性的蛋白质，其与试剂中的染料结合后会产生吸收峰的变化，这种变化与蛋白质的浓度成正比。
因此，通过测定吸收峰的变化，可以计算出样品中蛋白质的浓度。
光度法鲎试剂的操作非常简单，只需要将试剂与待测样品混合后，通过分光光度计测定吸收峰的变化即可。
该试剂具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
在实际应用中，光度法鲎试剂可以用于测定多种类型的蛋白质，包括纯化的蛋白质、细胞裂解液中的蛋白质、血清中的蛋白质等。
同时，该试剂还可以用于测定蛋白质的相对分子质量、酶的活性等指标。
总之，光度法鲎试剂是一种非常实用的蛋白质浓度测定试剂，具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，在生物化学、分子生物学等领域得到了广泛应用。
1.试剂和样品鲎试剂（生产厂家：湛江安度斯生物有限公司，批号：1112202，灵敏度：0.125EU/ml，规格：0.1 ml/支）细菌内毒素检查用水（生产厂家：湛江安度斯生物有限公司，批号：1106130，规格：5 ml/支）细菌内毒素工作标准品（P=160EU/支，生产厂家：中国药品生物制品检定所批号：150601-201174）细菌内毒素国家标准品（10000 EU/支，生产厂家：中国药品生物制品检定所批号：150600-200707）2.操作步骤2.1细菌内毒素国家标准品稀释、细毒内毒素工作标准品稀释将细菌内毒素国家标准品用1ml细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合仪上混合15分钟，然后制备成4个浓度的标准内毒素溶液，即0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.0625 EU/ml和0.03 EU/ml备用，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。
具体稀释步骤如下：100008.12.0108.12.015.15.00.25110.125110.0625110.03待复核的细菌内毒素工作标准品标示效价为160 EU，用1ml细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合仪上混合15分钟，然后制备成4个浓度的内毒素溶液，即640倍（0.25 EU/ml）、1280倍（0.125 EU/ml）、2560倍（0.0625 EU/ml）和5120倍（0.03 EU/ml）备用，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。
具体稀释步骤如下：1608.12.0165.05.084.12.015.15.00.25110.125110.0625110.03以上细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品需同时进行。
2.2加样取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，70%异丙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡将准备好的鲎试剂取其中18（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管），4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。
显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)货号：T7571保存：阴凉处，最佳2-8℃，避光贮存。
产品内容：细菌内毒素工作品，5支鲎试剂， 1.7ml/支，5支显色基质，1.7ml/支，5支偶氮化试剂1，10ml/支，5支偶氮化试剂2，10ml/支，5支偶氮化试剂3，10ml/支，5支HCl(反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，3瓶用途：显色基质鲎试剂(Chromogenic End-point TachypleusAmebocyte Lysate，CE TAL)用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。
原理：鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。
在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。
在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。
同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax=545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。
检测限：按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1EU/ml和0.01EU/ml-0.1EU/ml两个区间(反应时间T1和T2见出厂检验报告)。
用法：1.材料和设备1.1试剂鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1、偶氮化试剂2、偶氮化试剂3、HC l(反应终止剂)、细菌内毒素检查用水。
1.2器材无热原试管、无热原吸头、旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架、恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。
注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。
玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。
鲎试剂干扰试验检查记录
1.0 干扰试验预试验
将内毒素检查阴性的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大稀释倍数不得超过MVD= C*L/λ0.03(0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度)。
使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。
每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照管（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度）。
另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。
2.0 干扰试验
检验人：检验日期：复核人：复核日期：。
鲎试剂标准
本品为鲎科动物东方鲎（Tachyplecus tridentatus）的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品。
本品含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme），凝固蛋白原（Coagulagen）其灵敏度以细菌内毒标准品或工作标准品测定，应为标示量的50％－200％。
（一）性状本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水生生理盐水中易溶。
（二）鉴别
1．取本品按装量加水溶解后，加茚三酮试液《中国药典1990年版》（二部附录162页）0.25ml，加热煮沸1－2分钟，显蓝色紫色。
2．取本品按装量加水溶解后，再加水适当稀释，照分光光度法《中国药典1990年版》（二部附录24页）测定，在270±1nm的波长处有单一吸收峰。
3．取本品按装量加入内毒检查用水溶解后，吸取0.1ml加入0.1ml细菌内毒素工作标准品或标准品50EU，混匀后，于37℃水浴中放置1小时，有凝胶形成。
（三）检查干燥失重：取本品约0.1在g ，在66℃减压干燥至恒得，减失重量不得过5％（中国药典1990年版二部附录55页）。
自身凝集：取本品4支，按装量加入配带的鲎试剂溶剂，溶解后，分别从每支取0.1ml，再分别加入配带的鲎试剂溶剂0.1ml，混匀后，于37±1℃水浴中放置4小时，不得形成凝胶，若有2管以上形成凝胶，判为不合格；若仅有1管形成凝胶，照同样方法，另取8支重复检查，8支均不得形成凝胶。
缓冲能力：任意取5％、10％葡萄糖注射液，氯化钠注射液无菌注射用水或注射用水适量，加稀盐酸调节pH使供试品溶液pH值为2.90-3.00，取此溶液适量与等量鲎试剂溶解液混匀，重复测定，pH值应为6.00-8.00。
（四）灵敏度测定预测：
1．取细菌内毒素工作标准品1支，按说明溶解燕稀稀释成1→8等比系列稀释液。
2．取同一批鲎试剂若干支，分别按标示量加入配带的试剂溶剂制成鲎试剂溶液。
取10×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶液，加入内毒素稀释液0.1 ml ，每一稀释液最少作2管，同时作2管阴性对照。
轻轻振动上述试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃水浴中。
保温60±2分钟观察结果，确定本批鲎试剂灵敏范围，2管阴性对照不得出现阳性结果。
测定：根据预测得到的灵敏范围，将细菌内毒素工作标准品以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个边疆稀释液，每一稀释液作4管，且其最高浓度的4管应均为阳性最低溶液的4管应均为阴性，同上述操作，记录反应结果，计算标准差（s）（计算公式略）
X为4组反应终点的数对值,n为4
当s＜0.365时，按下式计算本批鲎试剂灵敏度（λ）
（计算公式略）
当s＜0.365时测定无效，应检查出现差异原因，并重新测定。
（五）用途用于细菌内毒素检查。
（六）规格（1）0.1ml；（2）0.5ml。
（七）贮藏遮光，在冷处保存。
有效期暂定1年。
*系指其内毒素含量不超过0.006EU/ml的注射用水。
发布时间：2005-8-30
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