鲎试剂实验方法

一、实验目的1. 了解鲎试验的原理和方法。

2. 掌握鲎试验在微生物检测中的应用。

3. 提高微生物学实验技能。

二、实验原理鲎试验是一种检测微生物内毒素的试验方法。

鲎血中含有一种特殊的凝固蛋白，当鲎血接触到细菌内毒素时，凝固蛋白会立即凝固，从而产生凝胶。

根据凝胶形成的时间，可以判断样品中内毒素的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲎试剂- 标准菌液- 待测样品- 生理盐水- 移液器- 培养皿- 灭菌棉签- 酒精灯- 镊子2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 移液管- 培养皿- 镊子四、实验步骤1. 准备工作：- 将鲎试剂置于37℃恒温水浴箱中预热。

- 将待测样品和标准菌液分别用生理盐水进行稀释。

2. 制备样品：- 取适量鲎试剂加入培养皿中，加入适量的生理盐水，混匀。

- 分别加入标准菌液和待测样品，混匀。

3. 观察结果：- 将培养皿置于37℃恒温水浴箱中，观察凝胶形成的时间。

- 记录标准菌液和待测样品的凝胶形成时间。

4. 结果分析：- 根据凝胶形成的时间，判断样品中内毒素的含量。

五、实验结果与分析1. 标准菌液凝胶形成时间为5分钟，说明标准菌液内毒素含量较高。

2. 待测样品凝胶形成时间为8分钟，说明待测样品内毒素含量较高。

3. 根据凝胶形成的时间，判断待测样品内毒素含量为中等。

六、实验讨论1. 鲎试验是一种简单、快速、灵敏的检测微生物内毒素的方法。

2. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染。

3. 实验结果与实际情况可能存在一定的误差，需结合其他实验方法进行综合判断。

七、实验总结通过本次实验，我们了解了鲎试验的原理和方法，掌握了鲎试验在微生物检测中的应用，提高了微生物学实验技能。

在实验过程中，我们应注意操作规范，保证实验结果的准确性。

同时，我们应不断总结经验，提高实验技能，为微生物学领域的研究贡献力量。

USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。

本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。

本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。

*1该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。

检测时，可用其中任一种方法进行试验。

当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。

直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。

内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。

[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。

]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。

两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。

主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。

使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。

动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。

仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。

*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。

若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。

[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。

]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。

鲎试剂灵敏度复核试验
一.试验目的
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

二.试验步骤
1.根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）,将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。

2.取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。

3.将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。

三.结果分析
1.将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。

2.若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。

计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc），计算方法见中国药典。

3.反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性
结果的浓度。

4.当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

四.注意事项
1.保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

2.安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。

鲎试剂凝胶法流程及其步骤详细介绍，实验操作指南The agarose gel electrophoresis method is commonly used for the separation and analysis of DNA fragments. Here is a step-by-step procedure for the agarose gel electrophoresis using a Haematoxylin reagent:1. Prepare the gel: Mix agarose powder with a buffer solution, such as TAE or TBE, and heat it until the agarose is completely dissolved. Pour the mixture into a gel tray and insert a comb to create wells for sample loading. Allow the gel to solidify.2. Prepare the samples: Mix the DNA samples with a loading dye, which helps in visualization and tracking during electrophoresis. Heat the samples briefly to denature the DNA strands.3. Load the samples: Carefully load the DNA samples into the wells of the gel using a micropipette, taking care not to introduce air bubbles.4. Run the gel: Place the gel tray into an electrophoresis chamber filled with buffer solution. Connect the electrodes to the power supply and run the gel at a constant voltage. The DNA fragmentswill migrate through the gel matrix based on their size, with smaller fragments moving faster.5. Stain the gel: After electrophoresis, remove the gel from the tray and immerse it in a Haematoxylin reagent solution. Gently agitate the gel for staining and allow it to sit for a few minutes.6. Destain the gel: Transfer the stained gel to a destaining solution, such as distilled water or a destaining buffer, and gently agitate it to remove excess stain. This step helps in visualizing the DNA bands.7. Visualization: Place the gel on a UV transilluminator and observe the DNA bands under UV light. Photograph or document the gel for further analysis and interpretation.中文回答：琼脂糖凝胶电泳方法是常用于DNA片段的分离和分析的技术。

[精华]鲎试剂试验方法鲎试剂实验方法鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。

凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。

此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。

凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。

使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。

厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。

使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。

特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。

目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。

因此不列为独立品种。

动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。

这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。

根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。

终点浊度法未见商品化产品。

动态浊度法(又称动态比浊法)是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

动态浊度法的特点为:1. 能准确定量。

2.检测范围宽，可达4个数量级。

3.灵敏度高达0.005EU/ml。

4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。

5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。

6. 和微生物检测系统Elx808(配套IU)及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。

显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)【用途】显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。

【原理】鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。

在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。

同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。

【检测限】按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml两个区间( 反应时间T 1 和T 2 见出厂检验报告) 。

【试剂盒组成】细菌内毒素工作品，2支鲎试剂， 1.7ml/支，2支显色基质，1.7ml/支，2支偶氮化试剂1，10ml/支，2支偶氮化试剂2，10ml/支，2支偶氮化试剂3，10ml/支，2支HCl (反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，2瓶【贮存】阴凉处, 最佳2-8℃,避光贮存。

【用法】1 .材料和设备1.1 试剂鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。

1.2器材旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。

恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。

注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。

一、实验目的1. 了解鲎试验法的基本原理和操作步骤。

2. 学会使用鲎试验法检测细菌内毒素。

3. 掌握细菌内毒素对生物体的危害及预防措施。

二、实验原理鲎试验法是一种检测细菌内毒素的方法，其原理是鲎血液中的凝固酶在细菌内毒素的作用下，会发生凝固反应。

通过观察鲎血液凝固的情况，可以判断样品中是否含有细菌内毒素。

三、实验材料1. 鲎血液试剂2. 细菌内毒素标准品3. 待测样品4. 实验器材：移液器、试管、恒温水浴锅、计时器等四、实验步骤1. 准备工作（1）将鲎血液试剂置于37℃恒温水浴锅中预热10分钟。

（2）取试管若干，标记为A、B、C、D，分别加入鲎血液试剂。

2. 标准曲线绘制（1）取标准品，按照说明书要求，用生理盐水进行稀释，得到一系列浓度梯度的标准品溶液。

（2）取试管A，加入鲎血液试剂1ml，再加入标准品溶液0.1ml，混匀。

（3）按照相同方法，分别向试管B、C、D中加入不同浓度的标准品溶液，混匀。

（4）将试管置于37℃恒温水浴锅中孵育30分钟。

（5）观察各试管凝固情况，记录凝固时间。

3. 待测样品检测（1）取试管E，加入鲎血液试剂1ml，再加入待测样品0.1ml，混匀。

（2）将试管E置于37℃恒温水浴锅中孵育30分钟。

（3）观察试管E凝固情况，记录凝固时间。

4. 结果分析（1）以标准品浓度为横坐标，凝固时间为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）根据待测样品的凝固时间，从标准曲线上查得对应的细菌内毒素浓度。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：通过绘制标准曲线，可以得到标准品浓度与凝固时间之间的关系，为待测样品的检测提供依据。

2. 待测样品检测：根据待测样品的凝固时间，从标准曲线上查得细菌内毒素浓度为5EU/ml。

六、实验结论本实验采用鲎试验法成功检测出待测样品中的细菌内毒素，浓度为5EU/ml。

结果表明，鲎试验法是一种简单、快速、灵敏的细菌内毒素检测方法，适用于临床和科研领域。

七、实验讨论1. 鲎试验法具有操作简便、快速、灵敏等优点，是一种理想的细菌内毒素检测方法。

1目的建立细菌内毒素预试验操作规程，以指导检验人员的正确规范操作，为保证细菌内毒素检查凝胶法的准确性提供依据。

2适用范围适用于细菌内毒素检查法的“鲎试剂灵敏度复核试验”和“干扰试验”。

本规程参照《中国药典》2020年版四部-1143细菌内毒素检查法制定。

3职责进行细菌内毒素检查的操作人员严格按本规程进行操作。

4内容4.1基本原理4.1.1本法采用凝胶法，系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。

4.1.2鲎试剂灵敏度复核试验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

4.1.3干扰试验：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项目的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

4.1.4本试验操作过程应防止内毒素的污染。

4.1.5EU：内毒素单位，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。

4.1.6λ：鲎试剂的标示灵敏度，单位：EU/ml。

4.1.7MVD：最大有效稀释倍数，指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数。

4.2材料准备4.2.1细菌内毒素工作标准品：应经细菌内毒素国家标准品为基准标定效价；4.2.2鲎试剂：当使用新批号前，按《细菌内毒素预试验SOP》进行灵敏度检查；4.2.3细菌内毒素检查用水（BET水）：内毒素含量应＜0.015EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用；4.2.4供试品溶液：pH宜在6.0~8.0范围内，否则用已去除内毒素和干扰因子的酸、碱溶液或缓冲液调节。

4.3器具准备4.3.1移液枪、一次性除热源枪头（1000μL、200μL）；4.3.2剪刀、砂轮片、试管架、除热源试管、医用胶布；4.3.3恒温培养箱（37℃±1℃）、旋涡混合器、洁净工作台。

4.4鲎试剂灵敏度复核试验4.4.1试验过程：4.4.1.1根据当批鲎试剂的标示灵敏度（λ），把细菌内毒素工作标准品用适量BET水充分溶解，避免产生气泡，在旋涡混合器上混匀15分钟。

一、实验目的1. 了解鲎实验的基本原理和方法；2. 掌握鲎实验的操作步骤；3. 学会观察和分析实验结果；4. 培养实验操作技能和实验报告撰写能力。

二、实验原理鲎实验是一种检测细菌内毒素的方法。

鲎是一种生活在海洋中的生物，其血液中含有一种特殊的凝固蛋白，当与细菌内毒素接触时，会迅速凝固。

通过观察鲎血液凝固的时间，可以判断细菌内毒素的存在和含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：鲎血液、细菌内毒素标准品、生理盐水、注射器、试管等；2. 实验仪器：恒温箱、显微镜、计时器等。

四、实验步骤1. 准备工作：将鲎血液和细菌内毒素标准品分别放入无菌试管中，加入适量生理盐水稀释；2. 设置实验组：将稀释后的鲎血液和细菌内毒素标准品分别加入两个无菌试管中，分别标记为实验组和对照组；3. 设置对照组：将稀释后的鲎血液和生理盐水分别加入两个无菌试管中，分别标记为实验组和对照组；4. 加入细菌内毒素：在实验组和对照组的试管中分别加入适量的细菌内毒素；5. 混匀：用无菌棉签轻轻搅拌试管中的混合液，使细菌内毒素充分溶解；6. 观察和记录：将实验组和对照组的试管放入恒温箱中，观察鲎血液凝固的时间，并记录实验结果；7. 结果分析：根据实验结果，判断细菌内毒素的存在和含量。

五、实验结果与分析1. 实验结果：实验组中，鲎血液在加入细菌内毒素后迅速凝固，对照组中，鲎血液在加入生理盐水后无明显变化；2. 结果分析：实验结果表明，细菌内毒素能引起鲎血液凝固，从而判断细菌内毒素的存在。

根据实验结果，可以推算出细菌内毒素的含量。

六、实验总结1. 鲎实验是一种检测细菌内毒素的有效方法，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点；2. 在实验过程中，应注意无菌操作，避免污染；3. 通过本次实验，掌握了鲎实验的操作步骤，提高了实验操作技能和实验报告撰写能力。

七、注意事项1. 实验过程中，应严格遵守无菌操作原则，避免污染；2. 实验操作时应保持冷静，避免慌乱；3. 实验结果分析时，应结合理论知识，准确判断细菌内毒素的存在和含量；4. 实验报告撰写时，应清晰、简洁、有条理地表达实验过程和结果。