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细菌内毒素试验（鲎试验）的全面解析一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。
产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。
如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。
另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。
细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
和热原的关系热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。
细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。
来源和控制方法1、细菌内毒素的特性2、去除细菌内毒素的方法(1)吸附法此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。
常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的0.1%-0.5% ，将溶液加热到70℃左右保温一定时间效果更好。
使用的活性炭应符合药典规定要求。
(2)蒸馏法此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。
因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。
(3)热破坏法此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。
因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用180℃干烤3小时，或250℃干烤30min以上。
(4)强酸强碱处理法此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。
(5)其他，也可以采用过滤等方法去除热原。
透析透析专用专用专用细菌内细菌内细菌内毒毒素检测鲎试剂盒使用说明书(凝胶法)【品名品名】】透析用水及透析液细菌内毒素检测鲎试剂盒【规格规格】】1样份/盒【用途用途】】用于透析用水或透析液细菌内毒素检测。
【原理原理】】该鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品, 鲎试剂中含有C因子、B 因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。
在适宜的条件下，细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。
【试剂盒组成试剂盒组成】】名称 规格/数量 用途 1 鲎试剂（TAL ） 0.5EU/ml ×8支 反应主剂 2 内毒素工作标准品（CSE ） 1EU/支×2支 阳性对照和供试品阳性对照 3 细菌内毒素检查用水（TRW ） 2ml ×3支 鲎试剂与内毒素溶解 4 辅液Ⅰ 0.7ml ×1支 样本稀释 5 采样瓶 10ml ×1支 透析用水或透析液采集 6 空安瓿 2ml ×1支 样本稀释 7 除热原吸头 200µl ×2包，1ml ×1包 移取样本及内毒素溶液 8 使用说明书 1份 操作说明 9 质检报告 1份 质检报告【需准备的材料和设备需准备的材料和设备】】除本试剂盒外需准备旋涡混合器、移液器、试管架、恒温水浴箱或恒温器（37±1℃）。
【用法用法】】1. 供试品溶液及对照制备1.1阴性对照溶液的制备即细菌内毒素检查用水（TRW ）。
1.2阳性对照溶液的制备一般为浓度为2λ的内毒素溶液（λ为鲎试剂的的标示灵敏度）。
例如：取效价为1EU/支的内毒素工作品（CSE ）１支，加入1.0ml 细菌内毒素检查用水（TRW ），在旋涡混合器震摇2-3min 得1.0EU/ml 内毒素阳性对照溶液。
1.3供试品溶液的制备用无热原采样瓶采集适量透析用水或透析液。
若样本的内毒素限值(L )为1.0EU/ml ，按鲎试剂的灵敏度λ及样本的内毒素限值L 计算供试品德最大有效稀释倍数(MVD )，M V D = L /λ当λ= 0.5 EU/ml ，L= 1.0EU/ml 时，M V D =2(倍),取样本0.7ml 于试剂盒配套辅液Ⅰ中，用旋涡混合器混匀1min 后，即为待测供试品溶液。
一、实验目的1. 了解鲎试验的原理和方法。
2. 掌握鲎试验在微生物检测中的应用。
3. 提高微生物学实验技能。
二、实验原理鲎试验是一种检测微生物内毒素的试验方法。
鲎血中含有一种特殊的凝固蛋白，当鲎血接触到细菌内毒素时，凝固蛋白会立即凝固，从而产生凝胶。
根据凝胶形成的时间，可以判断样品中内毒素的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲎试剂- 标准菌液- 待测样品- 生理盐水- 移液器- 培养皿- 灭菌棉签- 酒精灯- 镊子2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 移液管- 培养皿- 镊子四、实验步骤1. 准备工作：- 将鲎试剂置于37℃恒温水浴箱中预热。
- 将待测样品和标准菌液分别用生理盐水进行稀释。
2. 制备样品：- 取适量鲎试剂加入培养皿中，加入适量的生理盐水，混匀。
- 分别加入标准菌液和待测样品，混匀。
3. 观察结果：- 将培养皿置于37℃恒温水浴箱中，观察凝胶形成的时间。
- 记录标准菌液和待测样品的凝胶形成时间。
4. 结果分析：- 根据凝胶形成的时间，判断样品中内毒素的含量。
五、实验结果与分析1. 标准菌液凝胶形成时间为5分钟，说明标准菌液内毒素含量较高。
2. 待测样品凝胶形成时间为8分钟，说明待测样品内毒素含量较高。
3. 根据凝胶形成的时间，判断待测样品内毒素含量为中等。
六、实验讨论1. 鲎试验是一种简单、快速、灵敏的检测微生物内毒素的方法。
2. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染。
3. 实验结果与实际情况可能存在一定的误差，需结合其他实验方法进行综合判断。
七、实验总结通过本次实验，我们了解了鲎试验的原理和方法，掌握了鲎试验在微生物检测中的应用，提高了微生物学实验技能。
在实验过程中，我们应注意操作规范，保证实验结果的准确性。
同时，我们应不断总结经验，提高实验技能，为微生物学领域的研究贡献力量。
鲎内毒素内毒素（（endotoxin ）酶联免疫酶联免疫分析分析试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围检测范围：： 96T0.03Eu/L – 0.8Eu/L使用目的使用目的：：本试剂盒用于测定鲎血清、血浆及相关液体样本中内毒素（endotoxin ）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鲎内毒素（endotoxin ）水平。
用纯化的鲎内毒素（endotoxin ）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内毒素（endotoxin ），再与HRP 标记的内毒素（endotoxin ）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的内毒素（endotoxin ）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中鲎内毒素（endotoxin ）浓度。
试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（1.6Eu/L ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6显色剂B 液6ml ×1/瓶12密封袋1个标本标本要求要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。
操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
鲎试剂凝胶法流程及其步骤详细介绍，实验操作指南The agarose gel electrophoresis method is commonly used for the separation and analysis of DNA fragments. Here is a step-by-step procedure for the agarose gel electrophoresis using a Haematoxylin reagent:1. Prepare the gel: Mix agarose powder with a buffer solution, such as TAE or TBE, and heat it until the agarose is completely dissolved. Pour the mixture into a gel tray and insert a comb to create wells for sample loading. Allow the gel to solidify.2. Prepare the samples: Mix the DNA samples with a loading dye, which helps in visualization and tracking during electrophoresis. Heat the samples briefly to denature the DNA strands.3. Load the samples: Carefully load the DNA samples into the wells of the gel using a micropipette, taking care not to introduce air bubbles.4. Run the gel: Place the gel tray into an electrophoresis chamber filled with buffer solution. Connect the electrodes to the power supply and run the gel at a constant voltage. The DNA fragmentswill migrate through the gel matrix based on their size, with smaller fragments moving faster.5. Stain the gel: After electrophoresis, remove the gel from the tray and immerse it in a Haematoxylin reagent solution. Gently agitate the gel for staining and allow it to sit for a few minutes.6. Destain the gel: Transfer the stained gel to a destaining solution, such as distilled water or a destaining buffer, and gently agitate it to remove excess stain. This step helps in visualizing the DNA bands.7. Visualization: Place the gel on a UV transilluminator and observe the DNA bands under UV light. Photograph or document the gel for further analysis and interpretation.中文回答：琼脂糖凝胶电泳方法是常用于DNA片段的分离和分析的技术。
动态显色法内毒素检测鲎试剂盒使用说明书货号：T7570规格：48T/盒1.7ml保存：阴凉处，最佳2-8ºC，避光保存。
产品说明：鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。
在适宜的条件下(温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405）。
反应液的吸光度(OD值)增加,OD值增加的速度与内毒素浓度成正相关。
换言之，OD值上升某一预设限值(启动OD)所需要的时间(定义为启动时间)与内毒素浓度成负相关，启动时间的对数与内毒素浓度的对数成线性关系，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。
试验所需材料和器材：内毒素工作标准品、鲎试剂、显色基质、细菌内毒素检查用水、除热原试管、除热原吸头、除热原96孔微板（或可拆式板条）、旋涡混合器、移液器、试管架、带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪ELx808及软件TALgent或Gen5。
注意事项：①该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。
②接触试剂及供试品的所有器皿必须是除热原的。
试验过程应防止微生物的污染。
该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005EU/ml。
③供试品的pH值应在6.0–8.0之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1M氢氧化钠或0.1M盐酸调节。
④当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验，参见【供试品的干扰试验】。
操作步骤：1、动态光度测定仪器的设定，以鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU为例：预热仪器，设置温育温度为37ºC。
设置模板及程序。
设定读板波长为405nm，设定动力学参数：读板120分钟，每30秒读一次。
2、内毒素标准溶液配制（浓度10，1，0.1，0.01EU/ml）2.1、取内毒素工作标准品1支，用砂轮沿安瓿颈部划痕，开启，加入适量（建议在0.5ml-1.2ml之间）细菌内毒素检查用水，置旋涡混合器上剧烈振摇5分钟。
内毒素检测试管定量显色基质法缩写鲎试验试剂盒(试管定量显色基质法)是利用人工合成的显色基质与鲎试剂发生显色反应，定量检测内毒素。
反应时间短至16分钟，满足快速检测的需要。
该显色基质鲎试剂不依赖凝血蛋白形成凝胶，抗干扰能力强。
配用偶氮染料灵敏度高，可避免有色样品的颜色对鲎试验的干扰。
在水浴锅中孵育，检测结果可用分光光度计或普通酶标仪读取。
它可以应用于背景颜色为浅黄色的样品，如血浆和血清样品。
配套鲎试验微生物快速检测系统ELx808IULALXH可实现鲎试验微量化，自动化及标准化。
一、标准曲线做不好？是何原因？每试剂盒可做两条标曲，分别为0.1--1.0EU/ml或者0.01--0.1EU/ml；现在以0.1--1.0EU/ml为例：相应内毒素吸光度值分别是0.1、0.25、0.5、1.0EU/ml左右；①仔细阅读说明书（特别是内毒素标准品说明书，如是血液样品，外加一份样本处理液说明书），确保操作步骤无误！②内毒素是否有充分振摇？纯手摇几下或者摇床摇匀效果均不佳，内毒素摇匀要用漩涡振荡器震荡。
③鲎试剂是否剧烈振摇？鲎试剂要在**钟内用完，所以先配置好内毒素工作标准品和样品，再溶解鲎试剂，鲎试剂榕溶解后轻轻混匀静置20秒。
④温育时间与温育温度是否有保证？培养箱温育效果不好，选择水浴。
控制温育时间就要求加快加样速度且避免污染（温育时，整个试管上盖上铝箔纸即可，无需封口膜封口以节约时间）二、样本如何检测？样本初次检测需要做预实验确定样本浓度范围，建议先做0.1-1.0EU/ml标准曲线来确定样本浓度，如果测出样本超过标曲上限则选择稀释样本，若超过样本下限，则选择另一条标曲即0.01--0.1EU/ml进行检测。
确定选用标准曲线后样本还需要做干扰实验验证实验的可靠性，详见说明书或中国药典。
三、血样选择什么试剂盒？血浆样本一般为含氮化试剂的鲎变形细胞溶解物试剂盒(试管法)，抗干扰能力强。
提醒客户在进行实验前用样品处理溶液进行处理。
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》凝胶法鲎试剂使用说明书【名称】通用名：鲎试剂英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate （简称TAL）汉语拼音：hou shi ji本品主要成份为B因子、C因子、凝固酶原、凝固蛋白原。
【用途】专用于细菌内毒素检查。
【性状】本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水和生理盐水中易溶。
【原理】本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。
【用法】1．材料和设备1.1选择所需的规格及灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素工作品及细菌内毒素检查用水。
1.2准备若干支10ⅹ75mm玻璃反应试管（若使用0.1ml规格的鲎试剂无需准备此试管）、各种规格吸管或移液器或注射器、稀释内毒素用玻璃管、反应试管架、计时器、旋涡混合仪、恒温水浴箱（37±1℃）。
2．实验操作2.1 稀释细菌内毒素工作品：取内毒素工作品（冻干品）1支，按细菌内毒素工作品使用说明书进行操作。
2.2 TAL试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于TAL试剂中，轻轻振摇至少30S至试剂完全溶解。
注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在短时间内使用（即配即用）。
2.3 检查操作2.3.1 取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10×75mm试管或复溶后的0.1ml /支规格的鲎试剂原安瓿8支，其中2支作供试品管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。
2.3.2 每支供试品管加入0.1ml供试品；阴性对照管加入0.1ml检查用水；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ内毒素的供试品。
2.3.3 封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟，然后取出观察结果。
试管在孵育期间应避免任何的振动。
大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
1使用目的：本试剂盒用于饲料、鱼、虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉），药物、血清和尿样中大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）残留的定量检测。
2实验原理本试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）偶联抗原，加入大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）标准品或样品，游离大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）与微孔条上预包被的大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）偶联抗原互相竞争抗大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）抗体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）含量成反比，通过标准曲线计算样品中大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）的含量。
3试剂盒组成3.1预包被的大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。
3.2大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0ug/ml, 0.1ug/ml,0.3ug/ml,0.9ug/ml,2.7ug/ml,8.1ug/ml3.3抗大肠杆菌菌体蛋白残留量（E.coli DH-5α）抗体酶结合物：1瓶（6ml）。
3.4显色液A：1瓶（6ml）。
3.5显色液B：1瓶（6ml）。
3.6终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7样本稀释液：1瓶（10×,6ml），用于样品稀释用。
3.8浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9说明书一份。
4需要而未提供的材料4.1设备4.1.1波长450nm酶标仪。
显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)
【用途】显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。
【原理】鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。
在适宜的条件下（温
度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，
激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为
多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。
在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。
同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。
【检测限】按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml两个区间( 反应时间T 1 和T 2 见出厂检验报告) 。
【试剂盒组成】
细菌内毒素工作品，2支
鲎试剂， 1.7ml/支，2支
显色基质，1.7ml/支，2支
偶氮化试剂1，10ml/支，2支
偶氮化试剂2，10ml/支，2支
偶氮化试剂3，10ml/支，2支
HCl (反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶
细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，2瓶
【贮存】阴凉处, 最佳2-8℃,避光贮存。
【用法】
1 .材料和设备
1.1 试剂
鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。
1.2器材
旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。
恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。
注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。
玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。
2. 供试品的贮存与预处理
备注：若供试品为血液类，请参照配套血液相关处理试剂使用说明书。
2.1供试品的pH值应在6 - 8之间，若超出此范围，需用无热原缓冲液、0.1N氢氧化钠或0.1N
盐酸调节。
2.2若供试品中可能存在鲎实验的干扰物质，处理参见【供试品的干扰试验】。
2.3若供试品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖会产生G因子旁路反应，干扰内毒素检测），
需选用特异性鲎试剂（我公司提供）。
2.4若供试品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应而干扰
偶氮化显色，需要选用不含偶氮化试剂的试剂盒（我公司提供）。
2.5若供试品的本底吸光度值大于0.5,必须对供试品进行稀释后再检测。
2.6若供试品颜色较深(例如溶血)，或在酸性条件下颜色加深(例如一些组织培养介质),必须
设置供试品空白管以扣除供试品自身的颜色本底。
供试品空白管不加入鲎试剂，以等体积鲎试剂的溶剂(该处为细菌内毒素检查用水)代替。
其余操作同供试品管。
3.实验操作
3.1细菌内毒素标准溶液配制
标准曲线所采用的内毒素浓度可以为0.01, 0.025, 0.05, 0.1 EU/ml或0.1, 0.25, 0.5,1.0 EU/ml。
稀释方法如下（以0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/ml为例）：取细菌内毒素工作品1支，按细菌内毒素工作品使用说明书稀释为10EU/ml 的内毒素溶液，再稀释为1.0EU/ml的内毒素溶液，以1.0EU/ml的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.1,0.25, 0.5, 1.0 EU/ml的浓度梯度。
配制好的内毒素标准溶液应在4小时内用完。
表1 内毒素标准溶液配制
内毒素浓度(EU/ml) 1 0.5 0.25 0.1
加细菌内毒素检查用水
0 0.5 0.75 0.9
(ml)
加1EU/ml内毒素溶液(ml) 1 0.5 0.25 0.1
鲎试剂：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解,
注意不要用旋涡混匀仪激烈振摇。
溶解的鲎试剂应在10分钟内用完。
显色基质：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻振摇使显色基质
完全溶解。
显色基质溶液可在无污染的条件下于4 ºC贮存8小时以内。
偶氮化试剂1：按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1中，
偶氮化试剂2：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2中，
偶氮化试剂3：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3中，
偶氮化试剂溶液可于4ºC贮存1周。
3.4实验操作
取无热原试管，加入100ml细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。
再加入100ml鲎试剂溶液，混匀，37ºC温育T1分钟。
温育结束，加入100ml显色基质溶液，混匀，37ºC温育T2分钟。
温育结束，加入500ml偶氮化试剂1溶液，混匀，
加入500ml偶氮化试剂2溶液，混匀
加入500ml偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm波长处读取吸光度
值。
(见表２)
表 2 实验操作
阴性对照内毒素标
供试品
准
加细菌内毒素检查用水( l) 100
加内毒素标准溶液(μl) 100
加供试品(μl) 100
加鲎试剂(μl) 100 100 100
混匀，37ºC温育T1 分钟
加显色基质溶液(μl) 100 100 100
混匀，37ºC温育T2 分钟
加偶氮化试剂1溶液(μl) 500 500 500
4.数据处理
建立标准曲线：Y = b X + a，其中
Y为545nm处吸光度值，X为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。
当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：
1.标准曲线的相关系数r≥0.980，
2.标准曲线最低点的Y值大于阴性对照的Y值，
3.供试品平行管的平均值在标准曲线的区间内。
【供试品的干扰试验】
供试品的干扰试验详见《中华人民共和国药典》2005版中《细菌内毒素检查法》的“光度测定法干扰试验”。
当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验
环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须进行干扰试验,步骤如下:
1 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰
试验中添加的内毒素浓度，配制含λm内毒素的供试品阳性对照，测量出该溶液的内毒素浓度,称为Cs；
2 测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度,称为Ct；
3 计算该试验条件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100%
4 当R在50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
5 当R在50%～200%之外，需对供试品进行系列稀释(稀释倍数不得超过最大有效
稀释倍数MVD)或进行其它处理消除干扰,每一稀释溶液都重复步骤1-3,直到内毒素的回收率R在50%～200%之间。
选择回收率R最接近100%的稀释倍数进行内毒素检测。
