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2.6.14 细菌内毒素本法利用鲎试剂（从鲎——Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus——血细胞提取物（amoebocyte lysate）制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量。
该检查包括三种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；第二种为浊度法（基于内源性底物断裂后，产生的浊度变化）；最后一种为显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
这一章阐述了下面6种方法：方法A：凝胶法：限度试验方法B：凝胶法：半定量试验方法C：动态浊度试验方法D：动态显色法方法E：终点显色法方法F：终点浊度法检测时，可用6种方法的任一种进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非另有规定，以专论中的方法A的测定结果为准。
试验操作过程应防止内毒素的污染。
仪器所有的玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
注：这一章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。
内毒素储备标准溶液的制备用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRP。
内毒素以国际单位（IU）表示。
IU的换算见国际卫生组织公布的国际标准。
注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。
根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。
内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。
得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。
供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。
CE LAL 405, 2008显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，不含偶氮化试剂)3.2阴性对照为细菌内毒素检查用水。
3.3 微板鲎试仪ELx808IU的设定预热仪器15到30分钟，设置温育温度为37ºC。
设置模板及程序。
设定读板波长为405nm。
3.4鲎试剂与显色基质的溶解按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解, 注意不要用旋涡混匀仪激烈振摇。
溶解的鲎试剂应在10分钟内用完。
按标示量加显色基质溶解液于显色基质中，轻轻振摇使显色基质完全溶解。
显色基质溶液可在无污染的条件下于4ºC贮存8小时以内。
若采用多道移液器，将溶解的鲎试剂与显色基质分别转移到无热原加样槽，并轻轻摇匀。
3.5 实验操作将无热原微板放置于鲎试仪中，37ºC温育5分钟。
加入50µl细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。
用移液器或多道移液器加入50µl鲎试剂（避免产生气泡!)，中速振摇10秒混匀。
若内毒素浓度在0.1EU/ml-1EU/ml 区间，37ºC温育12分钟。
（若内毒素浓度在0.01EU/ml-0.1EU/ml 区间，37ºC温育50分钟。
）温育结束，用移液器或多道移液器加入100µl显色基质溶液，中速振摇10秒混匀，37ºC温育6分钟。
温育结束，用移液器或多道移液器加入50µl反应终止剂，中速振摇10秒混匀，在405nm波长处读取吸光度值。
4.数据处理建立标准曲线：Y = b X + a ，其中Y为405nm处吸光度值，X为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。
当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：1. 标准曲线的相关系数r ≥0.980，2. 标准曲线最低点的Y值大于阴性对照的Y值，3. 供试品平行管的平均值在标准曲线的区间内。
5.供试品的干扰试验(详见《中华人民共和国药典》2005版中《细菌内毒素检查法》的“光度测定法干扰试验”)当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须进行干扰试验, 步骤如下:5.1 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度，配制含λm内毒素的供试品阳性对照，测量出该溶液的内毒素浓度, 称为C s；5.2 测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度, 称为C t；5.3 计算该试验条件下的回收率R ＝（C s–C t）/λm×100％5.4 当R在50％～200％之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题发布时间02年09月05日 09时18分方法：通过对干扰鲎试验准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条件、配制原料等)，提出了鲎试验中应注意的问题。
结果：只要克服了检查中的干扰因素，鲎法具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。
鲎试验是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定的一种方法[1]。
它具有比家兔法更简便、快速、灵敏度高、重现性好等优点。
中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。
根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够全部以鲎法代替家兔热原检查法。
但是该法受到许多因素的影响，故在做鲎试验检查时，应注意下列问题。
1鲎试剂本身1.1鲎试剂灵敏度 为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。
因为在我们的实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。
因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。
建议法定部门和生产单位应注意鲎试剂的质量检查。
1.2供试品稀释 在取样品时，一定要熟悉中国药典的内容，不能直接取大输液原液0.1ml进行检查，这是排除干扰因素的简单有效的方法。
因药典已明确规定试验中鲎试剂的灵敏度不超过0.5EU/ml，根据供试品的稀释公式： 供试品稀释倍数= L/λυL ：供试品的内毒素限量(1EU/ml)λυ：鲎试剂灵敏度的标示值(EU/ml)故检测大输液均应稀释后才能进行试验，如选用更高灵敏度的鲎试剂，则应增加样品的稀释倍数。
稀释用的细菌内毒素检查用水药典作了规定。
在4h内不得与鲎试剂产生凝集反应。
如果直接用供试品原液试验，就会使供试品的内毒素提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下，这样，根据目前大输液的生产和贮藏条件，有些就会达不到，鲎法检出的阳性率会提高，兔法复核的机遇也将增多，势必会浪费人力物力。
光度法鲎试剂一、介绍光度法鲎试剂1.1 光度法鲎试剂的定义光度法鲎试剂是一种用于测量光密度的试剂物品。
它能够将光通过溶液进行吸收，并通过测量吸光度来定量分析样品的浓度。
1.2 光度法鲎试剂的种类光度法鲎试剂有多种种类，包括酶标板鲎试剂、光度计鲎试剂和分光光度计鲎试剂等。
不同种类的试剂适用于不同的实验需求。
二、光度法鲎试剂的应用2.1 光度法鲎试剂在生物学研究中的应用光度法鲎试剂在生物学研究中起着重要作用。
例如，在酶动力学研究中，可以通过测量底物和产物的浓度差来确定酶的活性。
光度法鲎试剂可以对这些底物和产物进行分析，从而获得准确的数据。
2.2 光度法鲎试剂在医学诊断中的应用光度法鲎试剂也被广泛应用于医学诊断中。
例如，在血液分析中，通过测量特定指标物在血液中的浓度来判断疾病的程度。
光度法鲎试剂能够提供准确的浓度测量结果，帮助医生做出正确的诊断。
3.1 光的吸收和透射光度法鲎试剂的工作原理基于光的吸收和透射。
当光通过溶液时，溶液中的物质会吸收部分光的能量，使得光强度减弱。
通过测量光的强度变化，可以推断出溶液中物质的浓度。
3.2 Lambert-Beer定律光度法鲎试剂在测量时通常遵循Lambert-Beer定律。
该定律表示溶液中吸光度与溶液浓度和光的路径长度成正比。
通过校准曲线可以将吸光度转换为溶液中物质的浓度。
四、使用光度法鲎试剂的步骤4.1 样品的制备首先，需要制备符合实验要求的样品。
例如，在血液分析实验中，需要从患者身上采集血样，并对血液进行处理，以去除可能干扰测量的物质。
4.2 光度计的校准在进行测量之前，需要对光度计进行校准。
校准过程包括设置空白值和参考值，以确保测量结果的准确性。
4.3 加入光度法鲎试剂将样品与适量的光度法鲎试剂混合，充分搅拌以保证试剂与样品均匀混合。
4.4 测量和记录测量值将混合液倒入光度计的比色皿中，并选择合适的波长进行测量。
记录测量值并进行数据分析。
5.1 优点1.精确度高：光度法鲎试剂能够提供准确的浓度测量结果。
标准品、鲎试剂操作规程目的：建立标准品、鲎试剂操作规程，指导检验员正确执行标准品、鲎试剂操作。
1.适用范围：适用于标准品、鲎试剂操作。
2.定义2.1标准品系以细菌内毒素国家标准品为基础标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
3.责任：QC人员。
4.规程4.1申购4.1.1标准品采购：按《对照品操作规程》中对照品申购程序，进行采购。
到药品检验所或中国生物制品检定所统一订购。
4.1.2鲎试剂采购：由管理员根据检验需要，填写申购单，注明：品名、规格、灵敏度、数量、购回日期。
交化验室主任核准后，交物料部采购。
4.2接收4.2.1物料部将鲎试剂与标准品购回后，管理员接通知，开具领料单。
4.2.2经化验室主任签字后，凭领料单到仓库领用。
4.2.3接收前，管理员仔细核对所领细菌内毒素工作标准品或鲎试剂的规格、数量、有效期和灵敏度，检查外包装、标签有无损坏或泄漏。
无误后，方可接收。
4.3贮存4.3.1接收的标准品与鲎试剂根据其特性存放在适宜的条件下，且根据批号、灵敏度分类摆放。
4.3.2管理员及时登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》。
4.4发放、使用4.4.1检验员根据检品需要，向管理员申请试验用量的标准品、鲎试剂。
4.4.2管理员在核实申请情况后，方可发放。
4.4.3领用后，检验员登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》，管理员签名确认。
4.4.4每批入库的鲎试剂必须按药典规定，进行灵敏度复核试验，符合规定后方可发放、使用。
4.4.5鲎试剂灵敏度复核4.4.5.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每步混匀30秒。
4.4.5.2取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管；另两管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
【高中化学】高考化学第一轮备考特殊试剂的存放和取用
试剂的存放有时存在特殊条件，下面是特殊试剂的存放和取用，请考生认真学习。
1.Na，K：与空气隔离；抗氧化，储存在煤油（或液体烷烃）中，（用石蜡密封）。
用镊子钳取下，切碎载玻片，用滤纸吸煤油，然后将剩余的放入煤油中。
2.白磷：保存在水中，防氧化，放冷暗处。
镊子取，并立即放入水中用长柄小刀切取，滤纸吸干水分。
3.液体Br2：有毒且易挥发，放入研磨过的瓶子中，用水密封。
瓶盖很紧。
4.i2：易升华，且具有强烈刺激性气味，应保存在用蜡封好的瓶中，放置低温处。
5.浓硝酸、硝酸银：在光照下容易分解，应贮存在棕色瓶中，低温避光。
6.固体烧碱：易潮解，应用易于密封的干燥大口瓶保存。
瓶口用橡胶塞塞严或用塑料
盖盖紧。
7.Nh3oh2o：挥发性，应低温密封。
8.c6h6、、c6h5-ch3、ch3ch2oh、ch3ch2och2ch3：易挥发、易燃，应密封存放低温处，并远离火源。
9.Fe2+盐溶液、H2SO3及其盐溶液、氢硫酸及其盐溶液：由于易被空气氧化，不适合
长期储存，因此应立即使用和制备。
10.卤水、石灰水、银氨溶液、cu(oh)2悬浊液等，都要随配随用，不能长时间放置。
这些都是特殊试剂储存和存取的内容。
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标准品、鲎试剂操作规程目的：建立标准品、鲎试剂操作规程，指导检验员正确执行标准品、鲎试剂操作。
1.适用范围：适用于标准品、鲎试剂操作。
2.定义2.1标准品系以细菌内毒素国家标准品为基础标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
3.责任：QC人员。
4.规程4.1申购4.1.1标准品采购：按《对照品操作规程》中对照品申购程序，进行采购。
到药品检验所或中国生物制品检定所统一订购。
4.1.2鲎试剂采购：由管理员根据检验需要，填写申购单，注明：品名、规格、灵敏度、数量、购回日期。
交化验室主任核准后，交物料部采购。
4.2接收4.2.1物料部将鲎试剂与标准品购回后，管理员接通知，开具领料单。
4.2.2经化验室主任签字后，凭领料单到仓库领用。
4.2.3接收前，管理员仔细核对所领细菌内毒素工作标准品或鲎试剂的规格、数量、有效期和灵敏度，检查外包装、标签有无损坏或泄漏。
无误后，方可接收。
4.3贮存4.3.1接收的标准品与鲎试剂根据其特性存放在适宜的条件下，且根据批号、灵敏度分类摆放。
4.3.2管理员及时登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》。
4.4发放、使用4.4.1检验员根据检品需要，向管理员申请试验用量的标准品、鲎试剂。
4.4.2管理员在核实申请情况后，方可发放。
4.4.3领用后，检验员登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》，管理员签名确认。
4.4.4每批入库的鲎试剂必须按药典规定，进行灵敏度复核试验，符合规定后方可发放、使用。
4.4.5鲎试剂灵敏度复核4.4.5.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每步混匀30秒。
4.4.5.2取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管；另两管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
1.0 目的1.1建立细菌内毒素标准品与检验试剂的管理标准操作规程。
2.0 范围2.1适用于公司细菌内毒素标准品与检测试剂的采购、接收、保存、使用、销毁、去热原物品的存放、鲎试剂灵敏度复核及工作标准品效价的标定。
3.0 职责3.1质量控制（QC）部对本操作规程实施负责。
4.0 定义4.1细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.2 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准物质标定其效价，用于试验中灵敏度的复核、干扰试验及各种阳性对照。
4.3 细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
5.0 规程5.1细菌内毒素标准品与检测试剂的采购5.1.1细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品按一年的使用量做计划。
5.1.2鲎试剂、缓冲液、细菌内毒素检查用水、无热原吸头、无热原安瓿等按半年的使用量做计划，从可靠的供应商处购买，如湛江安度斯生物有限公司、湛江博康海洋生物有限公司。
5.2细菌内毒素标准品与检测试剂的接收5.2.1细菌内毒素标准品与检测试剂购回后，由生测组组长协同采购管理人员验收。
5.2.2 验收项目包括：运输条件、内包装、名称、数量、规格、有效期、生产厂家及外观检查等是否复核请购要求或相应规定，如购买的是细菌内毒素工作标准品，则必须有厂家提供的内毒素工作标准品效价分析证明书，验收不合格的试剂或标准品直接由采购退货处理或按相关标准操作规程销毁处理。
5.2.3试剂登记项目包括：试剂名称、批号、数量、规格、有效期、生产厂家、接收时间等。
5.3细菌内毒素标准品与检测试剂的保存5.3.1登记过的试剂才能进行保存。
5.3.2标准品、缓冲液于冰箱中冷藏保存，不得冷冻。
鲎试剂的保存见厂家的说明书。
5.3.3细菌内毒素检查用水、无热原吸头、无热原安瓿等应存放在去热原物品专柜中，此柜仅存放已去热原的物品。
光度法鲎试剂
光度法鲎试剂是一种用于测定蛋白质浓度的试剂，其原理是利用鲎蛋白与试剂中的染料结合产生吸收峰的变化来测定蛋白质的浓度。
该试剂具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
光度法鲎试剂的原理是基于鲎蛋白与试剂中的染料结合产生吸收峰的变化来测定蛋白质的浓度。
鲎蛋白是一种具有高度稳定性和可重复性的蛋白质，其与试剂中的染料结合后会产生吸收峰的变化，这种变化与蛋白质的浓度成正比。
因此，通过测定吸收峰的变化，可以计算出样品中蛋白质的浓度。
光度法鲎试剂的操作非常简单，只需要将试剂与待测样品混合后，通过分光光度计测定吸收峰的变化即可。
该试剂具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
在实际应用中，光度法鲎试剂可以用于测定多种类型的蛋白质，包括纯化的蛋白质、细胞裂解液中的蛋白质、血清中的蛋白质等。
同时，该试剂还可以用于测定蛋白质的相对分子质量、酶的活性等指标。
总之，光度法鲎试剂是一种非常实用的蛋白质浓度测定试剂，具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，在生物化学、分子生物学等领域得到了广泛应用。
