凝胶法鲎试剂使用方法

透析透析专用专用专用细菌内细菌内细菌内毒毒素检测鲎试剂盒使用说明书(凝胶法)【品名品名】】透析用水及透析液细菌内毒素检测鲎试剂盒【规格规格】】1样份/盒【用途用途】】用于透析用水或透析液细菌内毒素检测。

【原理原理】】该鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品, 鲎试剂中含有C因子、B 因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

在适宜的条件下，细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。

【试剂盒组成试剂盒组成】】名称 规格/数量 用途 1 鲎试剂（TAL ） 0.5EU/ml ×8支 反应主剂 2 内毒素工作标准品（CSE ） 1EU/支×2支 阳性对照和供试品阳性对照 3 细菌内毒素检查用水（TRW ） 2ml ×3支 鲎试剂与内毒素溶解 4 辅液Ⅰ 0.7ml ×1支 样本稀释 5 采样瓶 10ml ×1支 透析用水或透析液采集 6 空安瓿 2ml ×1支 样本稀释 7 除热原吸头 200µl ×2包，1ml ×1包 移取样本及内毒素溶液 8 使用说明书 1份 操作说明 9 质检报告 1份 质检报告【需准备的材料和设备需准备的材料和设备】】除本试剂盒外需准备旋涡混合器、移液器、试管架、恒温水浴箱或恒温器（37±1℃）。

【用法用法】】1. 供试品溶液及对照制备1.1阴性对照溶液的制备即细菌内毒素检查用水（TRW ）。

1.2阳性对照溶液的制备一般为浓度为2λ的内毒素溶液（λ为鲎试剂的的标示灵敏度）。

例如：取效价为1EU/支的内毒素工作品（CSE ）１支，加入1.0ml 细菌内毒素检查用水（TRW ），在旋涡混合器震摇2-3min 得1.0EU/ml 内毒素阳性对照溶液。

1.3供试品溶液的制备用无热原采样瓶采集适量透析用水或透析液。

若样本的内毒素限值(L )为1.0EU/ml ，按鲎试剂的灵敏度λ及样本的内毒素限值L 计算供试品德最大有效稀释倍数(MVD )，M V D = L /λ当λ= 0.5 EU/ml ，L= 1.0EU/ml 时，M V D =2(倍),取样本0.7ml 于试剂盒配套辅液Ⅰ中，用旋涡混合器混匀1min 后，即为待测供试品溶液。

产品描述：凝胶法鲎试剂内毒素检测试剂Gel Clot LAL Assays产品介绍：内毒素检测Endotoxin Detection提供内毒素检测LAL(Limulusamebocytelysate)试剂及各种仪器，此类产品广泛用于工业药品制造厂家。

可检测各种规格的内毒素含量。

Lonza公司可提供各种单独或组合装的试剂检测盒,以及内毒素标准品、检测用水、检测仪器。

为适应市场的需要Cambrex公司还不断推出各种新的检测方法及试剂。

：1)凝胶法：定性、半定量、更高的灵敏度。

2) 荧光法：快速、高灵敏度、简单、较大范围内定量3) 端点显色法：快速、简便、小范围内定量。

4) 内毒素检测精密移液器、试管架、无热源吸头、无热源试管、无热源微板、动态检测仪器。

其中重组因子C ----内毒素激活的胶凝级联反应中最重要的成分。

PyroGene™重组因子C 的内毒素侦测有较佳的状态, 不会检测到β(1,3)-聚葡萄醣体的活动，不受季节、环境、动物血、不同批次差异性的影响。

使用PyroGene™无需使用G因子阻滞缓冲液，节约您的时间跟经费。

PyroGene™的订购号码: 50-658U, 每组192支。

需要进一步的产品信息, 请与我们联系。

订货信息货号描述灵敏度EU/ml规格PYROGENT® Gel Clot LAL Assay80 tests = 5×16 tests/vial of lysate250 tests = 5×50 tests/vial of lysateN104 0.03 250 testsN183-06 0.06 80 testsN194-06 0.06 250 testsN183-125 0.125 80 testsN184-125 0.125 250 testsN184-25 0.25 250 testsPYROGENT® Gel Clot LAL Single Test Vials25 single test vials of lysateN189-06 0.06 25 testsN189-125 0.125 25 testsN189-25 0.25 25 testsPYROGENT® Plus Gel Clot LAL Assay（含对照）1×10 ng/vial endotoxin64 Tests = 4×16 tests/vial of lysate200Tests = 4×50 tests/vial of lysateN294-03 0.03 200 testsN283-06 0.06 64 testsN294-06 0.06 200 testsN283-125 0.125 64 testsN294-125 0.125 200 testsN284-25 0.25 200 testsPYROGENT® Plus Gel Clot LAL Single Test Vials1×1 ml vial endotoxin24 single test vials of lysateN289-06 0.06 24 testsN289-125 0.125 24 testsN289-25 0.25 24 testsPYROGENT® Ultra Gel Clot LAL Assay200Tests = 4×50 tests/vial of lysate5×5 ml liquid endotoxin standardsN594-03 0.03 200 testsN594-06 0.06 200 testsN594-125 0.125 200 testsControl Standard Endotoxin for Gel Clot LALEndotoxin(E. coli) for Gel Clot AssaysStrain O55:B5N185 5 vials×2.5 mg/vial*N186 5 vials×10 ng/vial* high potency for depyrogenation studies。

一、实验目的1. 了解鲎试验的原理和方法。

2. 掌握鲎试验在微生物检测中的应用。

3. 提高微生物学实验技能。

二、实验原理鲎试验是一种检测微生物内毒素的试验方法。

鲎血中含有一种特殊的凝固蛋白，当鲎血接触到细菌内毒素时，凝固蛋白会立即凝固，从而产生凝胶。

根据凝胶形成的时间，可以判断样品中内毒素的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鲎试剂- 标准菌液- 待测样品- 生理盐水- 移液器- 培养皿- 灭菌棉签- 酒精灯- 镊子2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 移液管- 培养皿- 镊子四、实验步骤1. 准备工作：- 将鲎试剂置于37℃恒温水浴箱中预热。

- 将待测样品和标准菌液分别用生理盐水进行稀释。

2. 制备样品：- 取适量鲎试剂加入培养皿中，加入适量的生理盐水，混匀。

- 分别加入标准菌液和待测样品，混匀。

3. 观察结果：- 将培养皿置于37℃恒温水浴箱中，观察凝胶形成的时间。

- 记录标准菌液和待测样品的凝胶形成时间。

4. 结果分析：- 根据凝胶形成的时间，判断样品中内毒素的含量。

五、实验结果与分析1. 标准菌液凝胶形成时间为5分钟，说明标准菌液内毒素含量较高。

2. 待测样品凝胶形成时间为8分钟，说明待测样品内毒素含量较高。

3. 根据凝胶形成的时间，判断待测样品内毒素含量为中等。

六、实验讨论1. 鲎试验是一种简单、快速、灵敏的检测微生物内毒素的方法。

2. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染。

3. 实验结果与实际情况可能存在一定的误差，需结合其他实验方法进行综合判断。

七、实验总结通过本次实验，我们了解了鲎试验的原理和方法，掌握了鲎试验在微生物检测中的应用，提高了微生物学实验技能。

在实验过程中，我们应注意操作规范，保证实验结果的准确性。

同时，我们应不断总结经验，提高实验技能，为微生物学领域的研究贡献力量。

凝胶法内毒素快速检测试剂盒 Pyrosate 操作流程
（仅供参考，使用时请参照试剂配套的使用说明）
试剂盒简介：
1974年成立的美国ACC 公司（Associates of Cape Cod, lnc.），是全球首家成立并通过FDA 关于内毒素检测LAL ————鲎试剂生产认证的企业，专业生产内毒素和β-葡聚糖检测产品。

现在ACC 已经成为拥有全球机构和经销网络的世界级组织。

领跑全球呢毒素检测领域。

Pyrosate Kit 作为目前世界上唯一的凝胶法内毒素快速检测试剂盒，是当今最先进最快速的凝胶法鲎试剂，在LAL 凝胶法检测中具有着其他方法无可替代的优点，它不需要专业培训或额外的实验仪器，只需按照说明书中的步骤操作，即可在短时间内（30）分钟得到准确结果，尤其适用于对水和无稀释渗透液的检测。

优势：
无需冷藏 无需稀释 有两个可用灵敏度。

（1.0EU/mL 和0.25EU/mL ） 符合阳性产物控制 检测时间短 对内毒素特异
Factor B Factor G
Clotting Enzyme
Factor C
Turbidimetric。

******有限公司标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。

适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。

责任人检验员内容1 简述1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。

1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。

供试品检测时可使用其中任何一种方法。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

1.3 本规范适用于凝胶法检查。

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位()表示1.5 细菌内毒素国家标准品()系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

1.6 细菌内毒素工作标准品()系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(水)系指内毒素含量小于0.015灭菌注射用水。

光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005。

1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素******有限公司标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用表示。

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。

1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。

阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。

2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1以下。

2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。

2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。

中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

在本检验方法规定的条件下，使鲎试剂凝集的内毒素最低浓度为鲎试剂的标记灵敏度，以EU/ml表示。

当使用新一批鲎试剂或试验条件发生任何可能影响试验结果的变化时，应进行鲎试剂的灵敏度审查试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。

取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。

将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。

将试管轻轻地从恒温器中取出，并缓慢地翻转180度。

如果凝胶是在管中形成的，则凝胶不会变形，也不会从管壁上滑落。

形成或形成的凝胶不牢固，变形，并从壁上滑落。

在保温和取试管的过程中，应避免因振动引起的假阴性结果。

当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。

按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).λc=1g-1(∑x/4）式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。

反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λC在0.5λ-2λ（包括0.5λ和2λ）时，可用于细菌内毒素检查，并标记灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

干扰试验按表1制备溶液a、b、c和d，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

凝胶法鲎试剂使用说明书一、检测步骤1、标准品稀释：开启后加入检查用水（W）1.2ml，置漩涡混合器上混合5min，得到浓度为10EU/ml的内毒素溶液，标记为（E10），其余各梯度稀释方法如下：0.3ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5mlE10 －－－→E1－－－→E0.5－－－→E0.25－－－→E0.125－－－→E0.06－－－→E0.032.7mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW此步骤为新开启标准品者操作，各梯度做好标记，其余操作人员可直接使用。

2、取鲎试剂8支，折断安瓿瓶颈，其中2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管，做好标记。

3、阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水，每支供试品检查管另加入0.1ml供试品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ（即0.1ml 的E0.125）内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ（即0.1ul 的E1）内毒素的供试品。

4、封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃的恒温金属浴中60min，然后取出观察结果。

在孵育期间避免任何震动！二、结果判断1、将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，若管内形成凝胶，不变形，不滑落者为阳性，记录为（+）；反之为阴性，记录为（—）。

取出试管应尽量避免受到震动造成假阴性结果！2、阴性对照管必须为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须为阳性，否则实验结果无效。

3、若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查用水货实验器具受到污染；若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价标示不准，或实验条件不满足；若供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑制反应的干扰因素存在。

凝胶法鲎试剂使用说明书【名称】通用名：鲎试剂英文名：（简称）汉语拼音：本品主要成份为因子、因子、凝固酶原、凝固蛋白原。

【用途】专用于细菌内毒素检查。

【性状】本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水和生理盐水中易溶。

【原理】本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，在适宜的条件下（温度，值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。

【用法】．材料和设备选择所需的规格及灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素工作品及细菌内毒素检查用水。

准备若干支ⅹ玻璃反应试管（若使用规格的鲎试剂无需准备此试管）、各种规格吸管或移液器或注射器、稀释内毒素用玻璃管、反应试管架、计时器、旋涡混合仪、恒温水浴箱（±℃）。

．实验操作稀释细菌内毒素工作品：取内毒素工作品（冻干品）支，按细菌内毒素工作品使用说明书进行操作。

试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于试剂中，轻轻振摇至少至试剂完全溶解。

注意不要引起气泡，溶解后的试剂应在短时间内使用（即配即用）。

检查操作取分装有鲎试剂溶液的×试管或复溶后的支规格的鲎试剂原安瓿支，其中支作供试品管，支作阴性对照管，支作阳性对照管，支作供试品阳性对照管。

每支供试品管加入供试品；阴性对照管加入检查用水；阳性对照管加入浓度为λ的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入含λ内毒素的供试品。

封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入±℃的恒温器中孵育±分钟，然后取出观察结果。

试管在孵育期间应避免任何的振动。

结果判断将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转°时，管内的内容物呈坚实凝胶，不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（）；不呈凝胶或虽生成凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。

阴性对照管均为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管均为阳性，试验有效，否则无效。

【注意事项】.本品仅用于体外细菌内毒素检测，禁止用于注射、口服等。

. 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素，常用的方法是在℃干烤至少，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。

范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。

责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。

二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。

三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。

四、旋涡混合器。

五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。

七、细菌内毒素工作品。

八、凝胶法细菌内毒素检查用水。

九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。

所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。

操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。

2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。

（可存放多长时间）。

3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。

二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。

在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。

（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。

按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。

然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。

1 科德角国际生物医学科技（北京）有限公司
凝胶法内毒素快速检测试剂盒Pyrosate操作流程
（仅供参考，使用时请参照试剂配套的使用说明）
一、名词注解：
1) SPL: 装有鲎试剂的样本检测管(蓝盖)
2) PPC: 装有内毒素工作标准品的样本阳性对照管(红盖)
二、准备材料：
试管架
金属空气浴或非循环式水域箱
三、操作步骤
1）用无热源吸液管取出0.5ml 样本加入到SPL 中,然后用手指夹住试管轻轻摇动20－60 秒时间进行充分溶解和混匀;
2）使用取样本的那支吸液管从SPL 中取出0.25ml 加入到PPC 中, 然后用手指夹住试管轻轻摇动10－20 秒时间进行充分溶解和混匀;
3）立即将此SPL 和PPC 放入金属空气浴或非循环式水域箱,温度设定为37±1℃进行反应, 其中反应时间须严格履行同一批次质检报告(COC)的要求。

四、结果分析
阳性反应：凝集成为凝胶
阴性反应：未凝集，自由流动。