组织化学定位

报告基因GUS的表达的检测
材料：拟南芥AK12-pro 试剂： GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚 铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc， 再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备 用。 组织化学染色检测 -- GUS染色 1. 取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml 1mol/L GUS染色液； 2. 用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心 管中； 3. 37℃浸泡2-5h（或过夜）；（晚上继续下面的脱色和照相步骤） 4. 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色； 肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现 蓝色。
实验报告
转基因作物的检测
新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter GUS NOS-ter LB
p动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
考核
成绩计算方法（百分制）：
期末考试: 50分（考试内容包括平时操作和涉及实
验的理论基础）
平时成绩: 50分 (共5份实验报告,每份10分)
基 因 工 程 的 基 本 路 线
质粒DNA提 取和酶切
PCR
连接
转化
• 基因的组织特异性表达
原 理
GUS基因就是转β-葡萄糖醛酸酶基因 ，它存在于 E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯 类物质为底物，其分解产物呈蓝色。 由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背 景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的 研究中（作为报告基因）。根据gus基因检测所用 的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学 法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检 测法最高），其中最为常用的是组织化学法。

+采集发育中后期及成熟种子并用FAA 固定保存。

用滑走切片机冰冻切片法制片，爱尔新蓝一番红染色，甘油胶封藏。

具体组织化学方法：（1）用氯化汞一溴酚蓝鉴定蛋白质。

（2）高碘酸一锡夫试剂鉴定多糖。

（3）碘一碘化钾鉴定淀粉。

（4）苏丹黑B鉴定脂类物质。

（5）PAS法进行可溶性糖鉴定。

（6）含浓硫酸或高氯酸的显色剂能使人参皂甙产生从淡红到紫红的系列颜色反应=颜色的深浅与人参皂甙的含量成正相关![绞股蓝龙须茶的人参皂甙组织定位及皂甙含量的季节变化8-10]（7）组织化学方法冰冻切片法P将干燥的龙须茶在40温水中浸泡0.5小时，取顶芽下第2`3节的茎和叶投入醋酸铅饱和水溶液中处理24小时，Leicac-CM1850冷冻切片机冰冻切片,厚度30um。

组织化学定位：以等量的5％香草醛－冰醋酸和高氯酸混合试剂对冰冻切片显色，临时装片。

Leica－DMLB显微镜观察照相。

(8)组织化学分析结果表明，其分泌细胞团经5％NaOH水溶液处理，由黑色或红色变成绿色，而分泌囊则未变色；分泌囊经苏丹黑染色，变成灰黑色，而分泌细胞团不变色，说明分泌细胞团含金丝桃素类物质，而分泌囊则含挥发油。

Some methods of foreign papers as follows.（1）The various plant materials were treated with Toluidin Blue as a general purpose stain (O'Brien and McCully,1981), and with the following histochemical stains : 各种植物用Toluidin Blue 作为一个总体的染色,具体的组化反应见以下:（2）lipids, Alkanna tincture (Faure, 1914); 安娜酊剂鉴定脂类.（3）pectic substances果胶物质, Ruthenium Red (Jensen, 1962)钌红鉴定果胶类物质; essential oils, Sudan III with glacial acetic acid as control (Johansen, 1940); 冰醋酸的Sudan三溶液作为一个控制鉴定挥发油.（4）alkaloids, Wagner reagent (Furr and Mahlberg, 1981), Dragendorff reagent (Yoder and Mahlberg, 1976), 1% picricacid(Faure, 1914), Phosphomolybdic acid (Faure, 1914) and Iodine-potassium iodide solution (Lugol: Johansen, 1940).All histochemical stains were matched by controls.（5）Toluidine Blue (O'Brien and McCully,1981) as a generic dye for DNA, cytoplasm and some components of the cell wall; 甲苯氨蓝作为一般的染料鉴定DNA,细胞质和一些细胞壁的成分.（6）PAS (O'Brien and McCully,1981) for non-cellulosic polysaccharides.PAS反应鉴定非纤维素多糖.（7）Alkanna tincture(Faure, 1914) and Nile blue (Cain, 1947) for total lipids;安娜酊剂和尼罗兰鉴定总的脂类或油脂.（8）Sudan III with glacial acetic acid as a control (Johansen,1940) and Nadi reagent (David and Carde, 1964) for essential oils;冰醋酸的苏丹三作为控制,Nadi reagent鉴定挥发油.（9）Nadi reagent (David and Carde, 1964) for resins;（10）Wagner and Dittmar reagents (Furr and Mahlberg,1981) and iodine iodide solution (Lugol) (Johansen, 1940) for alkaloids;（11）potassium bichromate (Faure, 1914) for tannins; 重铬酸钾鉴定丹宁.（12）Dela®eld hematoxylin (Faure, 1914) and Ruthe-nium Red (Jensen, 1962) for pectic-like substances类似果胶的物质;（13）anti-mony trichloride (Hardman and Sofowora, 1972) for steroids; 三氯化锑鉴定类固醇,(14)brilliant blue Coomassie R250 (Fisher, 1968) for proteins; 库码西R250亮兰鉴定蛋白质.（15）concentrated sulfuric acid (Geissmann and Gri n, 1971) for sesquiterpene lactones.浓硫酸鉴定蓓半萜内酯.（16）分根、根茎、茎、叶四部分进行冰冻切片；于横切面上滴加新配制的99 乙醇一硫酸混合液(1：1)在显色反应l0～30rain之间，以显微镜观察颜色变化。

植物生理学实验_华南师范大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年1.实验室设备用电尽量用插板接电答案:错误2.叶片衰老过程中贮藏物质（）答案:降解3.植物的衰老是不可逆的。

答案:错误4.抗氧化剂可以促进衰老。

答案:错误5.氮蓝四唑（NBT）可以进行进行超氧阴离子自由基的组织化学定位。

答案:正确6.研究表明光能延缓植物叶片的衰老。

答案:正确7.在进行黄瓜子叶的处理培养过程中时，要注意防霉和补充处理液。

答案:正确8.香蕉成熟后期出现的黑斑是不可提前预防的。

答案:错误9.培养基进行消毒灭菌时，应在________Mpa（或℃）压力下保持15—20分钟。

（）答案:0.1(121℃)10.随着酶促反应的进程，其反应速率是逐渐加快的。

答案:错误11.在植物体内，任何部位的过氧化物酶（POD）活性都是一样的。

答案:错误12.过氧化物酶（POD）是植物体内重要的呼吸酶类，与植物抗性密切相关，能确定植物在特定环境下的适应能力。

答案:正确13.在测定酶活性时，要注意酶的反应要在保持在低温。

答案:错误14.愈创木酚法测定过氧化物酶活性的反应底物是愈创木酚。

答案:错误15.测定酶促反应速度只有（）的测定才有意义。

答案:初速度16.过氧化物酶活性一般在（）组织中较高。

答案:老化17.过氧化物酶广泛存在于植物体中，该酶催化（）氧化，以清除其对细胞的破坏作用。

答案:H2O218.高温胁迫往往伴随着（）胁迫的产生。

答案:水分19.植物在逆境中有抵御逆境伤害的本领，以下（）不是机体产生的保护酶系统。

答案:Rubisco20.水培法就是用水来培养植物的方法。

答案:错误21.配制Fe盐时，Na2-EDTA和FeSO4·7H2O要分别溶解后再混合。

答案:正确22.1939年Arnon和Stout提出植物的必需元素必须符合三个标准，以下( )标准不正确。

答案:间接功能性23.杀菌剂和酸化剂的配合使用可抑制微生物生长防止花茎导管阻塞。

❖ 显示脂类的基本原理 ：用易溶于脂类的染料, 使之溶于所检的脂质(如脂滴)中,使组织内的 脂类着色.
❖ 常用方法： 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼 罗蓝法 、苏丹Ⅲ染色法等
❖ 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属 偶 氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏 丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择 性提取法(对照)
❖ 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出 现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法 中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、 脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容， 此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化 学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与 定量相结合的研究。
❖ 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全 身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发 生移位，固定后再迅速取材。
三、制 片
❖ 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 ❖ 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
❖ 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 ❖ 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 ❖ 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 ❖ 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 ❖ 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A·R级)。 ❖ 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 ❖ 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或
❖ 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 ❖ 1、操作步骤 ❖ (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 ❖ (2)核固红染液染色2一10分钟。 ❖ 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩