组织化学技术

组织化学技术常用仪器设备、器皿准备及试剂配制一、实验仪器（本次免疫组化用到的设备请看文档最后）1．37℃恒温箱。

2．恒冷切片机或半导体制冷切片机。

3．冰箱及低温冰箱。

4．显微镜。

5．200μl、100μl及20μl可调微量加样枪。

二、器皿准备1．量筒（量取液体）。

2．烧杯（混匀及溶解）。

3．三角烧瓶（加热溶解，特点用于易挥发的液体）。

4．容量瓶（测定溶液体积用）。

5．玻棒（搅拌用）。

6．pH计或试纸。

7．载玻片。

8．盖玻片。

9．湿盒（免疫组织化学反应用）。

三、玻璃器皿的清洁1.用自来水冲洗2.用毛刷沾肥皂水或稀释了的洗洁精液洗擦3.自来水冲洗，晾干4.放入清洁液内浸泡一天5.用自来水冲洗干净，最后用少量蒸馏水冲洗6.自然晾干或倒置于烤箱中注意：干净的玻璃器皿应是无水膜且光滑的四、新载玻片的洗涤法1.直接入清洁液浸泡过夜2.用自来水冲洗干净3.蒸馏水漂洗后烤干备用五、载玻片包被的方法1．APES包被法：将配制的APES-丙酮黏附剂（APES 1份；丙酮49份，现用现配）倒于染缸中，将烤干的玻片放于染缸中30秒，再入纯丙酮或蒸馏水中涮去未结合的APES；37℃烤干，把处理过的玻片放于切片盒中备用。

2．铬明胶包被法：配制铬明胶溶液（0.5%明胶＋0.1%铬明矾，用60℃左右蒸馏水先溶解明胶后，再加入铬明矾，待完全溶解后，过滤），将玻片浸入溶液中30秒，取出后37℃烤干备用。

3．多聚赖氨酸包被法：配制0.1mg/ml多聚赖氨酸溶液，均匀涂抹于载玻片上，自然凉干后即可使用。

六、主要试剂及配制溶液的配制溶液大多数以水为溶媒，其浓度随溶媒的容量和溶质的重量而定。

溶液的浓度通常用下列三种方法来表示。

一、百分比溶液浓度用溶质对全部溶液量的百分比表示。

(一)稀溶液的配法：如不说明溶媒是什么，即指水溶液。

例1．0.2%伊红水溶液——即将0.2克伊红溶解于100毫升的蒸馏水中。

例2．0.1%固绿酒精溶液——即将固绿0.1克溶解于100毫升的95%酒精中。

(二)浓溶液的配法：配制高浓度的溶液，应在100毫升的水中减去溶质重量的水。

例如15%的食盐水溶液，则应以100－15＝85，即量取85毫升的水加入15克的食盐即得15%的食盐水溶液。

二、克分子溶液浓度用1升溶液中所含溶质的克分子数表示。

用这个方法表示溶液的浓度称为克分子溶液，常以M代表。

例如0.2M溶液即为1升溶液中含0.2克分子溶质的溶液。

其配制方法如下：例如0.5M蔗糖溶液1．先计算蔗糖的分子量（C12H22O11＝342.2）。

2．再称取0.5克分子的蔗糖C12H22O11∕2，即171.1克。

3．投入溶积为1升的量瓶中，瓶颈上有刻线标明容积到上恰等于1升。

4．注入蒸馏水使蔗糖溶解，水加到刻线为止。

三、当量溶液浓度用1升溶液中所含溶质的克当量表示。

这种溶液称为当量溶液或规定溶液，以N表示。

如1升溶液中含1克当量，即称为1当量溶液（1N）。

在配制当量溶液时，其当量的计算因各种化合物（酸、碱、盐）而异。

酸的当量是以酸分子中可被金属取代的氢原子数去除。

碱的当量等于其分子量被碱中金属的原子价去除。

至于盐类的当量可用其分子中金属的原子数及金属的原子价去除分子量求得。

例如：HNO3（分子量63）的当量等于63∕1＝63H2SO4（分子量98）的当量等于98∕2＝49Ca(OH)2（分子量74）的当量等于74∕2＝37Al2(SO4)3（分子量342）的当量等于342∕2×3＝57其配制步骤与克分子溶液相似，不过在第二步称取的克分子量换以克当量而已。

1．硫酸清洗液成分配方Ⅰ配方Ⅱ配方Ⅲ重铬酸钾80g 100g 100g自来水1000ml 750ml 1000ml浓硫酸120ml 250ml 100ml配制方法：先将重铬酸钾在水中溶解，然后顺玻棒缓慢加入浓硫酸，边加边搅拌，防止过度发热。

2．常用缓冲液（1）0.1M磷酸缓冲液（PB，pH7.2~7.4）的配制磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）7.4g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）72.5gD.W. 2500ml（2）0.01M PBS（pH7.2~7.4）的配制NaCl29g0.1M PB 100mlD.W. 900ml（3）0.2M pH4.8醋酸缓冲液冰醋酸 1.2ml乙酸钠·3H2O 2.72gD.W. 至100ml3．常用固定液4%多聚甲醛溶液-0.1mol/L PBS缓冲液（pH7.4）1000ml多聚甲醛40g0.1mol/L PB (pH7.2~7.4) 加至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500ml 0.1mol/L PB，加热至溶液清亮（注意不要煮开）。

冷却后过滤，补足0.1mol/L PB至1000ml。

放冰箱备用。

4．生理盐水NaCl 9g蒸馏水1000ml5．蔗糖溶液（常用5%~30%，以PB配制）蔗糖5~30g0.1mol/L PB (pH7.2~7.4) 100ml（最好用时新鲜配制）6．DAB显色液配制DAB 50mg0.1mol/L PB (pH7.2~7.4) 100ml30% H2O2溶液100 l配制方法：将称好的DAB溶于0.1mol/L PB (pH7.2~7.4) 中，过滤。

待显色前加入30% H2O2溶液。

制片程序⒈取材；⒉固定；⒊包埋；⒋切片；⒌贴片动物的致死与取材致死法1. 麻醉法：乙醚、氯仿、1%戊巴比妥钠、乌拉坦2. 断头法或颈椎脱臼：适用于小动物3. 击头法4. 空气栓塞法：适用于较大动物，如兔取材的注意事项1.所取材料愈新鲜愈好2.切取组织的刀剪必须锋利3.组织块应力求小而薄4.取材要注意选择标本的部位和切面的方向5.取标本时应注意清洁固定一、固定的目的1. 能迅速阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败2. 使细胞内物质凝固成不溶性物质3. 使组织内各种物质成分产生不同的折光率以达到染色后易于鉴别和观察各种不同的结构4. 对组织有媒染作用，使不同组织成份对染料有不同的亲和力，使细胞各部易于受色5. 能使组织硬化，为制作薄片奠定良好的基础6. 使细胞各部分清晰，不致过度收缩或膨胀而失去原有形态结构二、固定方法1. 浸泡固定法（1）新鲜组织取材后固定置于10%~20%蔗糖（4%多聚甲醛溶液配制）固定液中沉底，再于30%蔗糖（PBS配）液中沉底，以脱去组织中的水分，避免冷冻时产生冰晶，损害细胞形态。

然后即可以在半导体冰冻切片机上做冰冻切片。

（2）低温冷冻后组织的冰冻切片将组织块置于包埋盒中，用OCT包埋剂包埋后，于恒冷箱切片机做冰冻切片。

（3）冻存取材后用铝箔纸包好，置于液氮中或者超低温冰箱（-70℃以下）冻存。

2. 注射、灌注固定法左心室插管，将右心耳剪开，首先用生理盐水冲洗（大鼠一般为50~100ml），然后用4%多聚甲醛（大鼠一般为300~500ml）灌注，先稍快，后缓慢，持续30分钟。

取出所需组织，置于固定液中后固定4h左右（根据需检测方法进行相应调整），然后置于10%→20%→30%蔗糖溶液中，待组织沉底后即可进行冰冻切片。

3. 蒸气固定法三、固定的注意事项1. 固定液的量一般以组织块大小的30倍为宜2. 必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或膨胀的药剂作为固定液，通常多种固定液混合使用3. 固定时间一般以24小时为宜4. 柔软组织在新鲜时不易切成小块，往往采用重新固定法处理5. 神经组织以在活体动物灌流固定后再重新投入固定液为佳固定液1.常用固定剂：甲醛、多聚甲醛、戊二醛、锇酸2.固定液：10%福尔马林液；4%多聚甲醛；4%多聚甲醛－2.5%戊二醛；0.5%～1%锇酸3.固定后处理：流水冲洗；酒精充分洗涤；直接入脱水剂灌注固定液的量至少约为动物血液量的2倍。

即动物体重（克）×7%×2（毫升）。

一般兔需300~500ml，猫400~700ml，猴1000~1500ml。

也有主张每公斤体重需多达1000毫升者。

脱水固定后的组织内仍充满水分。

由于石蜡为非水溶性物质，不能与水融合，所以浸蜡前必须用脱水剂除去组织内的水分，这一过程称做脱水。

常用的脱水剂有：（1）乙醇溶液；：用于脱水的梯度乙醇溶液一般从70%开始，但要视具体情况，如系胚胎组织或较为柔软的组织，则可以更低的浓度开始。

（2）丙酮：脱水作用比乙醇强，对组织块收缩较历害，价格较贵，故不宜用于一般组织脱水，主要用于快速脱水或固定兼有脱水的方法中。

（3）正丁醇：为无色液体，其脱水能力弱，对组织收缩较少，它能与水、乙醇及石蜡混合，故经它脱水的组织块可直接浸蜡包埋。

（4）二氧六环：为无色液体，易挥发，是有毒试剂，有致癌性。

其脱水作用较酒精快，收缩性较小。

但售价远昂于乙醇，而且每次用量大，有累积性毒性，故应用较少。

脱水注意事项（1）脱水必须从低浓度开始逐级转入高浓度脱水剂（称为梯度脱水），才能达到将水分逐步置换的目的。

（2）脱水必须进行得很彻底，否则导致脱水不足，给浸蜡带来困难。

（3）脱水剂必须是与水能按任何比例混合的液体，这样才能使组织内的水分全部为脱水剂所替代。

（4）脱水剂也必须能与透时剂混合，这才能使透明剂完全替代组织内的脱水剂。

透明组织块经酒精脱水后还不能直接用石蜡包埋，因为乙醇与石蜡不相溶，还必须用“石蜡诱导剂”过度，“石蜡诱导剂”又称透明剂，能够同时溶解于脱水剂及包埋剂石蜡中。

将“石蜡诱导剂”逐渐渗入组织，将脱水剂完全排出的过程称做透明。

常用的透明剂有：二甲苯；甲苯；香柏油；氯仿。

二甲苯为最常用的透明剂，能溶于醇及醚，亦为石蜡溶剂，但不溶于水，它的透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果。

所以在应用时，必须特别小心。

应用二甲苯透明时，须注意下列几点：1．二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染色缸中取出封片，手要敏捷，否则待二甲苯挥发干净后，组织就变硬发白，即使再加树胶封片，由于树胶不能浸入组织，封后也无用处。

2．二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。

在封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水气侵入，出现白色云雾状。

2．二甲苯必须保持无水，无酸。

若用一、二滴石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即表示其中已含有水分，不能再用。

浸蜡浸蜡是为包埋做准备，因二甲苯或其他透明剂具有与石蜡相溶的性质，所以将已透明的组织块放入熔化的石蜡内，石蜡即浸入组织并替换出透明剂，使组织内部硬度均匀，以助切出光整的切片。

包埋由于生物体的组织有各种硬度不同的成份，必须加石蜡等作支持物质渗入组织块内部，并将组织块包埋起来，便于制作极薄的切片。

包埋时应将组织块的切面朝下，组织与蜡之间不能留有空隙，组织力求摆平，昼与包埋器底板接触，最后放上标志。