原位杂交组织化学技术的基本方法及操作规程

原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。

该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。

下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。

操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。

DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。

2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。

其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。

3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。

杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。

对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。

4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。

通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。

5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。

对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。

对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。

小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。

探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。

因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。

2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。

温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。

通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。

3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。

原位杂交的基本方法一、组织的取材注意事项：刀要锋利、不能用力向下挤压组织；组织块不宜过大、及时固定。

二、固定（一）原则：及时固定、避免RNA酶的污染4％多聚甲醛（0.1M PBS PH7.4，可加1/1000的DEPC）,动物实验标本最好先灌流固定。

（二）固定液的浓度、固定时间及温度要适宜1 浓度越高组织结构保存的越好，但mRNA的保存越差；2 固定时间越长，mRNA破坏的越多；做原位杂交组织固定时间不宜过长，一般24h，不能高温固定（微波可使组织内温度升高），低温可保护RNA不降解（4 ℃冰箱内固定）。

mRNA杂交：最好用冰冻切片a. 4％多聚甲醛中固定1－2h，浸入15%蔗糖溶液中4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中。

b. 取材后直接液氮冷冻，切片后4％多聚甲醛固定10min，空气干燥后－70 ℃低温冰箱保存。

注意：a. 多聚甲醛与戊二醛混合固定的组织可同时用作光、电镜检查，但不能用于原位杂交实验。

b. 石蜡切片蛋白质交联影响探针穿透，包埋降低mRNA含量三、玻片和组织切片的处理玻片的处理：洗涤：洗涤剂→水洗→洗液（24h）→水洗→双蒸水洗→60 ℃烤干→250 ℃烘烤4h，锡箔纸包裹无尘存放。

玻片硅化：将烘烤过的载玻片用2％APES丙酮液浸泡3min →用丙酮洗两次→用DEPC处理过的蒸馏水洗1～2次→40 ℃烘干→防尘保存待用。

（整个过程要戴消毒手套进行）未经硅化的玻片可以涂粘附剂（多聚赖氨酸）2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：稀释的酸洗涤、去垢剂Triton X-100或消化酶（蛋白酶k、胃蛋白酶），用量及孵育时间视组织的种类、固定剂的种类及切片的厚薄而定。

为保持组织结构，可用4％多聚甲醛再固定。

3.降低背景染色：杂交后的酶处理和杂交后的洗涤。

预杂交：预杂交液不含探针和硫酸葡聚糖，可封闭非特异性杂交点。

杂交后用低浓度RNA酶溶液洗涤一次，以减少残留的内源性RNA。

4.防止RNA酶污染：整个杂交前处理过程都需戴消毒手套，所有实验用玻璃器皿和镊子于实验前一日200 ℃烘烤。

原位分子杂交的基本过程原位分子杂交是一种用于研究基因表达模式和功能的重要技术。

它通过将互补的标记探针与待检测的目标序列进行杂交，然后通过探针的标记信号来确定目标序列在组织或细胞中的位置和表达水平。

下面将详细介绍原位分子杂交的基本过程。

第一部分：准备工作在进行原位分子杂交之前，需要进行一系列的准备工作。

首先，需要获取目标序列的核酸样本。

这可以通过提取组织或细胞中的总RNA或特定的mRNA来实现。

然后，需要制备互补的标记探针。

标记探针可以使用放射性同位素、荧光染料或酶标记等方法进行标记。

最后，需要准备组织切片或细胞扩展片，以便进行杂交反应。

第二部分：杂交反应杂交反应是原位分子杂交的核心步骤。

首先，将标记探针与待检测的目标序列进行杂交。

这一步可以通过将探针和目标序列共同溶解在杂交缓冲液中，然后在适当的温度下进行孵育来实现。

杂交的温度和时间会根据探针和目标序列的性质而有所不同。

通过杂交，标记探针将与目标序列形成稳定的双链结构。

第三部分：探针检测杂交完成后，需要对标记探针进行检测。

具体的检测方法会根据标记探针的性质而有所不同。

例如，如果使用的是放射性同位素标记探针，可以通过放射自显影或液体闪烁计数等方法进行检测。

如果使用的是荧光染料标记探针，可以通过荧光显微镜或流式细胞术等方法进行检测。

如果使用的是酶标记探针，可以通过酶的催化反应产生的显色反应进行检测。

第四部分：结果分析在完成探针检测后，需要对结果进行分析解读。

根据探针信号的强度和分布情况，可以确定目标序列在组织或细胞中的位置和表达水平。

例如，如果探针信号在细胞核中出现，可以推断目标序列参与了基因转录和表达过程。

如果探针信号在细胞质中出现，可以推断目标序列参与了蛋白质合成和运输过程。

通过对不同组织或细胞样本的比较分析，可以揭示目标序列的功能和调控机制。

第五部分：优势和应用原位分子杂交具有许多优势和应用价值。

首先，它可以在组织或细胞水平上直接观察目标序列的表达模式和功能，有助于深入理解基因调控网络和细胞信号传导通路。

原位杂交步骤自己整理的精讲原位杂交是一种常用的实验方法，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的分布情况。

这种方法可以帮助研究人员确定基因在染色体上的位置，并研究基因的表达和调控。

下面是原位杂交的详细步骤：1.样品处理：首先，需要提取并处理样品中的细胞或组织。

这一步骤通常包括细胞固定、组织切片和蛋白酶处理等。

细胞固定能够保持细胞的形态和结构，而组织切片则能够使得样品更容易进行观察和分析。

蛋白酶处理的目的是通过消化蛋白质来提高核酸的可达性。

2.探针设计：在进行原位杂交之前，需要准备一个能够与目标DNA或RNA序列互补配对的探针。

这个探针通常是由DNA或RNA序列构建而成的，可以通过人工合成或PCR扩增获得。

在设计探针时，一般要考虑到探针的长度、碱基组成和互补性等因素。

3.标记探针：为了便于后续的检测，需要将探针标记上报告标记物。

常用的报告标记物有荧光染料、放射性同位素和酶等。

标记探针的方法通常包括非放射性标记和放射性标记两种方式，具体选择哪一种方法取决于实验的需求和要求。

4.杂交反应：将标记好的探针与样品中的DNA或RNA序列进行杂交反应。

这种反应通常在固定样本上进行，样品和探针会在适当的杂交缓冲液中反应一段时间。

杂交反应的温度和时间会根据探针的长度和互补性等因素进行调节。

反应结束后，通常需要进行洗涤以去除未结合的探针和杂交缓冲液。

5.可视化和分析：经过洗涤之后，探针与目标DNA或RNA序列杂交形成的杂交体可以通过其中一种方法进行可视化和分析。

常用的方法包括荧光显微镜观察、放射性测量和酶活性检测等。

通过这些方法，可以确定目标序列在样品中的分布情况和数量。

除了上述的基本步骤，还可以根据实验的具体要求进行一些改进和优化。

例如，可以采用双标记法来同时检测不同序列的分布情况；可以使用探针混合标记法来提高检测的灵敏度和特异性；可以用信号扩增技术来增加检测的信号强度等。

总体来说，原位杂交是一种常用的实验方法，可以用于研究基因的定位和表达。

原位杂交组织化学技术的基本方法一、核酸分子杂交技术1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。

自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。

按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。

固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。

液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。

二、原位杂交组织化学技术的由来及发展原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。

但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。

菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。

Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。

它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。

1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。

原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种重要的遗传学技术，用于研究基因组的结构、组织和表达。

它可以帮助科学家确定特定基因在染色体上的位置，探索基因在细胞和组织中的活性等信息。

本文将详细介绍原位杂交技术的操作步骤，并分享一些实验中常见的小贴士。

原位杂交的基本原理是将一段与所研究基因序列互补的DNA探针标记上荧光分子等信号物质，然后与待测细胞或组织样品进行杂交反应。

通过观察探针与靶DNA的结合情况，可以确定所研究基因在染色体的位置和组织中的表达情况。

下面是一般的原位杂交实验步骤：1.样品处理：首先，需要准备待测细胞或组织样品。

可以选择直接从动植物或细菌中提取DNA，或采用组织切片的方式。

样品处理的目的是提高探针与靶DNA的结合效率。

2.探针的制备：制备一段与所研究基因互补的DNA探针。

可以通过PCR扩增、化学合成或转录反应等方法制备探针。

为了方便后续观察，可以将探针标记上荧光物质如荧光染料、辣椒素或金纳米颗粒等。

3.免疫组化：为了提高探针与样品中的靶DNA的杂交效率，可以进行免疫组化步骤。

这一步主要是使用特定抗体识别并结合待测物质，如甲醛固定、蛋白酶K处理等。

4.模板DNA的制备：将样品中的DNA固定在载玻片上，通常使用甲基化醛或戊二醛确定DNA在载玻片上的位置。

5.杂交反应：将制备好的探针与固定在载玻片上的DNA进行杂交反应。

这一步通常需要对探针和靶DNA进行变性和再结合等步骤。

6.信号检测：通过显微镜观察杂交产物，在适当的波长下观察荧光信号。

可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备。

接下来，我们来分享一些原位杂交技术的小贴士：1.设计合适的探针：选择合适的探针非常重要。

探针的长度应该足够长，以确保与靶DNA的特异性结合。

此外，为了提高信号强度，可以选择多个标记物如荧光染料标记在同一个探针上。

2.优化杂交条件：杂交时间和温度是影响杂交效率的重要因素。

可以通过调整这些条件来提高杂交效果。

此外，添加高浓度的盐类和保护剂可以提高杂交的特异性和效率。

原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制一、杂交前准备（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。

DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。

原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。

方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。

有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。

此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。

注意：DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。

②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。

（二）载玻片的处理组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。

处理方法如下：（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗2～3次，置160℃以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20mi n。

经以上处理可清除载片上的核酸酶。

（2）HCl处理法试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇步骤: a. 玻片在室温下于1M HCL中浸泡30分钟b. DEPC水中洗片c. 95%乙醇中洗片d. 空气中干燥e. 重复一遍 a—d.f. 铝箔包好备用.（三）硅化【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20mi n,等其冷却后,倒掉盐酸。

（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。

（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsila ne,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。

原位杂交实验具体步骤及详细方法原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。

根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。

根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。

直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。

间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。

尽管同位素标记(如35S，3H，32P 等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。

一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。

由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。

固定目的是：(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。

最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。

增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。

组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。

(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。

原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。

具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。

2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。

探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。

标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。

3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。

首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。

杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。

4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。

洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。

5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。

通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。

6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。

现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。

原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。

但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。

原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。

2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。