组织化学技术(2010)_PPT幻灯片
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第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
➢ 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基 因位点
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
组织化学技术教程PPT课件
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案例一：乳腺癌组织化学染色分析
总结词
乳腺癌组织化学染色分析是研究乳腺癌的重要手段， 通过染色技术观察癌细胞形态和组织结构变化，有助 于诊断和预后评估。
详细描述
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，组织化学染色分析可 以帮助医生了解癌细胞的分化程度、恶性程度以及转 移情况。在染色过程中，常用的染色方法包括HE染色 、免疫组化染色和特殊染色等。通过观察癌细胞核增 大、核沟、核沟蛋自质等特征，可以判断癌细胞的恶 性程度和分化程度。此外，组织化学染色还可以用于 检测癌细胞转移和浸润的情况，为临床治疗提供依据 。
组织化学技术教程
目录
• 组织化学技术概述 • 组织化学技术的基本原理 • 组织化学技术的实际应用 • 组织化学技术的挑战与未来发展 • 案例分析
01 组织化学技术概述
定义与特点
定义
组织化学技术是一种利用化学反应来 检测组织或细胞内特定化学物质的方 法。
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分析、 可定位分析等。
20世纪初
随着新技术的不断涌现，组织 化学技术得到迅速发展，并逐 渐应用于医学领域。
20世纪中叶
随着免疫组织化学和原位杂交 技术的出现，组织化学技术进 入了一个新的发展阶段。
21世纪
随着Байду номын сангаас白质组学和基因组学研究 的深入，组织化学技术在生命科
学领域的应用越来越广泛。
02 组织化学技术的基本原理
组织样本的获取
解决方案
针对这些挑战，可以采取优化实验条件、改进抗体标记技术、发展新型荧光染料 和探针等措施，提高检测的灵敏度和特异性。同时，加强样本处理和数据分析方 法的研究，提高实验结果的可靠性和可重复性。
《免疫组织化学技术》PPT课件
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24
双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
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25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
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21
PAP法的原理
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22
PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
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23
PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
免疫组织化学技术-PPT精选文档
3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上 荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在 荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发 光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中 某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光 技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊 断、检验中应用较广。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶 的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于 光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
4、被检测的物质
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、 多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病 原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA的异同
1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗 原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品 内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能 更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通 过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量 ，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组 化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原 结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。 与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首 选方法之一。
《般组织化学技术》PPT课件
二是对Km或对底物与酶的亲 和性的影响。
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三是对酶稳定性的影响。
确定最适PH的方法：
一是查阅文献，根据前人的经验， 预实验印证（碱性磷酸酶9.2，酸 性磷酸酶5.0）。
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二是实验测定最适PH值。
6. 温度的影响:
一是温度能影响酶分子结构的稳 定性及其与底物分子之间的亲和性。
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二是温度能影响酶底物复合物分解 速度。
三是温度能影响激动剂或抑制亲 和性。
（三） 显示酶的组化方法及原理
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在酶的显示方法中，从原理讲，可 分两大类：
一类是显示酶的活性—酶组织化 学方法：属于一般组化方法。
二类是显示酶的本质，即酶蛋白的 存在及存在部位—免疫酶组织化学。
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28
（3）葡萄糖氧化酶（尼腺曲霉菌素 源）
常用的显色原有： ① 2-P-碘酚-3-P-硝基苯-5-酚氯化四 氮唑（INT）：产物呈红色，易溶于 有机溶剂。 ② 氮蓝四唑（NBT）：产物呈蓝黑 色。现用于双重染色。 ③四硝基氮蓝四完整版唑课件（ppt TNBT）：产 29
产物呈灰褐色，不溶于有机溶剂。 （4）β-半乳糖苷酶（大肠杆菌来源）
标本制备技术:
组织化学的基本要求：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1. 保持组织细胞良好的形态结构。
2. 具备高度的特异性。
3. 应有一定的灵敏性。
4. 4. 可重复性。
5. 5. 生物反映的产物必须在原位沉
淀、色深、不溶和具有稳定性的
特点。
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1
组织切片技术:
（一）冰冻切片：
组织化学技术教程PPT课件
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一、组织化学发展简史
组织化学是在组织学和化学的基础上发 展起来的，它的历史相当悠久。早在十九世 纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开 始观察组织中的化学反应。如法国植物学家 F.V.Raspail（1826）介绍了植物花和果受精 过程中的碘淀粉反应；M. Perls（1867）用 普鲁士蓝显示出铁；A.N.F. Millon(1844)叙述 了蛋白质反应； R. Fürnrohr（1850）论述了 纤维素的氯锌碘法；
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1. 组织化学的要求 组织化学是建立在组织细胞形态学、生物物
理学、生物化学及分子生物学学科基础上的一门 边缘学科，因此组织化学研究具有如下要求： （1）要求形态结构真实完整。 （2）பைடு நூலகம்求显色全过程均属于化学反应。 （3）要求化学反应在组织细胞的原位被显示 （4）要求弄清化学成分与形态结构及空间的关
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3．反应物须有显色性和定量的可能性，即必须 是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、 色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度 要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关 系。
4．反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研 究和验证。
5．反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察。 6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可
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（2）原位分析法 组织细胞在器官原位上不经分离，用化学试剂与组织细胞内的某些物质
进行化学反应，最终在局部呈现有色反应，通过显微镜及其他仪器，如分光光 度计、荧光显微镜等组织细胞内的化学反应进行定位、定性和定量研究。常用 的方法包括：①组织细胞吸收光谱分析法。②荧光分析法。③放射自显影术。
一、组织化学发展简史
组织化学是在组织学和化学的基础上发 展起来的，它的历史相当悠久。早在十九世 纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开 始观察组织中的化学反应。如法国植物学家 F.V.Raspail（1826）介绍了植物花和果受精 过程中的碘淀粉反应；M. Perls（1867）用 普鲁士蓝显示出铁；A.N.F. Millon(1844)叙述 了蛋白质反应； R. Fürnrohr（1850）论述了 纤维素的氯锌碘法；
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1. 组织化学的要求 组织化学是建立在组织细胞形态学、生物物
理学、生物化学及分子生物学学科基础上的一门 边缘学科，因此组织化学研究具有如下要求： （1）要求形态结构真实完整。 （2）பைடு நூலகம்求显色全过程均属于化学反应。 （3）要求化学反应在组织细胞的原位被显示 （4）要求弄清化学成分与形态结构及空间的关
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3．反应物须有显色性和定量的可能性，即必须 是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、 色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度 要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关 系。
4．反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研 究和验证。
5．反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察。 6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可
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（2）原位分析法 组织细胞在器官原位上不经分离，用化学试剂与组织细胞内的某些物质
进行化学反应，最终在局部呈现有色反应，通过显微镜及其他仪器，如分光光 度计、荧光显微镜等组织细胞内的化学反应进行定位、定性和定量研究。常用 的方法包括：①组织细胞吸收光谱分析法。②荧光分析法。③放射自显影术。
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+Co2+
硫化钴（黑色） 磷酸钴
试剂配制
① 作用液
2%巴比妥钠（5，5-二乙基巴比妥钠）10ml
3%β-甘油磷酸钠10ml 2%无水氯化钙10ml
2%硫酸镁1ml
蒸馏水5ml
本液PH值为9．4。
②对照液 在上述液中用10ml蒸馏水代替3%β-甘油磷 酸钠。
染色方法 ① 将未固定的组织在恒冷切片机切片； ② 用新配制的作用液（孵育液）孵育切片，37℃，10min （切片8μm厚）； ③ 流水冲洗5min； ④ 入2%硝酸钴溶液中5min； ⑤ 蒸馏水洗； ⑥ 入0.5%的硫化氨液1min； ⑦ 蒸馏水洗； ⑧ 甘油明胶液封固。 （4）结果 硫化钴的黑色沉淀表示酶活性。
染色方法 ①未固定的新鲜组织用恒冷切片机切片； ②在孵育液中，37℃孵育切片，不同的组织孵育的时间不同； ③充分蒸馏水洗，以除去未被吸附的或未沉淀的铅； ④切片入硫化氢液10～60s； ⑤充分蒸馏水洗； ⑥在甘油明胶封固剂中封固。
对照片 在孵育液中加入0.01M氟化钠。 结果 硫化铅沉淀为黑色或棕色的沉淀
碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase , ALP）广泛存在
于机体组织，常见于具有活跃转运功能的细胞膜内，如毛细血 管及小动脉的内皮，肝内胆小管膜，肾近曲小管的刷状缘，肾 上腺、膀胱、脾脏内皮细胞以及乳腺和卵巢中。
显示碱性磷酸酶的方法有多种，最常用的是金属沉淀的钙 钴法。
Gomori-Takamatsu法
Gomori改良钙钴法
Gomori萘酚磷酸酯法
琥珀酸脱氢酶 Nachlas硝基蓝四唑法
Pearson二甲亚砜法
过氧化物酶 Graham-Karnovsky法
Vitale辣根过氧化物酶
酸性磷酸酶（Acid Phosphatase , ACP）广泛
分布于机体组织中，它主要位于溶酶体中，也有少量在 内质网中。巨噬细胞、前列腺、空肠上皮纹状缘、肝、 脾、肾及肾上腺等尤为丰富。
一.组织化学的定义
组织化学（histochemistry）技术是通过化学 或物理反应原理显示组织切片或细胞内某种化学 成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。
二.组织化学的研究概况
随着科学技术的不断发展，组织化学在近几十年来 已经得到了迅速的发展，产生了许多分支，如核酸与蛋 白质、蛋白质与氨基酸、脂类与蛋白质、碳水化合物与 粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学、电镜 组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织 化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影 技术等。因此，现代组织化学的概念已经大大的超过了 以往的范畴，无论从理论、内容、研究手段、研究范围 都比以往更广泛及更深入。
三.组织化学研究的内容
酶类、糖类、脂肪、核酸、蛋白质等
（二）酶的组织化学反应法
1． 偶氮染料法 2． 吲哚酚法 3． 金属---金属盐法 4．氧化-还原反应法 5．色素形成法
酶类
酸性磷酸酶
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
Gomori与McDonedel硫化铅法
碱性磷酸酶 Gomori-Takamatsu法
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
作用原理 试剂配制 染色方法 对照 结果
作用原理 在酸性PH值的情况下，给切片加入甘油磷酸 酯（或任何磷酸单酯），如有酸性磷酸酶，则释放磷酸酯， 后 者 与 高 浓 度 的 Pb2+ 结 合 ， 形 成 无 色 的 磷 酸 铅 ， 经 硫 化 胺 （或硫化氢）作用，磷酸铅转变为黑色硫化铅：
试剂配制
① 过碘酸氧化液 高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。此液溶后冰 箱中待用。
② Schiff液 碱性复红 1g 1N盐酸 20ml
偏重亚硫酸钠 1g 双蒸馏水 200ml
先将200ml双蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g碱性复红， 再煮沸1min。冷却至50℃加入20ml1N盐酸，待35℃时加入 2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后见稍带红色，5h之后变为 无色液体。棕色瓶内装好，封口，放入冰箱中保存待用。
有较多的方法可以显示多糖类的成分。最常用的有： 过碘酸-Schiff反应
PAS—阿尔辛蓝法
过碘酸-Schiff反应
作用原理 试剂配制 染色方法 结果 注意事项
作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用过碘酸-
Schiff反应（PAS反应）来显示。其原理是通过过碘酸的氧 化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基，与无色碱 性品红反应显示出红色。
琥珀酸脱氢酶（SDH）是属于琥珀酸氧化酶系统的
酶，也是普通的酶类之一，是三羧酸循环中一个很重要的酶。 它存在于所有有氧呼吸的细胞，其中以心肌、肾小管曲部上皮 细胞及肝细胞含量最丰富，它牢固结合于线粒体膜内，最适 PH值为7.6。此酶对固定剂很敏感，因此，要求新鲜组织低温 恒冷切片。
Nachlas硝基蓝四唑法结果 琥珀酸脱氢酶活性部位呈蓝
作用原理 试剂配制 染色方法 结果 注意事项
作用原理 在PH9.4及Ca2+存在的情况下，给切片加入甘 油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有碱性磷酸酶，则释 放磷酸酯，后者与高浓度的Ca2+结合，形成无色的磷酸 钙，经硝酸钴处理后，磷酸钙转变磷酸钴，再经硫化胺 作用，磷酸钴转变为黑色硫化钴：
甘油磷酸酯 碱性磷酸酶 磷酸酯 +Ca2+ 磷酸钙
甘油磷酸酯酸性磷酸酶磷酸酯+铅
磷酸铅
硫化铅பைடு நூலகம்
试剂配制
①孵育液 在400ml 0.05M醋酸缓冲液（PH值5.0）中加入0.53g 硝酸铅及40ml3%的β-甘油磷酸钠溶液，在37℃放置24h产生一 些沉淀物，冷却后过滤，过滤后立即使用。
②硫化氢液 用浓硫酸作用于硫化锌或硫化铁，所产生的硫化 氢气体用通过很稀的盐酸洗去气体中的杂质后，再通过50ml蒸 馏水中，每分钟通过120个气泡的速度10min即可。
紫色颗粒
Pearson二甲亚砜法结果 酶活性表现为蓝紫色沉淀
多糖类
凡化学结构上含有糖分子的物质都称多糖类。多糖类物 质分布很广，其中主要的有糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白 和糖脂类。在机体内很多组织，如肝、肌肉、消化道、呼吸 道和唾液腺的上皮粘液、甲状腺滤泡胶质、软骨基质、垂体 嗜碱性细胞、基底膜、真菌、纤维蛋白、胶原纤维和中枢神 经系统等都含有糖。
硫化钴（黑色） 磷酸钴
试剂配制
① 作用液
2%巴比妥钠（5，5-二乙基巴比妥钠）10ml
3%β-甘油磷酸钠10ml 2%无水氯化钙10ml
2%硫酸镁1ml
蒸馏水5ml
本液PH值为9．4。
②对照液 在上述液中用10ml蒸馏水代替3%β-甘油磷 酸钠。
染色方法 ① 将未固定的组织在恒冷切片机切片； ② 用新配制的作用液（孵育液）孵育切片，37℃，10min （切片8μm厚）； ③ 流水冲洗5min； ④ 入2%硝酸钴溶液中5min； ⑤ 蒸馏水洗； ⑥ 入0.5%的硫化氨液1min； ⑦ 蒸馏水洗； ⑧ 甘油明胶液封固。 （4）结果 硫化钴的黑色沉淀表示酶活性。
染色方法 ①未固定的新鲜组织用恒冷切片机切片； ②在孵育液中，37℃孵育切片，不同的组织孵育的时间不同； ③充分蒸馏水洗，以除去未被吸附的或未沉淀的铅； ④切片入硫化氢液10～60s； ⑤充分蒸馏水洗； ⑥在甘油明胶封固剂中封固。
对照片 在孵育液中加入0.01M氟化钠。 结果 硫化铅沉淀为黑色或棕色的沉淀
碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase , ALP）广泛存在
于机体组织，常见于具有活跃转运功能的细胞膜内，如毛细血 管及小动脉的内皮，肝内胆小管膜，肾近曲小管的刷状缘，肾 上腺、膀胱、脾脏内皮细胞以及乳腺和卵巢中。
显示碱性磷酸酶的方法有多种，最常用的是金属沉淀的钙 钴法。
Gomori-Takamatsu法
Gomori改良钙钴法
Gomori萘酚磷酸酯法
琥珀酸脱氢酶 Nachlas硝基蓝四唑法
Pearson二甲亚砜法
过氧化物酶 Graham-Karnovsky法
Vitale辣根过氧化物酶
酸性磷酸酶（Acid Phosphatase , ACP）广泛
分布于机体组织中，它主要位于溶酶体中，也有少量在 内质网中。巨噬细胞、前列腺、空肠上皮纹状缘、肝、 脾、肾及肾上腺等尤为丰富。
一.组织化学的定义
组织化学（histochemistry）技术是通过化学 或物理反应原理显示组织切片或细胞内某种化学 成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。
二.组织化学的研究概况
随着科学技术的不断发展，组织化学在近几十年来 已经得到了迅速的发展，产生了许多分支，如核酸与蛋 白质、蛋白质与氨基酸、脂类与蛋白质、碳水化合物与 粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学、电镜 组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织 化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影 技术等。因此，现代组织化学的概念已经大大的超过了 以往的范畴，无论从理论、内容、研究手段、研究范围 都比以往更广泛及更深入。
三.组织化学研究的内容
酶类、糖类、脂肪、核酸、蛋白质等
（二）酶的组织化学反应法
1． 偶氮染料法 2． 吲哚酚法 3． 金属---金属盐法 4．氧化-还原反应法 5．色素形成法
酶类
酸性磷酸酶
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
Gomori与McDonedel硫化铅法
碱性磷酸酶 Gomori-Takamatsu法
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
作用原理 试剂配制 染色方法 对照 结果
作用原理 在酸性PH值的情况下，给切片加入甘油磷酸 酯（或任何磷酸单酯），如有酸性磷酸酶，则释放磷酸酯， 后 者 与 高 浓 度 的 Pb2+ 结 合 ， 形 成 无 色 的 磷 酸 铅 ， 经 硫 化 胺 （或硫化氢）作用，磷酸铅转变为黑色硫化铅：
试剂配制
① 过碘酸氧化液 高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。此液溶后冰 箱中待用。
② Schiff液 碱性复红 1g 1N盐酸 20ml
偏重亚硫酸钠 1g 双蒸馏水 200ml
先将200ml双蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g碱性复红， 再煮沸1min。冷却至50℃加入20ml1N盐酸，待35℃时加入 2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后见稍带红色，5h之后变为 无色液体。棕色瓶内装好，封口，放入冰箱中保存待用。
有较多的方法可以显示多糖类的成分。最常用的有： 过碘酸-Schiff反应
PAS—阿尔辛蓝法
过碘酸-Schiff反应
作用原理 试剂配制 染色方法 结果 注意事项
作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用过碘酸-
Schiff反应（PAS反应）来显示。其原理是通过过碘酸的氧 化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基，与无色碱 性品红反应显示出红色。
琥珀酸脱氢酶（SDH）是属于琥珀酸氧化酶系统的
酶，也是普通的酶类之一，是三羧酸循环中一个很重要的酶。 它存在于所有有氧呼吸的细胞，其中以心肌、肾小管曲部上皮 细胞及肝细胞含量最丰富，它牢固结合于线粒体膜内，最适 PH值为7.6。此酶对固定剂很敏感，因此，要求新鲜组织低温 恒冷切片。
Nachlas硝基蓝四唑法结果 琥珀酸脱氢酶活性部位呈蓝
作用原理 试剂配制 染色方法 结果 注意事项
作用原理 在PH9.4及Ca2+存在的情况下，给切片加入甘 油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有碱性磷酸酶，则释 放磷酸酯，后者与高浓度的Ca2+结合，形成无色的磷酸 钙，经硝酸钴处理后，磷酸钙转变磷酸钴，再经硫化胺 作用，磷酸钴转变为黑色硫化钴：
甘油磷酸酯 碱性磷酸酶 磷酸酯 +Ca2+ 磷酸钙
甘油磷酸酯酸性磷酸酶磷酸酯+铅
磷酸铅
硫化铅பைடு நூலகம்
试剂配制
①孵育液 在400ml 0.05M醋酸缓冲液（PH值5.0）中加入0.53g 硝酸铅及40ml3%的β-甘油磷酸钠溶液，在37℃放置24h产生一 些沉淀物，冷却后过滤，过滤后立即使用。
②硫化氢液 用浓硫酸作用于硫化锌或硫化铁，所产生的硫化 氢气体用通过很稀的盐酸洗去气体中的杂质后，再通过50ml蒸 馏水中，每分钟通过120个气泡的速度10min即可。
紫色颗粒
Pearson二甲亚砜法结果 酶活性表现为蓝紫色沉淀
多糖类
凡化学结构上含有糖分子的物质都称多糖类。多糖类物 质分布很广，其中主要的有糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白 和糖脂类。在机体内很多组织，如肝、肌肉、消化道、呼吸 道和唾液腺的上皮粘液、甲状腺滤泡胶质、软骨基质、垂体 嗜碱性细胞、基底膜、真菌、纤维蛋白、胶原纤维和中枢神 经系统等都含有糖。