第二十二章厌氧性细菌及检验
一、概述
（一）概念
厌氧性细菌是一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。（二）厌氧菌的分类
主要厌氧菌的分类见表5-22-1。
二、厌氧菌感染
（一）厌氧菌在正常人体的分布
厌氧菌在人体的分布非常广泛，正常人的肠道、口腔、阴道等处均有大量的厌氧菌寄居。厌氧菌与需氧菌和兼性厌氧菌共同组成人体的正常菌群，其中绝大多数为无芽胞厌氧菌。其中肠道中的厌氧菌数量是大肠埃希菌的1000～10000倍。
在人体肠道正常菌群中占绝对优势的有
A.双歧杆菌
B.伤寒沙门菌
C.大肠杆菌
D.变形杆菌
E.无芽胞厌氧菌
『正确答案』E
（二）临床意义
1.外源性感染：梭状芽胞杆菌属引起的感染，其细菌及芽胞来源于土壤、粪便和其他外界环境。少数致病菌能产生强烈外毒素和侵袭性酶，引起人和动物疾病。
2.内源性感染：无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。
由厌氧菌引起的人类感染在所有的感染性疾病中占有相当大的比例，有些部位的感染如脑脓肿、牙周脓肿和盆腔脓肿等80%以上是由厌氧菌引起的。其中部分系厌氧菌单独感染，大部分系与需氧菌混合感染。
3.厌氧菌感染的危险因素
1）组织缺氧或氧化还原电势降低，如组织供血障碍、大面积外伤、刺伤。
2）机体免疫功能下降，如接受免疫抑制剂治疗、抗代谢药物治疗、放射治疗、化学药物治疗的病人以及糖尿病患者、慢性肝炎患者、老年人、早产儿等均易并发厌氧菌感染。
3）机体局部屏障作用破坏：某些手术及创伤，如开放性骨折、胃肠道手术、生殖道手术以及深部刺伤等易发生厌氧菌感染。
4）长期应用某些抗菌药物，如氨基糖苷类、头孢菌素类、四环素类等，可诱发厌氧菌感染。
5）深部需氧菌感染，需氧菌生长可消耗环境中的氧气，为厌氧菌生长提供条件，从而导致厌氧菌合并感染。
4.厌氧菌感染的临床及细胞学指征
1）感染组织局部产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发感，是产气荚膜梭菌所引起感染的特征。
2）发生在口腔、肠道、鼻咽腔、阴道等处的感染，易发生厌氧感染。
3）深部外伤如枪伤后，以及动物咬伤后的继发感染，均可能是厌氧菌感染。
4）分泌物有恶臭或呈暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。产生红色荧光的分泌物，可能是产黑素普雷沃菌或不解糖紫单胞菌；分泌物或脓肿有硫磺颗粒，为放线菌感染。
5）分泌物涂片经革兰染色，镜检发现有细菌，而培养阴性者，或在液体及半固体培养基深部生长的细菌，均可能为厌氧菌感染。
6）长期应用氨基糖苷类抗生素无效的病例，可能是厌氧菌感染。
7）胃肠道手术后发生的感染。
三、厌氧菌标本的采集与送检
标本采集与送检必须注意两点：标本绝对不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。
1.采集：采集标本须注意：不被正常菌群污染，并尽量避免接触空气。采集深部组织标本时，需用碘酒消毒皮肤用注射器抽取，穿刺针头应准确插入病变部位深部，抽取数毫升即可，抽出后可排出一滴标本于酒精棉球上。若病灶处标本量较少，则可先用注射器吸取1ml还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。在紧急情况下，可用棉拭取材，并用适合的培养基转送。厌氧培养最理想的检查材料是组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长。
用于厌氧菌培养的标本不同于一般的细菌培养，多采用特殊的采集方法，如针筒抽取等，应严格无菌操作，严禁接触空气。
不同部位标本采集方法也各有不同特点，具体方法见表5-22-3。
表5-22-3不同部位标本采集方法
哪些标本不符合厌氧菌检验要求
A.血
B.咽拭子
C.深部脓肿穿刺液
D.牙周脓肿穿刺液
E.膀胱穿刺液
[答疑编号500735220102]
『正确答案』B
2.送检方法与处理
标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2h，以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，可将标本置室温保存（一般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶解度较高）。
1）针筒运送：一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无菌橡皮塞，以隔绝空气，立即送检。这种方法多用于液体标本的运送，如血液、脓液、胸腹水、关节液等。
2）无菌小瓶运送：一般采用无菌的青霉素小瓶，瓶内加一定量的培养基和少量氧化还原指示剂，用橡皮盖加铝盖固定密封，排除瓶内空气，充以C0 2气体。同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。
3）棉拭子运送一般不采用棉拭子运送，如果使用该方法，一定使用特制运送培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。
4）厌氧罐或厌氧袋运送将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧气的物质，确保无氧环境。该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。
四、厌氧菌的分离与鉴定
检验程序：
（一）直接镜检>
根据形态和染色性，结合标本性状与气味，初步对标本中可能有的细菌作出估计。
表5-22-4 厌氧菌直接镜检初步鉴别
c：coccus，球菌；b：bacillus，杆菌。
（二）分离培养
主要分初代培养和次代培养两个阶段，其中初代培养相对比较困难，关键的问题就是厌氧环境和培养基的选择。初代培养的一般原则是：
（1）先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择。
（2）尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基。
（3）最好多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基。
（4）尽量保证培养基新鲜。
（5）要考虑到微需氧菌存在的可能。
1.选用适当的培养基接种：应接种固体和液体两种培养基；
（1）培养基的使用，应注意下列各点：
1）尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；
2）应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；
3）可采用预还原灭菌法制作的培养基（用前于培养基中加入还原剂，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等，尽可能使预还原剂处于还原状态）；
4）液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种；
5）培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子（血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等）。
（2）培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。
1）非选择培养基：本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。常使用心脑浸液琼脂（BHI）、布氏琼脂（BR）、胰豆胨肝粉琼脂（GAM）、胰胨酵母琼脂（EG）、CDC厌氧血琼脂等。
2）选择培养基：为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。
2.每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10%C02环境中培养，以便正确地培养出病原菌，从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。
3.厌氧培养法
（1）厌氧罐培养法。
（2）气袋法。
（3）气体喷射法：又称转管法。
（4）厌氧手套箱培养法：是迄今厌氧菌培养的最佳仪器之一。
（5）其他培养法：平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。
4.厌氧状态的指示：美蓝和刃天青。无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。
5.分离培养厌氧菌失败的原因：①培养前未直接涂片和染色镜检；②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；③未用新鲜配制的培养基；④未用选择培养基；⑤培养基未加必要的补充物质；⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为唯一厌氧菌培养基；⑦无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气；⑧催化剂失活；⑨培养时间不足；⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。
分离培养厌氧菌失败的原因可能是
A.厌氧装置的催化剂失活
B.标本在空气中放置过久
C.培养基不是新鲜配置
D.培养基成分不合适
E.以上均是
[答疑编号500735220103]
『正确答案』E
6.鉴定试验：可根据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最终鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等项检查。
（1）形态与染色：可为厌氧菌的鉴定提供参考依据。
（2）菌落性状：不同的厌氧菌其菌落形态和性质不同。梭菌的菌落特点是形状不规则的，而无芽胞厌氧菌多呈单个的圆形小菌落。色素、溶血特点以及在紫外线下产生荧光的情况也可以作为厌氧菌鉴定的参考依据。
（3）抗生素敏感性鉴定试验：常用的抗生素有卡那霉素及甲硝唑。卡那霉素可用于梭杆菌属与类杆菌属的区分。甲硝唑用于厌氧菌与非厌氧菌的区分。
（4）生化特性：主要包括多种糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酸酶试验、蛋白溶解试验、明胶液化试验、胆汁肉汤生长试验以及硫化氢试验等。目前有多种商品化的鉴定系统可以使用。
（5）气液相色谱：可以利用该技术来分析厌氧菌的终末代谢产物，已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法。
五、常见厌氧菌
（一）破伤风杆菌
1.生物学性状
（1）形态与染色：本菌细长，有周鞭毛，无荚膜。芽胞在菌体顶端，呈圆形，使整个细菌体呈鼓槌状。早期培养物为革兰阳性，培养48小时后，尤其是芽胞形成后，易转变为革兰阴性。
（2）培养特性：为专性厌氧菌，在普通培养基上不易生长。可在血平板上生长，37℃48小时形成扁平、灰白色、半透明、边缘不齐的菌落。
（3）生化反应：本菌一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，多数菌株吲哚阳性，不还原硝酸盐，对蛋白质有微弱的消化作用。
（4）抗原构造：本菌有菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原。
（5）抵抗力：繁殖体的抵抗力与其他细菌相似，但芽胞体抵抗力非常强，在干燥的土壤和尘埃中可存活数十年。
2.微生物学检查：破伤风的临床表现典型，根据临床症状即可作出诊断，所以一般不做细菌学检查。
（1）特殊需要时，可从病灶处取标本涂片，革兰染色镜检。
（2）需要培养时，将标本接种疱肉培养基培养。
（3）也可进行动物试验。
3.临床意义：>本菌可引起人类破伤风，对人的致病因素主要是它产生的外毒素。细菌不入血，但在感染组织内繁殖并产生毒素，其毒素人血引起相应的临床表现，本菌产生的毒素对中枢神经系统有特殊的亲和力。主要症状为骨骼肌痉挛。典型的临床症状为咀嚼肌痉挛造成的牙关紧闭、呈苦笑面容，以及颈部、躯干及四肢肌肉持续强直性痉挛导致的角弓反张，呼吸困难，终因窒息死亡。
4.治疗原则
（1）正确处理创口，包括清创、扩创等，防止厌氧微环境。
（2）可以尽早注射破伤风抗毒素，也可同时给予类毒素。在注射抗毒素前应做皮试。
（3）采用四环素、红霉素等进行抗感染治疗。
（二）产气荚膜梭菌
1.生物学性状
（1）形态与染色：产气荚膜梭菌为革兰阳性粗大杆菌，芽胞呈椭圆型，位于次极端。体内不形成芽胞，在体外培养也很少形成芽胞，只有在无糖培养基上方可形成。在机体内可形成明显的荚膜。
（2）培养特性：厌氧但不十分严格。20℃～50℃均能旺盛生长，最适温度为45℃。在血平板上，多数菌株有双层溶血环。本菌代谢活跃，可分解多种糖类，产酸产气，能液化明胶，在疱肉培养基中，可分解肉渣中的糖类而产生大量气体。在牛乳培养基中能分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，出现“汹涌发酵”现象。
（3）分型：根据其产生的毒素，大体可将产气荚膜梭菌分成5个型别（A、B、C、D、E），对人类致病的主要为A型。
2.微生物学检查
（1）直接涂片镜检：在创口深部取材涂片，革兰染色镜检，这是极有价值的快速诊断方法。
（2）分离培养及鉴定：可取坏死组织制成悬液，接种血平板或疱肉培养基中，厌氧培养，取培养物涂片镜检，利用生化反应进行鉴定。
3.临床意义：本菌可产生外毒素及多种侵袭酶类，外毒素以α毒素为主，本质为卵磷脂酶；还可产生透明质酸酶、DNA酶等。本菌主要可引起气性坏疽及食物中毒等，气性坏疽多见于战伤，也可见于工伤造成的大面积开放性骨折及软组织损伤等。病人表现为局部组织剧烈胀痛，局部严重水肿，水气夹杂，触摸有捻发感，并产生恶臭。病变蔓延迅速，可引起毒血症、休克甚至死亡。某些A型菌株产生的肠毒素，可引起食物中毒，病人表现为腹痛、腹泻，1～2天可自愈。
4.治疗原则：对感染局部应及时处理，包括扩创，冲洗，切除坏死组织。尽早使用多价抗毒素血清，同时用大剂量青霉素杀灭病原菌。青霉素为首选抗生素，万古霉素为次选抗生素。
（三）肉毒梭菌
1.生物学性状：肉毒梭菌为革兰阳性短粗杆菌，芽胞呈椭圆型，粗于菌体，位于次极端，使细菌呈汤匙状或网球拍状。严格厌氧，可在普通琼脂平板和血平板上生长。根据所产生毒素的抗原性不同，肉毒梭菌可分为8个型，引起人类疾病的以A、B型最为常见。肉毒梭菌芽胞体抵抗力很强。肉毒毒素对酸的抵抗力比较强，可在胃液24小时不被破坏，可被胃吸收。但肉毒毒素不耐热，煮沸1分钟即可被破坏。肉毒毒素的毒性比氰化钾强1万倍，是已知最剧烈的毒素，对人的致死量为0.1～1.Oμg。
2.临床意义：本菌主要可引起食物中毒，属单纯性毒性中毒，并非细菌感染。临床表现与其他食物中毒不同，胃肠症状很少见，主要表现为某些部位的肌肉麻痹，重者可死于呼吸困难与衰竭。本菌还可以引起婴儿肉毒病，一岁以下婴儿肠道内缺乏拮抗肉毒梭菌的正常菌群，可因食用被肉毒梭菌芽胞污染的食品后，芽胞在盲肠部位定居，繁殖后产生毒素，引起中毒
3.微生物学检查
（1）分离培养与鉴定：在怀疑为婴儿肉毒病的粪便中检出本菌，并证实其是否产生毒素，诊断意义较大。
（2）毒素检测：可取培养滤液或悬液上清注射小鼠腹腔，观察动物出现的中毒症状。
4.治疗原则：尽早诊断，迅速注射A、B、E三型多价抗毒素，同时进行对症治疗。
（四）艰难梭菌
1.生物学性状：为革兰阳性粗长杆菌，有鞭毛，次极端有卵圆形芽胞。芽胞可在外环境存活数周至数月，分离困难，需要特殊培养基。
2.微生物学检查：由于本菌的分离培养困难，所以在临床上一般不采用分离培养病原菌的方法，可通过临床表现及细胞毒素试验阳性检测来进行诊断。在CCFA平板上的菌落，黄色，粗糙型，脂酶，卵磷脂酶
阴性。在紫外线照射下呈黄绿色荧光。
3.临床意义本菌可产生A、B两种毒素，毒素A为肠毒素，可使肠壁出现炎症，细胞侵润，肠壁通透性增加，出血及坏死。毒素B为细胞毒素，损害细胞骨架，致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞，因而导致腹泻及假膜形成。本菌感染与大量使用抗生素有关，如阿莫西林、头孢菌素和克林霉素等，其中以克林霉素尤为常见。艰难梭菌所致伪膜性肠炎，病人表现为发热、粪便呈水样，其中可出现大量白细胞，重症患者的水样便中可出现地图样或斑片状假膜。这些症状一般可在使用有关抗生素一周后突然出现。
4.治疗原则：及时调整或停止相关抗生素的使用，尤其是那些广谱抗生素。可以用万古霉素加甲硝唑进行抗感染治疗。
六、无芽胞厌氧菌
（一）主要种类及生物学性状
无芽胞厌氧菌共有23个属，与人类疾病相关的主要有10个属。见表5-22-5：
1.革兰阴性厌氧杆菌有8个属，类杆菌属中的脆弱类杆菌最为重要。形态呈多形性，有荚膜。除类杆菌在培养基上生长迅速外，其余均生长缓慢。
2.革兰阴性厌氧菌有3个属，其中以韦荣菌属最重要。为咽喉部主要厌氧菌，但在临床厌氧菌分离标本中，分离率小于1%，且为混合感染菌之一。其他革兰阴性球菌极少分离到。
3.革兰阳性厌氧菌有5个属，其中有临床意义的是消化链球菌属，主要寄居在阴道。本菌属细菌生长缓慢，培养需5～7天。
4.革兰阳性厌氧杆菌有7个属，其中以下列3个属为主：
（1）丙酸杆菌属：小杆菌，无鞭毛，能在普通培养基上生长，需要2～5天，与人类有关的有3个种，以痤疮丙酸杆菌最为常见。
表5-22-5与人类相关的主要无芽胞厌氧菌
（2）双歧杆菌：呈多形性，有分枝，无动力，严格厌氧，耐酸。29个种中有10个种与人类有关，其中只有齿双歧杆菌与龋齿和牙周炎有关。其他种极少从临床标本中分离到。
（3）优杆菌属：单一形态或多形态，动力不定，严格厌氧，生化反应活泼，生长缓慢，常需培养7天，最常见的是迟钝优杆菌。
（二）微生物学检查
要从感染灶深部采取标本。最好是切取感染灶组织或活检标本，立即送检。
1.直接涂片镜检：将采集的标本直接涂片染色镜检，观察细菌形态、染色及菌量，为进一步培养以及初步诊断提供依据。
2.分离培养与鉴定：分离培养是鉴定无芽胞厌氧菌感染的关键步骤。标本应立即接种相应的培养基，
最常用的培养基是以牛心脑浸液为基础的血平板。置37℃厌氧培养2～3天，如无菌生长，继续培养1周。如有菌生长则进一步利用有氧和无氧环境分别传代培养，证实为专性厌氧菌后，再经生化反应进行鉴定。
（三）临床意义
无芽胞厌氧菌是一大类寄生于人体的正常菌群，引起的感染均为内源性感染，在一定的致病条件下，可引起多种人类感染。所致疾病有：
1.败血症：主要由脆弱类杆菌引起，其次为革兰阳性厌氧球菌。
2.中枢神经系统感染：主要由革兰阴性厌氧杆菌引起，常可引起脑脓肿。
3.口腔与牙齿感染：主要由消化链球菌、产黑素类杆菌等引起。
4.呼吸道感染：主要由普雷沃菌属、坏死梭杆菌、核梭杆菌、消化链球菌和脆弱类杆菌。
5.腹部和会阴部感染：主要由脆弱类杆菌引起。
6.女性生殖道感染：主要由消化链球菌属、普雷沃菌属和卟啉单胞菌等引起。
7.其他：无芽胞厌氧菌尚可引起皮肤和软组织感染、心内膜炎等。
（四）治疗原则
1.正确处理感染灶，包括清洗伤口，去除坏死组织和异物、引流等。
2.合理使用抗生素进行抗感染治疗。
本章练习题：
厌氧芽胞梭菌常大量存在于
A.口腔
B.皮肤
C.泌尿生殖道
D.肠道
E.土壤
[答疑编号500735220201]
『正确答案』DE
艰难梭菌的生物学性状描述错误的是
A.革兰阳性大杆菌
B.无鞭毛和荚膜
C.无芽胞
D.抵抗力弱
E.分离困难，需特殊培养基
[答疑编号500735220202]
『正确答案』BCD
无芽胞厌氧菌可致疾病有
A.败血症
B.盆腔炎
C.腹部脓肿
D.牙周脓肿
E.心内膜炎
[答疑编号500735220203]
『正确答案』ABCDE
女性，44岁，因肛裂引起直肠与会阴部瘘管，取瘘管脓性分泌物直接涂片检查为革兰阴性杆菌，但未分离出病原菌
应做进一步的细菌学检查是
A.标本用厌氧方法培养
B.标本用普通方法培养
C.标本用高渗培养基培养
D.标本在5%-10%二氧化碳中培养
E.标本用SS琼脂平板培养
[答疑编号500735220204]
『正确答案』A
采集与送检标本时应注意
A.室温放置一段时间后再接种培养基
B.冰箱放置一段时间后再接种培养基
C.立即放入厌氧标本收集瓶中，迅速送检
D.37℃放置一段时间后再接种厌氧培养基
E.22℃放置一段时间后再接种厌氧培养基
[答疑编号500735220205]
『正确答案』C
标本最适合接种的培养基是
A.巧克力琼脂平板
B.含牛心脑浸液的血平板
C.沙保弱培养基
D.碱性蛋白胨水培养基
E.尿素培养基
[答疑编号500735220206]
『正确答案』B
该患者感染的细菌最有可能的是
A.肠道无芽胞厌氧菌
B.破伤风梭菌
C.大肠埃希菌
D.产气荚膜梭菌
E.艰难梭菌
[答疑编号500735220207]
『正确答案』A
可用抗毒素进行紧急预防的疾病是
A.破伤风
B.斑疹伤寒
C.麻风
D.肠热症
E.梅毒
[答疑编号500735220208]
『正确答案』A
下列细菌除哪种外，均能产生肠毒素
A.白喉棒状杆菌
B.霍乱弧菌
C.大肠埃希菌
D.产气荚膜梭菌
E.金黄色葡萄球菌
[答疑编号500735220209]
『正确答案』A
汹涌发酵现象可鉴定
A.炭疽芽孢杆菌
B.艰难梭菌
C.肉毒梭菌
D.产气荚膜梭菌
E.破伤风梭菌
[答疑编号500735220210]
『正确答案』D
破伤风的紧急预防应注射
A.破伤风减毒活疫苗
B.破伤风类毒素
C.百白破三联疫苗
D.破伤风抗毒素
E.丙种球蛋白
[答疑编号500735220211]
『正确答案』D
破伤风的特异治疗可用
A.破伤风减毒活疫苗
B.抗生素
C.百白破三联疫苗
D.破伤风抗毒素
E.细菌素
[答疑编号500735220212]
『正确答案』D
引起牙周脓肿常见的病原菌
A.铜绿假单胞菌
B.表皮葡萄球菌
C.大肠埃希菌
D.消化链球菌
E.甲型溶血性链球菌
[答疑编号500735220213]
『正确答案』D
关于破伤风的叙述，正确的是
A.属于兼性厌氧菌
B.革兰阴性细菌
C.外毒素致病
D.可引起败血症
E.可导致肌肉迟缓麻痹
[答疑编号500735220214]
『正确答案』C
肉毒梭菌引起的食物中毒是以
A.消化系统症状为主
B.呼吸系统症状为主
C.泌尿系统症状为主
D.神经系统症状为主
E.循环系统症状为主
[答疑编号500735220215]
『正确答案』D
可疑肉毒中毒的患者，采集的标本为
A.血液
B.粪便
C.伤口渗出液
D.吃剩的食物
E.尿液
[答疑编号500735220216]
『正确答案』B
第二十三章需氧或兼性厌氧革兰阳性杆菌及检验
本章考点：
1.概述：概念
2.棒状杆菌属（白喉棒状杆菌）、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、产单核李斯特菌
●生物学性状
●临床意义
●微生物学检查
常见的与临床有关的需氧革兰阳性杆菌有棒状杆菌属、芽胞杆菌属、李斯特菌属、丹毒丝菌属、加特纳菌属。上述菌属的主要区别见表5-23-1。
表5-23-1 革兰阳性杆菌属的鉴别
一、棒状杆菌属
（一）简述：
棒状杆菌属是①一群革兰阳性杆菌，菌体粗细、长短不一，一端或两端膨大呈棒状.故名棒状杆菌。②本菌着色不匀，有异染颗粒。③无鞭毛、无荚膜、无芽胞。（无特殊结构）④需氧，⑤营养要求较高，能分解一些糖类，产酸不产气。本属细菌种类较多，有白喉棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、干燥棒状杆菌、溃疡棒状杆菌等。引起人类致病的主要是白喉棒状杆菌，棒状杆菌除白喉棒状杆菌外，其余统称为类白喉棒状杆菌，大多数为条件致病菌。
（二）白喉棒状杆菌
1.生物学特征
（1）形态与染色：菌体细长微弯，一端或两端膨大的革兰阳性杆菌，大小为（2～5）μm×（0.5～1.0）μm。无荚膜、无芽胞、无鞭毛、无菌毛。细菌排列呈散在L、V、Y字形及不规则栅栏状。
染色特点：在细菌的一端或两端有浓染的颗粒，和菌体着色不均匀，称为异染颗粒，这是白喉棒状杆菌的形态学特征，对鉴别细菌有重要意义。
美蓝染色菌体着色不均匀，呈现着色深浅相间的节段或着色较深的颗粒；
Neisser（奈瑟）染色，菌体染成黄褐色，颗粒被染成紫黑色；
Albert（阿培特）染色，菌体呈蓝绿色，异染颗粒蓝黑色。
（2）培养特性：需氧或兼性厌氧，生长最适温度为35℃～37℃，pH为7.2～7.8。营养要求高，常用下列培养基进行分离培养。
1）血液琼脂平板：灰白色S型菌落，有狭窄的β溶血环。
2）吕氏（Loeffler）血清斜面培养基：生长迅速，10～18h形成灰白色、湿润、S型菌落。涂片染色形态典型，异染颗粒明显。
3）亚碲酸钾血琼脂：本菌能在亚碲酸盐琼脂平板上能还原碲盐为元素碲，使菌落呈黑色。可作为鉴别依据。
4）液体培养基：除重型白喉杆菌形成菌膜和沉淀外，其他为浑浊生长。
（3）生化反应：本菌触酶试验阳性，氧化酶试验阴性。能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖，产酸不产气。不分解乳糖，极少分解蔗糖。能还原硝酸盐，不液化明胶，不产生吲哚，不分解尿素。
根据亚碲酸钾血琼脂培养基、肉汤培养基的生长特点及生化反应，可将本菌分为轻、中、重三型。在我国以轻型多见。分型与所致疾病的严重程度无关，可用于流行病学调查。
2.致病性
致病物质：白喉杆菌的致病因素为白喉外毒素，抗原性强，毒性剧烈。K抗原（表面抗原）及索状因子亦与其致病力有关。
临床意义：白喉棒状杆菌可引起人类白喉，白喉是一种急性呼吸道传染病。该病原菌存在于患者及带菌者的鼻咽腔中，随飞沫或污染的物品传播。白喉棒状杆菌可致气管、支气管假膜，是白喉早期死亡的主要原因。菌一般不侵入血流，但其产生的大量外毒素可吸收人血，引起毒血症。毒素能与敏感的心肌、肝、肾、肾上腺等组织细胞及外周神经，尤其与支配咽肌和腭肌的神经结合，引起细胞变性、坏死、内脏出血和神经麻痹等严重损害，是白喉晚期死亡的主要原因。
白喉棒状杆菌引起白喉，多在秋冬季节流行。以咽白喉最常见，喉白喉及鼻白喉次之，偶亦引起眼结膜、外耳道、阴道及皮肤的局部病变。
免疫性：白喉的免疫主要是抗毒素免疫，同时巨噬细胞吞噬消化能力也加强。
调查人群在感染或计划免疫后对白喉是否产生免疫力，可用锡克试验或致敏红细胞凝集试验。
3.微生物学检验
（1）标本采集：用无菌长棉拭子，从可疑的伪膜边缘采集分泌物，未见伪膜的疑似患者或带菌者可采集鼻咽部或扁桃体黏膜上的分泌物。若为培养，应在使用抗生素或其他抗菌药物前采集双份标本。如不能立即送检，应将标本浸于无菌生理盐水或15%甘油盐水中保存。
（2）检验方法及鉴定
1）直接镜检：将标本涂于2～3张载玻片上，分别作革兰染色和异染颗粒染色（奈瑟法或阿培特法）。镜检如见革兰阳性形态典型的棒状杆菌，并有明显的异染颗粒，可初步报告“检出形似白喉棒状杆菌”。
2）分离培养：将另一份标本接种下列培养基。①吕氏血清斜面：本菌在此培养基上生长较标本中的杂菌迅速，于35℃培养8～12h后，即形成灰白色的菌落，而其他杂菌则尚未形成菌落。本菌在甘油吕氏血清斜面上形成的异染颗粒更为明显；②亚碲酸钾血琼脂平板：经35℃培养24～48h，观察菌落特点。在此培养基上，大部分杂菌被抑制，白喉杆菌则生长缓慢，故应结合吕氏血清斜面培养基进行观察。
（3）生化反应：主要用于鉴别白喉棒状杆菌与类白喉棒状杆菌。尿素分解试验：白喉棒状杆菌（-），类白喉棒状杆菌（+）。
（4）毒力试验：可作为鉴定致病菌株的重要依据。试验方法分体外法和体内法两大类。体外法有双向琼脂扩散法（作琼脂平板毒力试验，Elek平板毒力测定）、SPA协同凝集试验、对流免疫电泳；体内法可用豚鼠作毒素中和试验。
5.治疗原则：用青霉素或红霉素等进行抗感染治疗，同时应尽早注射足量白喉抗毒素。注射抗毒索前，应做皮试。
（二）其他棒状杆菌
棒状杆菌除白喉棒状杆菌外，其余统称为类白喉棒状杆菌。此类细菌种类多，一般无致病性或仅能与其他化脓细菌产生混合感染，有的可能为条件致病菌。类白喉棒状杆菌常寄生于人类或动物鼻腔、咽喉、外耳道、眼结膜、外阴及皮肤表面等处。临床标本中较常见的类白喉杆菌有溃疡棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、干燥棒状杆菌、溶血棒状杆菌、化脓棒状杆菌等。
二、芽胞杆菌属
芽胞杆菌属是①一大群需氧，能产生芽胞的革兰阳性大杆菌。②大多数菌种在有氧环境下形成芽胞。
③有动力（除炭疽芽胞杆菌），④非抗酸性，⑤营养要求不高。
它们广泛分布于空气、土壤、尘埃及腐烂物中，绝大多数为腐生菌，许多菌种成为实验室等环境的污染菌。少数寄生于动物或昆虫并对人类及动物致病，其中炭疽杆菌是人畜共患的重要致病菌，蜡样芽胞杆菌能致食物中毒。
（一）炭疽芽胞杆菌
炭疽芽胞杆菌主要引起食草动物患炭疽病，也可经一定途径感染人类，为人畜共患的急性传染病。
1.生物学特性
（1）形态与染色：是致病菌中最大的革兰阳性杆菌，约（5～10）μm×（1～3）μm。两端齐平，呈竹节状。在组织内生长呈单个或短链，试管内可形成长链，无鞭毛，机体内或含血清培养基上可形成荚膜。人工培养或在外界环境中易产生芽胞，形状椭圆，位于菌体中央，其直径小于菌体。
（2）培养特性：专性需氧，在普通培养基上生长良好。生长适温35℃～37℃，pH7.0～7.4。
在普通琼脂平板上经37℃，18～24h培养后，形成灰白色、不透明、无光泽、边缘不整齐、大而扁平的粗糙型菌落，在低倍镜下观察，呈卷发状。
在血液琼脂平板上，35℃培养24h后出现轻微溶血。
在普通肉汤中培养后，管底有絮状卷绕成团的沉淀物生长，表面稍混但不形成菌膜，中层肉汤清亮。
有毒株在碳酸氢钠琼脂平板上，置于5%C02环境中37℃培养24h后，形成粘稠、有光泽的粘液型（M型）菌落，这是有荚膜的菌体构成的。无毒株的菌落仍保持粗糙型（R型）。
（3）生化反应：本菌能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。能水解淀粉，不分解乳糖，不产生靛基质及H2S。能迟缓液化明胶，沿穿刺线向四周扩散，形如倒松树状。触酶阳性。
（4）抗原构造：抗原包括①菌体多糖抗原；②荚膜多肽抗原；③芽胞抗原；④炭疽毒素抗原。
（5）本菌芽胞体抵抗力很强，煮沸10min或干热140℃ 3h，高压蒸气121.3℃，15min才能杀灭。在干燥土壤或皮毛中常温下可存活数十年。一般对碘及氧化剂较敏感。
2.致病性：炭疽的两个毒力因子-荚膜和炭疽毒素。炭疽毒素是致死的主要因素。
炭疽芽胞杆菌可经皮肤、呼吸道和胃肠道侵入机体引起炭疽病。临床类型有皮肤炭疽、肺炭疽、肠炭疽，病死率很高。
免疫性：病后可获得持久性免疫力，再感染者少见。主要是产生特异性抗体和吞噬细胞的吞噬作用加强所致
3.微生物学检查
（1）标本采集：皮肤炭疽取病灶分泌物；肺炭疽采取痰液；肠炭疽采取粪便；炭疽脑膜炎采取脑脊液；各型炭疽均可采取血液。
（2）检验方法及鉴定：炭疽杆菌的检查要特别注意芽胞型的实验室感染，故应有专门防护的实验室，并对用过的器具、检材等进行严格的消毒处理。
1）直接镜检：将可疑材料涂片，组织标本可作压印片，用1：1000的升汞固定5min，再行革兰染色和荚膜染色。镜检发现有荚膜的革兰阳性竹节状大杆菌，可初步诊断。荚膜荧光抗体染色，链状或竹节状大杆菌周围有发荧光的荚膜者为阳性。
2）分离培养：一般标本接种血平板，37℃培养维持24h后观察菌落特点。
3）动物试验：将标本或培养物制成悬液，皮下接种于豚鼠（1ml）或小白鼠（0.2ml）。均可引起败血症，并于1～3日后死亡。内脏和血液中存在大量有荚膜的细菌。
4）鉴定试验：①串珠试验：炭疽芽胞杆菌在每毫升含0.05～0.5IU青霉素的肉汤培养基中，可发生形态变异，形成大而均匀的圆球形并相联如串珠状；而类炭疽及其他需氧芽胞杆菌则无此现象。本试验鉴别意义较大；②噬菌体裂解试验；③重碳酸盐毒力生长试验：将待检菌接种于含0.5%碳酸氢钠和10%马血清琼脂平板上，置10%C02环境下，37℃培养24～48h，观察菌落形态，有毒力的炭疽芽胞杆菌能产生大量的谷氨酸物质，形成荚膜，菌落呈M型；无毒力芽胞杆菌不形成荚膜，呈R型菌落；④青霉素抑制试验：在含10、100U／ml青霉素的平板上受抑制而不生长；⑤植物凝集素试验（菌体多糖是植物凝集素受体）。
5）判定标准：革兰阳性、两端平整、竹节状成双或呈短链排列，有荚膜之粗大杆菌，或荚膜肿胀试验阳性，串珠试验阳性；重碳酸盐毒力试验出现M型菌落可作出诊断。
（二）蜡样芽胞杆菌
1.生物学性状及临床意义：G阳性大杆菌，芽胞位于菌体中心或次末端不突出菌体。引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜。能耐受接100℃ 30min。呈链状排列。营养要求不高，菌落较大，表面粗糙似毛玻璃状或融腊状，故名蜡样杆菌。在血琼脂平板上呈β溶血。食物中如被大量的蜡样杆菌污染（106～108／g）可致食物中毒，有腹泻型与呕吐型之分。
2.微生物学检查：除作分离培养外，细菌计数对本菌所致食物中毒有诊断价值，因暴露于空气中的食品均在一定程度上受本菌污染。食物中毒菌株的游离芽胞耐受100℃30min，而于热l20℃经60min才能杀死。
三、产单核李斯特菌
产单核李斯特菌隶属于李斯特菌属。该属包括8个种，主要包括产单核李斯特菌、格氏李斯特菌和默氏李斯特菌，其中只有产单核李斯特菌对人有致病性。李斯特菌属广泛存在于自然界，动物、人类、植物、土壤、水及青贮饲料均能分离到此菌。
（一）生物学特性
1.形态染色：菌体短小为（1～2）／μm×（0.4～0.5）μm，常呈V字形或成对排列，偶呈丝状。有鞭毛、无芽胞，20℃有动力，37℃动力缓慢，一般不形成荚膜。幼龄菌呈革兰阳性，陈旧培养物多转为革兰阴性。
2.培养特性：需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在血琼脂平板上35℃培养数天后形成小而透明的S型菌落，周围有狭窄的β溶血环。因其能生长于4℃，故可进行冷增菌。在半固体培养基中可出现倒伞形生长。通常在25℃培养时，显示有动力。
3.生化反应：该菌不发酵甘露醇和木糖，硝酸盐还原阴性，CAMP阳性。可发酵多种糖类如葡萄糖、果糖、麦芽糖等，产酸不产气，触酶阳性，不形成吲哚，不分解尿素，能水解七叶苷，能水解精氨酸产氨。
4.根据菌体及鞭毛抗原的不同，可分4个血清型，1、3、4型尚可分为若干亚型。本菌耐碱不耐酸。对热较为敏感，加热50℃10分钟可死亡。
（二）致病性
本菌由带菌动物或人粪便污染动物制品，而经口感染。通过胎盘或产道感染新生儿是本病的重要特点。官内感染常可导致流产、死胎及新生儿败血症，死亡率较高。本菌常伴随EB病毒引起传染性单核细胞增多症，此外可引起脑膜炎。致病物质主要是溶血素和菌体表面成分。机体主要靠细胞免疫功能清除本菌。
（三）微生物学检验
1.标本采集：根据感染部位不同而采取相应标本。如全身感染采取血液，局部采取分泌物或脓液，感染动物则用组织匀浆。
2.检验方法与鉴定
（1）分离培养：将血液标本（3～5ml）或脑脊液的离心沉淀物接种两支脑心浸液（标本量的10倍）培养基中。其中一支置10%C02环境中，37℃培养24～48h，各作一次血平板分离；另一支置4℃培养，每24h 作一次血平板分离，连续4天，以后每周一次至四周。咽喉拭子、组织及粪便接种于肉汤培养基中，置4℃培养，进行冷增菌；转种和培养方法同上。从血平板上挑取口溶血环的菌落，做涂片染色镜检并进一步鉴定。
（2）鉴定：本菌可根据下列特点加以确定：在血琼脂上有狭窄的β溶血环，25℃动力最强，在半固体培养基上呈伞状生长，可在4℃冷增菌生长，木糖、甘露醇和H2S阴性CAMP（与金黄色葡萄球菌协同溶血）阳性。触酶阳性。
四、丹毒丝菌属
红斑丹毒丝菌为革兰阳性杆菌，单个存在或形成短链。在血琼脂平板上可形成两种菌落。光滑型菌落细小、圆形、突起有光泽；粗糙型菌落大，表面呈颗粒状。厌氧或微需氧菌。无芽胞、无鞭毛、无荚膜。触酶阴性。48h发酵葡萄糖、乳糖，产酸不产气。对湿热及化学消毒剂敏感。
红斑丹毒丝菌引起红丹毒丝病，主要发生在动物身上，人类也可感染发病，主要因接触动物或其产品经皮肤损伤而引起类丹毒。以局部感染为主，全身感染者少见。感染局部的皮肤发红、肿胀、疼痛、或有痒感。也可引起急性败血症或心内膜炎。因污染奶制品而引起食物中毒。本菌对青霉素、头孢菌素、红霉素和四环素等菌敏感。
五、阴道加特纳菌
引起非淋菌性阴道炎的主要病原菌之一。
新鲜标本分离菌株趋向革兰染色阳性，保存菌株趋向革兰染色阴性。本菌无芽胞、无荚膜、无鞭毛，多形性。
本菌营养要求较高，在5%人血平板上，在3%～5%C02、35℃环境中培养48h，可形成针尖大小菌落，在人血和兔血平板上可出现β溶血环。对氨苄青霉素、羧苄青霉素、苯唑青霉素、青霉素、万古霉素和甲硝唑敏感。对萘啶酸、新霉素、粘菌素和磺胺嘧啶耐药。
本章练习题：
疑为白喉患者的最佳取材部位为
A.血液
B.淋巴液
C.假膜深处
D.假膜表面
E.假膜边缘
[答疑编号500735230201]
『正确答案』E
具有异染颗粒的细菌是
A.布鲁菌
B.破伤风梭菌
C.白喉棒状杆菌
D.结核分枝杆菌
E.脑膜炎奈瑟菌
[答疑编号500735230202]
『正确答案』C
调查人群对白喉有无抵抗力，可采用
A.Elek平板毒力试验
B.外斐试验
C.锡克试验
D.狄克试验
E.肥达试验
[答疑编号500735230203]
『正确答案』C
白喉患者的特异性治疗，应选择
A.适量输血
B.大量输血
C.足量抗生素
D.适量类毒素
E.早期足量抗毒素
[答疑编号500735230204]
『正确答案』E
青霉素串珠试验阳性的细菌是
A.破伤风梭菌
B.肉毒梭菌
C.产气荚膜梭菌
D.炭疽芽孢杆菌
E.白喉棒状杆菌
[答疑编号500735230205]
『正确答案』D
下列既有荚膜又有芽胞的细菌是
A.伤寒沙门菌
B.铜绿假单胞菌
C.炭疽芽胞杆菌
D.脂肪芽孢杆菌
E.蜡样芽孢杆菌
[答疑编号500735230206]
『正确答案』C
微生物实验 微生物实验 细菌形态观察 细菌分布 消毒灭菌
细菌形态观察 一、实验目的 1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护 2.掌握细菌的三种形态 3.掌握临床常见细菌的形态及染色 4.掌握细菌的特殊结构 5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点 二、实验原理 1. 普通光学显微镜（油镜）的使用 1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头 2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时 停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰 3. 根据需要调节显微镜亮度 2. 普通光学显微镜的维护 1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前 2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最 后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头 3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内 4.做好使用记录 3．微生物知识 1．细菌按形态分类： 球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等） 杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等） 螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等） 2．细菌的基本结构 细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体 3．细菌的特殊结构 荚膜：如肺炎双球菌 鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌 菌毛 芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌 4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。 原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体 真核类：真菌、原生动物、显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒 5．真菌 单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌
食品中微生物细菌总数的测定 一、实验目的 1学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理； 2了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。 二、实验原理 菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、器材 食品检样营养琼脂培养基无菌生理盐水无菌培养皿，无菌移液管酒精灯等。 四、实验步骤 1取样、稀释和培养 1.1以无菌操作取检样25g（或ml），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，制成1:10的均匀稀释液。
1.2用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。 1.3另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。 1.4根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml 稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 1.5稀释液移入平皿后，将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约 15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml 稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 1.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 2菌落计数方法 作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不要超过24h。 3菌落计数报告方法 3.1平皿菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长
微生物检验（完整版） 名解 微生物：是一群个体微小结构简单肉眼不能看见的微小生物的总称 种：亲缘关系较近的微生物群体在进化发育阶段上有一定的共同形态和生理特征 微生物学：生物学的一个分支是研究微生物在一定条件下的形态结构生理生化遗传变异特性及微生物的进化分类生态等生命活动规律以及微生物之间与人类动植物自然界互相关系的一门科学 抗生素：是由某些微生物在代谢过程中产生的能抑制或杀灭某些其他微生物和肿瘤细胞的微量生物活性物质 细菌素：是某些细菌菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质 条件致病菌：正常菌群在宿主体内具有相对稳定性一般不致病 消毒：指杀死物体上的病原微生物但不一定能杀死细菌芽孢的方法 灭菌：指杀灭物体上所有的微生物的方法 防腐：指防止或抑制微生物生长繁殖的方法 无菌：指没有货的微生物的存在 质粒：是细菌染色体外的遗传物质也是环状闭合的双联DNA分子比染色体小存在于细胞质中可自主复制 突变：是指细菌遗传物质的机构发生突然而稳定的改变所致的变异现象可遗传给后代 基因转移：外源性物质由供体菌转入受体细胞内的过程 基因重组：供体菌的基因进入受体菌细胞并在其中自行复制与表达或矛受体菌DNA整合在一起的过程 病毒：是一类个体微小结构简单只含一种核酸只能在活的易感细胞内以复制方式增殖的
非细胞型微生物 复制周期：病毒的增殖被人为分成吸附穿入脱壳生物合成装配成熟与释放七个步骤的完整过程 缺陷病毒：是指因病毒基因组不完整或因基因某一点改变而不能进行正常增殖的病毒 顿挫感染：病毒进入宿主细胞若细胞缺乏病毒复制所需的酶能量和必要成分等则病毒无法合成自身成分不能够装配和释放子代病毒的现象 干扰现象：两种病毒感染同一种细胞时可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象 人工自动免疫：是将疫苗等免疫原接种于人体刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答使机体获得特异性免疫力 人工被动免疫：是指注射含某种病毒特异性中和抗体的免疫血清等一系列细胞因子是机体立即获得特异性免疫 干扰素：是由病毒或干扰素诱生剂作用于中性粒细胞成纤维细胞或免疫细胞产生的一种糖蛋白 致病性：一定种类的病原微生物在一定的条件下能在特殊的宿主体内引起特定疾病的能力半数致死量：在规定时间内通过一定途径能使一定体重或年龄的某种动物半数死亡或感染需要的最小病原体数量或毒素量 急性感染：发作突然病程较短一般是数天或数周 局部感染：病原体侵入机体后局限就在一定部位生长繁殖引起病变的一种感染类型 毒血症：致病菌侵入宿主体后只在机体局部生长繁殖病菌不进入血液循环但其产生的外毒素入血引起特殊的毒性症状 败血症：致病菌侵入血流后在其中大量繁殖并产生毒性产物引起全身性毒性症状 内毒素血症：革兰阴性菌侵入血流并在其中大量繁殖崩解后释放出大量毒素也可有病灶
沙门菌属和志贺菌属检验 步骤和方法 1 .形态观察 (1)革兰染色：沙门菌属细菌为革兰阴性细长杆菌。志贺菌属细菌为革兰阴性杆菌，散在分布。 (2)观察鞭毛染色标本片：镜下可见沙门菌属细菌具有周鞭毛。志贺菌属细菌无鞭毛。 2?菌落观察 (1)沙门菌属：将本菌接种在SS MAC平板上经35 'C孵育18?24h。由于本菌不分解乳糖并产碱，故在SS和MAC 平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产生H2S的菌落可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。 (2)志贺菌属：将本菌接种在SS和MAC平板上经35C孵育18?24h。由于志贺菌不分解乳糖，宋内志贺菌某些菌株可迟缓发酵乳糖，故其在SS平板和MAC平板上形成无色透明的、中等大小的菌落。除宋内志贺菌菌落外均为光滑型菌落。 3.生化反应氧化酶试验：方法同大肠埃希菌。沙门菌属和志贺菌属细菌氧化酶试验均为阴性。初步试验鉴定：挑取志贺菌和沙门菌的单个菌落分别接种在KIA、MIU和硝酸盐培养基上，经35C孵育18?24h，同时做触酶试验。其结果见表2—4。 最终鉴定：须做全面生化反应和血清学试验。 4 .血清学试验 (1)志贺菌属的分型鉴定：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。取1环志贺菌四种多价血清于载玻片 一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。结果：对照呈均匀混浊，待检菌 与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用 A B、C D群最常见的单价 血清凝集定种。 结果判断、解释和报告： ①分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。 ②经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离岀XX志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告：“分离岀XX志贺菌X型”。 (2)沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。 首先选用A?F组多价“ O诊断血清做玻片凝集试验。在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在5?10min内不 岀现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验。若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下， 制成浓厚的悬液，加热100 C、30min，再与A?F组多价“ O诊断血清做凝集试验。若与A?F组多价“ O血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检岀率最高菌型的相应血清做玻片凝集反应。 若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H因子血清检查第I相抗原，然后检查第H相抗原，最后确定该菌种属 于哪一型沙门菌。 结果判断、解释和报告： ①分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌鉴定依据者，可报告“未分离岀沙门菌”。 ②生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性，可初步报告为：“分离到XX沙门菌”，或“X群沙门菌”。 5 ?肥达试验 （1）原理：用已知的伤寒沙门菌O H抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的H抗原（PA、PB）与肠热症患者血清做定量
第十七章厌氧性细菌及检验 本章内容 一、概述 厌氧菌的分类 厌氧菌的临床意义 厌氧菌感染 厌氧菌标本的采集与送检 厌氧菌的分离与鉴定 厌氧环境的指示 二、常见厌氧菌 破伤风杆菌 产气荚膜梭菌 肉毒梭菌 艰难梭菌 厌氧球菌 无芽胞厌氧菌 厌氧菌概述 一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。 G+有芽胞的梭菌：有芽胞，抵抗力强，广泛存在，可出芽繁殖，产生多种外毒素，引起严重疾病。 G+/G-无芽胞的球菌与杆菌：人体正常菌群，可存在于口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道等。致病性属条件致病性的内源性感染。 厌氧菌概述——分类 《伯杰系统细菌学手册》分类标准： 无芽胞厌氧菌有40多个菌属，300多个菌种和亚种；而有芽胞的厌氧菌只有梭菌属，包括130个种。 据耐氧性分类
（1）专性厌氧菌：是指在降低氧分压的条件下才能生长的细菌。又分为极度厌氧菌（氧分压＜0.5%，空气中暴露10min致死，如丁酸弧菌）和中度厌氧菌（氧分压为2%～8%，空气中暴露60～90min能生存，如大多数人类致病厌氧菌）。 （2）微需氧菌：能在含5%～10%CO2空气中的固体培养基表面生长的细菌，如弯曲菌属。 （3）耐氧菌：其耐氧程度刚好能在新鲜配制的固体培养基表面生长。一旦生长，暴露数小时仍不死亡，如第三梭菌、溶组织梭菌。 厌氧菌概述——临床意义及感染 感染类型 外源性感染：梭状芽胞杆菌属引起的感染。 内源性感染：无芽胞厌氧菌大多数是人体正常菌群，属于条件致病菌，在一定条件下可引起感染，一般不在人群中传播。 感染的危险因素： 组织缺氧缺血； 机体免疫功能下降； 某些手术及创伤易发生厌氧菌感染； 长期应用某些抗菌药物； 深部需氧菌感染。 感染的临床指征： 感染局部产生大量气体； 多发生在黏膜附近； 深部外伤后继发感染； 分泌物有恶臭或为暗红色； 常见于长期应用氨基糖苷类抗生素治疗无效的病例； 镜检有细菌，常规培养阴性。 厌氧菌概述——标本的采集与送检 重要原则：标本绝对不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。 适宜标 本 血液、骨髓、脑脊液、关节液、心包液、胸腔积液、腹腔液、胆汁、由活检或尸体解剖 获得的组织标本、深部脓肿抽取物、经环甲膜以下或肺穿刺抽取的肺渗出物、后穹窿穿 刺抽取的盆腔渗出液及无菌套管抽取的宫腔内容物、膀胱穿刺液及其它组织穿刺液等不宜标 本 鼻咽拭子、齿龈拭子、直肠拭子、喀出的痰液、自然排出的尿液和导出的尿液、流出的 脓液、接近皮肤或黏膜的分泌物、阴道分泌物、胃和小肠内容物、粪便（艰难梭菌除外） 等 厌氧菌概述——标本的采集与送检 采集 多采用针筒抽取、穿刺等，应严格无菌操作，严禁接触空气。 厌氧培养最理想的检查材料是组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长。
微生物总数检测方法（真菌） 一、检测用培养基配方与培养条件 1.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基） 配制：以北京路桥PDA培养基为例，按说明上配制需称取培养基4克，加水100毫升。 2. 培养条件：25℃-30℃；时间：72-96小时。 二、检测与计数方法 1. 梯度稀释 称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂3—5滴，分散剂可以是吐温，OP—80，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后，上旋转式摇床200 r/min充分振荡60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。 2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管，每一个稀释度瓶种应放有适量的玻璃珠，以保证菌液分布均匀）。 3. 加样及培养 取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。 4. 菌落识别 根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。 5. 菌落计数 以出现20—70个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。 有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数： nm = x kv1/(m0v2) ×10-8或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8（1） 式中：
微生物在自然界的分布 1. 内容 1.土壤中的微生物 由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的大本营，土壤微生物通过其代谢活动可改变土壤的理化性质，进行物质转化，因此，土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素。土壤中微生物数量最大，类型最多，是人类最丰富的“菌种资源库”。 2.水体中的微生物 水是一种良好的溶剂，水中溶解或悬浮着多种无机和有机物质，能供给微生物营养而使其生长繁殖，水体是微生物栖息的第二天然场所。 ?淡水微生物 淡水中的微生物多来自于土壤、空气、污水或动植物尸体等，尤其是土壤中的微生物，常随土壤被雨水冲刷进入江河、湖泊中。来自土壤中的微生物，一部分生活在营养稀薄的水中，一部分附着在悬浮于水体中的有机物上，一部分随着泥沙或较大的有机物残体沉淀到湖底淤泥中，成不水体中的栖息者，另外也有很多微生物因不能适应水体环境而死亡。因此，水体中的微生物数量和种类一般要比土壤中的少。 水中微生物的含量和种类对该水源的饮用价值影响很大。在饮用水的微生物学检验中，不仅要检查其总菌数，还要检查其中所含的病原菌数。由于水中病原菌数比较少，所以通常采用与其有相同来源的大肠菌群的数量作为指标，来判断水源被人、畜粪便污染的程度，从而间接推测其他病原菌存在的概率。 我国卫生部门规定的饮用水标准是：1ml自来水中的细菌总数不可超过100个（37℃，培养24h），而1000ml自来水中的大肠菌群数则不能超过3个（37℃，48h）。 ?海水微生物 海洋是地球上最大的水体，咸水占地球总水量的97.5%。一般海水的含盐量为3%左右，所以海洋中土著微生物必须生活在含盐量为2%～4%的环境中，尤以3.3%～3.5%为最适盐度。海水中的土著微生物种类主要是一些藻类以及细菌中的芽孢杆菌属、假单胞菌属、弧菌属和一些发光细菌等。 3.空气中的微生物 空气中并不含微生物生长繁殖所必需的营养物、充足的水分和其他条件，相反，日光中的紫外线还有强烈的杀菌作用，因此，它不适宜微生物的生存。然而，空气中还是含有一定数量来自土壤、生物和水体等的微生物，它是以尘埃、微粒等方式由气流带来的。因此，微生物的分布是世界性的。但微生物在空气中的分布是很不均匀的。凡含尘埃越多或越贴近地面的空气，其中的微生物含量就越高。在医院及公共场所的空气中，病原菌特别是耐药菌的种类多、数量大，对免疫力低下的人群十分有害。
清于载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。结果：对照呈均匀混浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用A、B、C、D群最常见的单价血清凝集定种。 结果判断、解释和报告： ①分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。 ②经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离出××志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告：“分离出××志贺菌×型”。 (2)沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。首先选用A～F组多价“O”诊断血清做玻片凝集试验。在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在5～10min内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验。若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，加热100℃、30min，再与A～F组多价“O”诊断血清做凝集试验。若与A～F组多价“O”血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检出率最高菌型的相应血清做玻片凝集反应。 若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H因子血清检查第I相抗原，然后检查第Ⅱ相抗原，最后确定该菌种属于哪一型沙门菌。 结果判断、解释和报告： ①分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌鉴定依据者，可报告“未分离出沙门菌”。 ②生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性，可初步报告为：“分离到××沙门菌”，或“×群沙门菌”。 5．肥达试验 (1)原理：用已知的伤寒沙门菌O、H抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的H抗原(PA、PB)与肠热症患者血清做定量试管凝集试验，以出现“2+”凝集的最高血清稀释度为效价，测定相应抗体含量，用以辅助诊断肠热症。 (2)试验方法：为单管稀释法。准备4排小试管，每排7支并标记，另取中号试管1支，加生理盐水3．8ml及被检血清O．2ml，混匀，即为1：20稀释，总量为4ml。然后取出2ml按每管分别放人各排小试管中的第1支试管中。再于上述中号试管内加生理盐水2ml混匀，此种血清即为1：40稀释，吸取此稀释度血清2ml，按每管分别加到各排小试管中的第2支试管中。以此类推连续稀释到各排小试管第6支试管为止，第7支小试管只加入生理盐水做阴性对照。然后按表2-5操作。 表2-5血清学试验(肥达试验)方法
实验题目： 湖水中细菌和抗Cu离子的细菌的总数测定， 金属抗性细菌的分离、纯化、保存以及菌落形态观察 一、实验目的 1. 学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2. 了解平板菌落计数法的原则。 3. 了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性。 4. 熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 5. 了解配制微生物培养基的基本原理，掌握常规的配制、分装培养基的方法。 6. 学会各类物品的包装、配制（稀释水等）和灭菌技术。 7. 从湖水中分离、培养微生物，掌握常用的分离微生物的方法。 8. 学会接种技术。 9. 观察分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落形态特征。 10.通过观察和比较细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的菌落特征，达到初步鉴别上述微生物的能力。 二、实验原理 1、测细菌总数原理：水中的细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，水体被污染的程度越重。水中细菌的种属繁多，它们对营养
和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中的细菌的总数实际上是一种近似值。肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长。因此应用平板菌落计数技术来测定水样中的细菌总数基本上能代表水样中细菌的数量。 2、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。本实验配制固体培养基，固体培养基的成分与液体相同，仅在液体培养基中加入凝固剂使呈固态。通常加入质量浓度15-20g∕L的琼脂为固体培养基。 3、灭菌原理:本次实验采取加压蒸汽灭菌法和干热灭菌法。加压蒸汽灭菌器是能耐一定压力的密闭金属锅，加压灭菌的原理在于提高灭菌器内的蒸汽温度来达到灭菌的目的。包括干热空气灭菌和火焰灼烧灭菌等以干热方法杀死细菌达到灭菌的目的。干热灭菌法适用于干燥粉末、凡士林、油脂的灭菌，也适用于玻璃器皿(如试管、平皿、吸管、注射器)和金属器具(如测定效价的钢管、针头、摄子、剪刀等)的灭菌。干热灭菌的原理是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度
什么是食品微生物检验 吴崇食质12级1班学号：20122629 微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50 亿个细菌。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广
临床细菌学检验的质量控制流程 1、质量的概念和质量保证 影响检验结果质量的因素很多,实验过程中,仪器、试剂和操作等均会引起试验结果的误差,衡量检验结果的质量常用准确度和精确度,或特异性和灵敏度。具体采用哪一种指标应根据实验的性质决定,目前临床细菌学检验的工作内容大致有3类,衡量起质量的技术指标不完全相同。 第一类是检出细菌的实验,包括标本直接涂片检查和细菌分离培养。现代的细菌感染,混合菌较常见,一份标本中,会有2种以上细菌存在。无论标本直接涂片还是分离培养,检验结果必须如实反映感染病灶中细菌的真实情况。这类实验的质量,应该用细菌检出率或细菌分离率来衡量。 第二类是鉴定细菌的实验。通过一系列生理生化及形态学、血清学的手段来鉴定病原菌。对分离到的病原菌都做出准确的鉴定,是反映细菌事工作质量的一个重要方面。 第三类是药敏实验。有稀释法和纸片法,前者是半定量的实验,可以用准确度和精密度来衡量,后者以敏感或耐药的形式报告,
属于定性的实验,但实验过程中测量抑菌环是定量的指标。也应以准确度和精确度衡量。 所以实验室人员必须清楚认识到以上这一点,在实验室的设计和管理方面就应该主动设置误差检测系统,实验中一旦出现误差及时发出警报,查明原因及时纠正。 2、室内质量控制 2.1在职人员 2.1.1须受过细菌学检验的专门基础教育以及相关的生物交全防护知识,并以细菌检验为专业,及时终结并积累工作经验。 2.1.2作人员必须具有严谨的工作态度,技术操作须完全遵守操作规程,并直接参与质量控制工作。 2.1.3工作人员应不断加强自身的业务学习,及时了解本领域的新进展,将所掌握的新知识应用到实际工作中。 2.1.4实验室管理人员应注意利用一切机会培养技术人员,积极参加国际、国内学术会议、专业培训班,获取新信息。因为细菌学检验,投资人员培训远比投资与仪器设备更重要。 2.2操作手册及参考书
志贺菌属细菌是引起人类细菌性痢疾的主要肠道病原菌之一。 一、分类 志贺菌属可用特异性抗血清将其分为4个血清群(种)：A群为痢疾志贺菌，B群为福氏志贺菌，C群为鲍特志贺菌，D群为宋内志贺菌。1989年CDC分类系统将生化反应特性相近的A、B，C群归为一群，统称为志贺菌A、B、C血清群；而将生化反应特征与之相异，鸟氨酸脱羧酶和β-半乳糖苷酶均阳性的宋内志贺菌单列出来。DNA G+C含量为49~53mol％。 二、临床意义 志贺菌属细菌的致病主要与细菌的侵袭力、内毒素和外毒素有关，志贺菌属细菌因菌毛的作用，细菌黏附于肠黏膜的表面，并侵入上皮细胞内生长繁殖，形成感染病灶，引起炎症反应。本菌属各菌株均有强烈的内毒素，由于内毒素的释放可造成上皮细胞死亡及黏膜下发炎，并形成毛细血管血栓，导致坏死、脱落和溃疡，患者出现典型的脓血便；另一方面可引起全身中毒症状(内毒素血症)，导致发热、意识障碍，甚至中毒性休克。A群志贺菌1型和2型产生的志贺毒素，ST对Vero细胞有毒性作用也称为Vero毒素VT对小鼠有强烈的致死毒性，有VT1和VT2两种。ST属VT1型。 志贺菌属细菌主要引起人类细菌性痢疾，简称菌痢，一年四季均可发病，以夏秋季节发病率最高，典型的急性菌痢表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重，发热等症状。小儿常可引起中毒性菌痢，患儿常无明显的消化道症状而表现为全身中毒症状，若抢救不及时，往往造成死亡。四种志贺菌中，痢疾志贺菌引起的菌痢较为严重，其他志贺菌引起的感染则相对较轻，具有自限性且很少致死。我国以福氏志贺菌和宋内志贺菌引起的菌痢最为多见。多数菌痢为散发病例，可引起人与人之间的传播。偶可因食用了被污染的水和食物而引起暴发流行。 三、生物学特性 为革兰阴性短小杆菌，菌体大小(1~3μm×(0.7~1.0)μm，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。 培养特性为兼性厌氧，最适生长温度为35℃，最适pH为7.2~7.4。营养要求不高，能在普通琼脂培养基上生长，且生长良好。在肠道选择培养基上可形成乳糖不发酵、中等大小、无色透明或半透明菌落，宋内志贺菌常形成粗糙型菌落。 志贺茵属菌种有O抗原，无H抗原，部分菌种有K抗原。O抗原是分类的依据，有群特异性和型特异性两种抗原，根据生化反应和O抗原的不同，将志贺菌属分为4个血清群(A、B、C、D)和40余个血清型。O抗原耐热，加热100℃ 60分钟不被破坏。K抗原存在时能干扰O抗原与相应抗血清的凝集作用。加热100℃ 60分钟可消除K抗原对O抗原的干扰作用。
2019 第十七章 厌氧性细菌及检验 一、 A1 1、破伤风杆菌血平板 37℃培养 48h A 、凸起、灰白、半透明、边缘不整齐 B 、凸起、灰白、不透明、边缘不整齐 C 、扁平、金黄色、半透明、边缘不整齐 D 、扁平、灰白、半透明、边缘不整齐 E 、扁平、灰白、半透明、边缘整齐 2、破伤风杆菌形态与染色叙述正确的是 A 、细长、周鞭毛（ +）、荚膜（ - ） B 、汤匙状、周鞭毛（ +）、荚膜（ - ） C 、细长、周鞭毛（ - ）、荚膜（ - ） D 、细长、周鞭毛（ +）、荚膜（ +） E 、细长、周鞭毛（ - ）、荚膜（ +） 3、对于厌氧菌叙述正确的是 A 、人体正常菌群的组成部分，主要聚居肠道，达到 1012 个粪便 B 、人体致病菌，主要集聚肠道，达到 1012 个粪便 C 、人体体表菌群的主要部分，达到 1012 个粪便 D 、人体体表菌群的主要组成部分，达到 1042 个粪便 E 、人体正常菌群的组成部分，主要聚居肠道，达到 1042 个粪便 4、厌氧菌中耐氧菌 A 、在新鲜固体培养基表面不生长、暴露数小时仍不死亡 B 、在新鲜固体培养基表面生长、暴露 1h 后死亡 C 、在新鲜固体培养基表面生长、暴露 2h 后不死亡 D 、在新鲜固体培养基表面生长、暴露数小时仍不死亡 E 、在新鲜固体培养基表面生长、暴露 3h 后不死亡 5、专性厌氧菌中极度厌氧菌 A 、氧分压＜ 5%，空气暴露 10min 死亡 B 、氧分压＜ 0.5%，空气暴露 10min 死亡 C 、氧分压＜ 3%，空气暴露 10min 死亡 D 、氧分压＜ 0.5%，空气暴露 1min 死亡 E 、氧分压＜ 5%，空气暴露 30min 死亡 6、可做厌氧菌培养的标本为 A 、气管抽取物 B 、前列腺分泌物 C 、阴道分泌物 D 、胸腔积液 E 、中段尿
第十四章厌氧性细菌 厌氧性细菌(Anaerobic bacteria)是一大群种类繁多、专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。 厌氧菌广泛分布于自然界和人及动物的体内。无芽胞厌氧菌主要存在于人体及动物体内，特别是肠道、口腔、止呼吸道和泌尿道等处，与需氧菌和兼性厌氧菌共同构成机体的正常菌群。在正常菌群中厌氧菌通常占有绝对的优势。正常情况下，菌群保护相对平衡，如长期应用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，发生菌群失调，或机体抵抗力减退，则可导致内源性厌氧菌感染。 目前已知的重要厌氧菌见表。 表14-1 重要的厌氧菌 一、芽胞菌 梭状芽胞菌属（Clostridium） 二、无芽胞菌 （一）革兰氏阳性球菌 1 消化球菌属（Peptococcus） 2 消化链球菌属（Peptostreptococcus） （二）革兰氏阴性球菌 韦荣氏球菌属（Veillonella） （三）革兰氏阴性无芽胞杆菌 1 类杆菌属（Bacteroides） 2 梭形杆菌属（Fusobacterium） （四）革兰氏阳性无芽胞杆菌 1 双歧杆菌属（Bifidobacterium） 2 乳杆菌属（Lactobacillus） 3 真杆菌属（Eubacteriun） 4 丙酸杆菌属（Propionibacterium）
第一节厌氧芽胞杆菌 厌氧芽胞杆菌只有一个属，称梭状芽胞杆菌属（Clostridium），简称梭菌属，革兰氏染色阳性，都能产生芽胞，芽胞直径大多比菌体宽，使菌体膨大成梭形，故得名。芽胞的形状和位置在鉴别上有意义。 大多数须在严格厌氧条件下才能生长，少数可在微氧环境中繁殖。 一、破伤风梭菌 破伤风梭菌（Clostridium tetani）是引导起破伤风的病原菌，大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，经伤口感染引起疾病。 （一）生物学性状 破伤风梭菌菌体细长，长4～8um ，宽0.3～ 0.5um ，周身鞭毛，芽胞呈圆形，位于菌体顶端，直径比菌体宽大，似鼓槌状，是本菌形态上的特征。繁殖体为革兰氏阳性，带上芽胞的菌体易转为革兰氏阴性。破伤风梭菌为专性厌氧菌，最适生长温度为37℃pH7.0～7.5，营养要求不高，在普通琼脂平板上培养24～48小时后，可形成直径1mm 以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徒扩散。在血液琼脂平板上有明显溶血环，在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇（有腐败臭味）及硫化氢。一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。对蛋白质有微弱消化作用。本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似，但芽胞抵抗力强大。在土壤中可存活数十年，能耐煮沸40～50分钟。对青霉素敏感，磺胺类有抑菌作用。 （二）致病性 破伤风梭菌芽胞广泛分布于自然界中可由伤口侵入人体，发芽繁殖而致病，但破伤风梭菌是厌氧菌，在一般伤口中不能生长，伤口的厌氧环境是破伤风梭菌感染的重要条件。窄而深的伤口（如剌伤），有泥土或异物污染，或大面积创伤、烧伤、坏死组织多，局部组织缺血或同时有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，均易造成厌氧环境，局部氧化还原电势降低。有利于破伤风杆菌生长。破伤风梭菌能产生强烈的外毒素，即破伤风痉挛毒素（Tetanospasmin）或称神经毒素(Neurotoxin)。破伤风毒痉挛毒素是一种神经毒素，为蛋白质，由十余种氨基酸组成不耐热，可被肠道蛋白酶破坏，故口服毒素不起作用。在菌体内的痉挛毒素是单一和一条多肽链，分子量15万。破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素。破伤风梭菌没有侵袭力，只在污染的局部组织中生长繁殖，一般不入血流。当局部产生破伤风痉挛毒素后，引起全身横纹肌痉挛。毒素在局部产生后，通过运动终板吸收，沿神经纤维间隙至脊髓前角神经细胞，上达脑干，也可经淋巴吸收，通过血流到达中枢神经。毒素能与神经组织中的神经节工苷脂结合，封闭了脊髓抑制性突触末端，阻止释放抑制冲动的传递介质甘氨酸和γ氨基丁酸，从而破坏上下神经原之间的正常抑制性冲动的传递，导致超反射反应（兴奋性异常增高）和横纹肌痉挛（图14-1）。
微生物学检验菌落总数的测定 1 原理 微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列 不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。 2 材料和仪器 2.1 平皿：φ90mm 。 2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。 2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.4 灭菌锅。 2.5 恒温培养箱 2.6 涂棒。 2.7 酒精灯。 2.8 超净工作台。 2.9 磁力搅拌器。 2.10 漩涡振荡器 3 检验程序 菌落总数的检验程序见下图。 方法①↙ ↘方法② ↘ ↙
4 操作步骤 4.1 培养基和试剂的配制 4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用） 牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20g 蒸馏水1L pH 7.0～7.2 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。 4.1.2 无菌生理盐水的配制： 称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。 4.2 样品的稀释： 4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装 数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。 4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀 释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。 4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL 无菌吸管或吸头。 4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。 4.2 平板接种与培养 接种方法1： 用1mL无菌吸管或微量移液器分别吸取不同稀释度的菌悬液1mL于一个无菌培养皿中（每个稀释度做三个重复），再在培养皿中分别倒入10～15mL已融化并冷却至45~50℃的培养基，盖好平皿盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-8，10-9，10-10。 接种方法2： 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取0.2ｍＬ稀释液均液于计数培养基平板上，将稀释液涂布均匀，吸附，在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。（计算时需要把0.2mL的倍数也计算在稀释倍数内） 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-7，10-8，10-9。 ４.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时借用放大镜或菌落计数器，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示 4.3.1 选取菌落数在30~300之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用3个平行平板的平均数。
食品微生物菌落总数测定方法 1 主题内容与适用范围 本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。 本标准适用于食品中菌落总数的测定。 2 术语 菌落总数是指食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时 间、pH、需氧性质等),所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果,只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌在食 品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 3 引用标准 GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 4 设备和材料 4.1 温箱：36±1℃。 4.2 冰箱：0～4℃。 4.3 恒温水浴：46±1℃。 4.4 天平。 4.5 电炉。 4.6 吸管。 4.7 广口瓶或三角瓶：容量为500mL。 4.8 玻璃珠：直径约5mm。 4.9 平皿：直径为90mm。 4.10 试管。 4.11 放大镜。 4.12 菌落计数器。 4.13 酒精灯。 4.14 均质器或乳钵。 4.15 试管架。 4.16 灭菌刀或剪子。 4.17 灭菌镊子。 5 培养基和试剂 5.1 营养琼脂培养基：按GB 4789.28中4.7规定。 5.2 磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。 5.3 生理盐水。 5.4 75％乙醇。 6 检验程序 菌落总数的检验程序如下。 ┌─────┐ │ 检 样 │ └─────┘ ↓ ┌─────────────┐ │ 做成几个适当倍数的稀释液 │ └─────────────┘ ↓ ┌──────────────┐ │ 选择2～3个适宜稀释度 │ │ 各以1mL分别加入灭菌平皿内 │ └──────────────┘ ↓ ┌─────────────┐ │ 每皿内加入适量营养琼脂 │ └─────────────┘ 36±1℃ ↓ 48±2h ┌─────┐ │ 菌落计数 │ └─────┘ ↓ ┌──────┐ │ 报告 │ └──────┘ 7 操作步骤 7.1 检样稀释及培养 7.1.1 以无菌操作,将检样25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后,最好置均质器中以8 000～10 000r/min的速度处理1min, 做成1∶10的均匀稀释液。 7.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL,沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液),振摇试管,混合均匀,做成1∶10 0的稀释液。 7.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作顺序,做10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次, 即换用1支1mL灭菌吸管。 7.1.4 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计,选择2～3个适宜稀释度,分别 在做10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。 7.1.5 稀释液移入平皿后,应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置于46±1℃水浴保温)注入平皿约15mL,并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照。 7.1.6 待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48±2h。 7.2 菌落计数方法 做平板菌落计数时,可用肉眼观查,必要时用放大镜检查,以防遗漏。在记下各平板 的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 7.3 菌落计数的报告 7.3.1 平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平 板,应采用两个平板平均数,其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以 无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而其余一 半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状 菌落生长时(菌落之间无明显界线),若仅有一条链,可视为一个菌落；如果有不同来源 的几条链,则应将每条链作为一个菌落计。 7.3.2 稀释度的选择 7.3.2.1 应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度,乘以稀释倍数报告之(见表中例1)。 7.3.2.2 若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30～300之间,则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2,应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字(见表中例2及3)。 7.3.2.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以 释稀倍数报告之(见表中例4)。 7.3.2.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之(见表中例5)。 7.3.2.5 若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表中例6)。 7.3.2.6 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间,其中一部分大于300或小于30时,则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例7)。 7.3.3 菌落数的报告 菌落数在100以内时,按其实有数报告,大于100时,采用二位有效数字,在二位有效 数字后面的数值,以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数,也可用10的指数来 表示(见表中“报告方式”栏)。 稀释度选择及菌落数报告方式 ──┬─────────────┬──────┬────┬─────────│ 稀释液及菌落数 │ │菌落总数│ 报告方式 例次├────┬────┬───┤两稀释液之比│个/g或mL│ 个/g或mL │ 10-1 │ 10-2 │ 10-3 │ │ │ ──┼────┼────┼───┼──────┼────┼───────── 1 │多不可计│ 164 │ 20 │ - │ 16 400 │16 000或1.6×10**4 2 │多不可计│ 295 │ 46 │ 1.6 │ 37 750 │ 3 8000或3.8×10**4 3 │多不可计│ 271 │ 60 │ 2.2 │ 27 100 │27 000或2.7×10**4 4 │多不可计│多不可计│ 313 │ - │ 313 000│31 000或3.1×10**5 5 │ 27 │ 11 │ 5 │ - │ 270 │270或2.7×10**2 6 │ 0 │ 0 │ 0 │ - │ ＜1×10│ ＜10 7 │多不可计│ 305 │ 12 │ - │ 30 500│31 000或3.1×10**4 ──┴────┴────┴───┴──────┴────┴───────── ──────────