小鼠胰腺腺泡细胞原代培养

文章编号： 1006－6233（ 2011） 12－1654－04
胰岛细胞药物筛选模型的建立—小鼠胰岛的原代培养
丘渭遥
（ 深圳大学医学院生化中心， 广东 深圳 518057）
摘 要： 目的： 用胰岛细胞作为糖尿病新药的细胞筛选模型需保持其结构完整、生理功能稳定和
足够长的存活时间，为此本文对小鼠胰岛分离纯化和培养方法进行优化。方法： 用胶原酶、透明质酸 酶和 DNA 酶消化，Ficoll 400 密度梯度离心法分离胰岛； DTZ 染色法和台盼兰染色测定胰岛的纯度和
参考文献： ［1］ 姜泗长，方耀云． 耳鼻咽喉科临床误诊误治及处理［M］．
昆明： 云南科技出版社，2000． 128－129． ［2］ 中华医学会耳鼻咽喉科学分会、中华耳鼻咽喉科杂志编
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Ficoll 液 1mL，然后依次沿 管 壁 慢 慢 分 层 加 入 23% 、 20% 和 11% 的 Ficoll 液 各 1mL。4℃ 400rpm 离 心 4min，继之 2000rpm 离心 12min。收集位于第二层面 的胰岛加入 Hanks 液 600rpm，1min 离心清洗。之后加 入 RPMI1640 完全培养基（ 含 10% FBS） 37℃ 5% 二氧 化碳培养。培养 24h 后，成纤维细胞均已贴壁，再次收 集胰岛并反复洗涤离心，获得完整单离的纯净胰岛。 1． 4 胰岛的培养 1． 4． 1 培养基质的预处理方法： Poly －L －Lys 的处理 方法： Poly－L－Lys 均匀涂附培养板壁面，置于 37℃ ，0． 5h，用去离子水洗涤，晾干即可。明胶和 laminim 的处 理方法： 将相应培养基质溶液均匀涂附培养板壁面，置 于 4℃ 过夜，用前再用少许培养基冲洗一次。胶原处 理方法： 用吸管吸少许胶原涂于灭菌培养瓶 /孔板内壁 培养面 上； 向 培 养 瓶 内 通 以 氨 气 后 封 上 瓶 盖，作 用 30min，待胶原凝固，然后用无菌生理盐水冲洗、凉干， 即可使用。 1． 4． 2 胰岛的培养： 用以上方法处理的培养板培养胰 岛。 1． 5 胰岛生物活性的测定 1． 5． 1 胰岛数目和活力的测定： DTZ 染色计算收获胰 岛数目。台盼兰染色计算细胞活力，参照 Freshneiy 方 法［6］。 1． 5． 2 培养上清中胰岛素含量的测定： 每天取培养孔 内全部上清用胰岛素放射免疫试剂盒检测胰岛素含 量，同时补充等量的新鲜培养基。以接种后培养第 1 天内的胰岛素分泌良为基准，胰岛素的分泌水平表达 为同一培养孔后来检测的胰岛素含量与第 1 天的胰岛 素分泌量相除所得到的比值。 2 结果与讨论 2． 1 不同酶体系对小鼠胰岛分离效果的影响： 采用不 同组分配比的酶液分别对小鼠胰腺组织进行消化，结 果如表 1。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验背景：一、细胞培养的基本条件：1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器4.细胞保存条件：液氮罐1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

3.CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。

定期消毒（90 ℃，14 h)。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

三、细胞培养用液的配制：1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml3.消化液：①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。

用滤器过滤除菌。

④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用4.培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

①天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。

小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。

小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。

2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。

用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。

3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。

4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。

5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。

6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。

7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。

8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。

9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。

10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。

注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。

操作时要小心，避免损伤组织。

使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。

培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。

培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。

在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。

以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。

建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。

小 鼠胰腺 干细胞饲养层条件下 的连续传代培养
岑妍 慧 （ 西 中医学 院 ， 西 南宁 ５００ ） 广 广 ３０ １
关键词 ： 干细胞 ； 胎成纤维细胞； 胰腺 胚 饲养层 ； 连续传代
中图分类号 ＂ ３ ４ ２ 文献标 识码 ： 文章编 号：０ ８ ４ ６ ２０ ） １ ０ ６—０ Ｒ ９． Ａ １０ —７ ８ ｛０ ８ ０ —０ ０ ３
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按ｌ ／ ｍｌ ｇ胰腺组织（ 湿重 ） 比例 ， 入浓度 为 ｌ ｇ ｍｌ Ｖ 的 加 ｍ／ 的
型胶原酶 ， ３ ℃恒温条 件下 消化 ２ ～３ ｍｉ 中止 消化 ， 在 ７ ０ ０ ｎ后