小鼠肝细胞原代培养

小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。

其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。

2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。

将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。

3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。

当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。

4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。

同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。

通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。

该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。

原代小鼠肝细胞培养方法的比较王珊;柏青;王方萍;李慧瑶;陈燊;何志妮;王庆;陈雯;陈丽萍【摘要】目的:比较3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能,寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方.方法:采用改良Seglen两步胶原酶灌注法分离原代小鼠肝细胞,糖原染色观察细胞纯度,在贴壁4h后用基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)等3种不同的条件培养肝细胞.镜下观察肝细胞形态,用MTT法检测细胞活力,生化分析仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白蛋白水平.结果:成功分离小鼠原代肝细胞,肝细胞纯度达95％以上;原代肝细胞培养至96 h时,DMSO组仍能较好地维持细胞形态,基础培养基组的细胞活力比DMSO组和DMSO+EGF组分别降低了66.87％和67.16％(P＜0.05),且基础培养基组的LDH水平均高于DMSO组和DMSO+EGF组(P＜0.05).此外DMSO组在96 h时仍能维持较高水平的白蛋白分泌,比基础培养基组和DMSO+EGF组分别增加了185％和24.2％(P＜0.05).结论:小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用,本研究为体外原代肝细胞培养模型的建立和优化提供了实用的方法.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2016(028)002【总页数】6页(P125-130)【关键词】小鼠;原代肝细胞培养;二甲基亚砜;表皮生长因子【作者】王珊;柏青;王方萍;李慧瑶;陈燊;何志妮;王庆;陈雯;陈丽萍【作者单位】中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080;中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州 510080【正文语种】中文【中图分类】R114【ABSTRACT】OBJECTIVE: To identify a better maintenance medium for primary hepatocyte culture in vitro，wecompare the cellular morphology and function of mouse primary hepatocytes under three different culture conditions.METHODS：Primary hepatocytes were isolated by using a modified two-step collagenase perfusion procedure asdescribed by Seglen. The purity of hepatocytes were determined by PAS staining. After plating for 4 h，the medium wasreplaced with three different maintenance medium (base medium，base medium supplemented with DMSO，base mediumsupplemented with DMSO and EGF). The cellular morphology was observed under an inverted microscope. The cellviability was measured using the MTT assay，the concentrations of lactate dehydrogenase (LDH) was detected by automaticbiochemical analyzer and the albumin level was examined using ELISA. RESULTS：Mouse primary hepatocytes weresuccessfully isolated with purity more than 95%. When primaryhepatocytes were cultured for 96 h ，only the DMSO grouphad better cell morphology. Viability of cells in the base medium group was reduced by 66.87% and 67.16% compared withthe DMSO and the DMSO+EGF groups (P＜0.05)，respectively. The LDH level of the base medium group was higher thanthe DMSO and the DMSO+EGF groups (P＜0.05). In addition，cells in the DMSO group had high level of albumin secretionat 96h which was 185% and 24.2% higher than the base medium and the DMSO+EGF group (P＜0.05)，respectively.CONCLUSION：DMSO addition to maintenance medium supported primary hepatocytes to maintain its morphology andfunction. Our study provides an applicable method for optimization of primary hepatocytes in culture.【KEY WORDS】mouse；primary hepatocyte culture；dimethyl sulfoxide；epidermal g rowth f actor原代肝细胞作为一种肝毒性评价体外模型，既能较好地保留肝脏的代谢功能，还可反映外源化学物的刺激，并能排除其他细胞、组织的影响，具有良好的可重复性，被认为是目前体外毒理学和药物试验的重要研究模型而得到广泛应用[1]。

Vo l.28No .12Dec 2012赤峰学院学报(自然科学版)J o urnal o f Chifeng University (Natural S cience Editio n )第28卷第12期(下)2012年12月建立体外的原代肝细胞培养模型,用于肝细胞分子生物学特征的研究,在肝病研究中发挥日益重要的作用.本研究采用改良的灌流方法将肝脏中的肝实质细胞分离、纯化、体外培养.为肝细胞体外实验研究奠定基础.1材料与方法1.1材料S P F (special pathog en free )级雄性C57BL/6小鼠,体重20～25g ,由中国科学院上海实验动物中心提供.Ⅳ型胶原酶购自sig ma 公司,高糖DMEM 干粉、Insulin-Transferrin-S ele-nium 购自Gibco 公司.C yto keratin 18抗体购自santa cruz 公司.FITC 标记的羊抗小鼠Ig G 购自上海博蕴生物公司.其余试剂均为国产分析纯.鼠尾胶自制.Langendo rff 灌流装置购自保定兰格恒流泵有限公司.超级恒温槽购自上海衡平仪器厂.1.2小鼠原代肝细胞培养方法提前30分钟打开恒温装置,用75%酒精100ml 清洗灌流装置,然后用100ml 含双抗的D-Hank ’s-EDTA (NaC l 8.0g ,KCl0.4g ,NaHC O 30.35g ,Na 2HP O 4·12H 2O0.06g ,KH 2P O 40.06g ,EDTA 0.2g ,Gluco se 1.0g ,硫酸链霉素0.1g ,青霉素G 钠0.06g )溶液清洗灌流装置,烧杯内留20ml 灌流肝脏;小鼠6%水合氯醛麻醉后,置入75%酒精中浸泡5分钟,转移至木板四肢固定;铺无菌巾,腹部”U ”型切口,暴露出门静脉,分离门静脉,远端穿线并结扎;开胸腔,止血钳夹住心尖,分离下腔静脉,下腔静脉下穿线备用,眼科剪在右心房剪一个小口,将P E50聚乙烯导管插入下腔静脉结扎;门静脉远端用眼科剪剪一个小口,止血钳夹住腹腔的腹腔静脉及其分支;打开蠕动泵,用D-Hank ’s-EDTA 溶液灌流至肝脏发白,将门静脉用动脉夹夹住,改用5%的Ⅳ型胶原酶45ml 灌流,直至全部灌完;铺无菌巾暴露出肝脏,将胸腔的下腔静脉剪断,棉签将胸腔内的血液吸干,切断肝脏周围的血管,将肝脏移入烧杯;将取下的肝脏移入超净台内,摘除胆囊,剥离肝脏包膜,用20ml 培养液将肝脏吹散,混匀液体用200目筛网过滤至另一烧杯内,收集置入离心管中.1000转/分钟,8分钟,弃上清;培养液重悬细胞沉淀,1000转/分钟,8分钟,离心2次;接种加入40ml 含有10%胎牛血清和1%Insulin-Transferrin-S elenium 的DMEM 含双抗悬浮沉淀,并用吸管充分吹打混匀.接种于铺鼠尾胶的60mm 培养皿中.置于37℃二氧化碳恒温培养箱中静置培养.4小时后换培养液,去掉不贴壁的细胞.以后隔2天换一次培养液.2细胞鉴定2.1免疫荧光鉴定细胞接种到12m m ×12mm 盖玻片上,培养至铺满80%左右;4%多聚甲醛室温固定20～30m in ,用PBS 洗3遍;1%羊血清+0.05%Triton 室温封闭30min ;用封闭液稀释一抗(1:100),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱孵育过夜;PBS 洗3遍,每次10min ;封闭液稀释二抗(1:200),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱避光孵育过夜;P BS 洗3遍,每次10min ;10%缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察,摄像(注意:实验中设置不加一抗,只加二抗的阴性对照).2.2透射电镜鉴定将培养生长成单层的细胞用刮匙刮下,2.5%戊二醛固定细胞,1%锇酸再固定,环氧树脂包埋,超薄切片机切片,透射电镜下观察细胞的显微结构.3结果3.1光镜观察Olym pus 光镜下培养4h 活细胞已基本贴壁,此时换液以去除血细胞及死细胞.肝细胞培养12h 后可见细胞贴附、小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定郝丹丹,张凤宁,瑞云,叶冬梅,贾晓丽,杨立新,乌英嘎(赤峰学院医学院,内蒙古赤峰024000)摘要:目的:寻求一种简单的原代小鼠肝细胞培养方法.方法采用Ⅳ型胶原酶原位灌流方法分离肝细胞,并采用免疫荧光和透射电镜方法对其进行鉴定.结果:光镜下细胞贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见.采用Cytokera tin 18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定,显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰.采用透射电镜鉴定,细胞在电镜下均可见到:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器.结论:成功地在体外培养了小鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定基础.关键词:小鼠;肝细胞;原代培养;鉴定中图分类号:R965.1文献标识码:A文章编号:1673-260X (2012)12-0091-02９１--. All Rights Reserved.图1倒置相差显微镜A(88×)B B(220×)C(880×)图2图3透射电镜下的肝细胞伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见(图1).3.2肝细胞鉴定3.2.1采用Cytokeratin18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定[1,2],显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰(图2).3.2.2采用透射电镜进行肝细胞鉴定,细胞在电镜下均可见到[1]:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器,如大量内质网,包括粗面内质网及滑面型内质网,大量的线粒体,其中有典型的车轮状线粒体,大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器(图3).4讨论本文采用改良的S eg len[3-5]二步灌注法分离培养C57BL/6小鼠肝细胞,采用无Ca2+、Mg2+的Hank’s-EDTA液及胶原酶原位两步灌注法,去除红细胞效果好,所分离的肝细胞较纯,细胞存活率高且节约胶原酶.实验操作时需注意以下几点:插管动作轻柔迅速,手术时间不宜过长;肝脏灌流以及移入超净台内的过程中要严格保持无菌.与乳鼠肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法[6]比较,本方法比较简单,时间短,分离的细胞存活率较高,是种简单可靠的肝细胞分离方法,是普通实验室开展肝细胞培养值得借鉴的方法.———————————————————参考文献:〔1〕Lazaro,C.A.,Croager,E.J.,Mitchell,C.et al.Estab⁃lishment,characterization,and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes[J].Hepatology, 2003,38(5):1095-1106.〔2〕Ku,N.O.,Liao,J.,Omary,M.B.Phosphorylation of human keratin18serine33regulates binding to14-3-3proteins[J].EMBO J,1998,17(7):1892-1906.〔3〕Renton,K.W.,Deloria,L.B.,Mannering,G.J.Ef⁃fects of polyribonoinosinic acid polyribocytidylic acid and a mouse interferon preparation on cytochrome P-450-dependent monooxygenase systems in cultures of primary mouse hepatocytes[J].Mol Pharmacol,1978,14 (4):672-681.〔4〕Michalopoulos,G.,Sattler,C.A.,Sattler,G.L.et al.Cytochrome P-450induction by phenobarbital and3-methylcholanthrene in primary cultures of hepatocytes[J].Science,1976,193(4256):907-909.〔5〕Seglen,P.O.Preparation of rat liver cells.3.Enzymat⁃ic requirements for tissue dispersion[J].Exp Cell Res, 1973,82(2):391-398.〔6〕张阳德,赖毅,赵俊玲.新生小鼠肝细胞的体外培养[J].中国现代医学杂志,2001,11(4).９２--. All Rights Reserved.。

原代肝细胞培养原代肝细胞培养1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。

消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。

Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。

麻醉剂：10%水合氯醛。

实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。

2. 实验前准备1) 灌流液Perfusion SolutionNaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose离子）。

用前37℃温育。

每只老鼠消耗15ml灌流液。

2）消化液100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。

10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。

消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。

每只老鼠消耗15ml消化液。

3）40%Percollg/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。

（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。

小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。

原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。

因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。

一般采用2-5代的细胞进行实验。

当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。

但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。

2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。

小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。

肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。

因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。

一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。

贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。

单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。

这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。

三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。

二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。

在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。

其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。

细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。

其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。

细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。

同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。

三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。

目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。

Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。

小鼠肝细胞原代培养实验一、实验材料准备1. 动物：小鼠。

2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM 培养基、胰酶、PBS 。

3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。

4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

二、方法1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS 的平皿中。

2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS 液的平皿中。

实验方法原理将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA ）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

实验材料小鼠试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM 培养基胰酶PBS仪器、耗材饭盒纱布剪子镊子烧杯平皿研磨玻片滤网离心管6孔培养板吸管移液管手套微量加样器2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。

4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。

6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7. 再次离心5 min，弃上清液。

8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。

10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。

本文将探讨原代肝细胞培养的方法。

原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。

它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。

原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。

首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。

一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。

然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。

常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。

这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。

接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。

一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。

在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。

此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。

然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。

首先，选择合适的培养基是非常重要的。

常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。

这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。

其次，细胞密度的控制也非常重要。

通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。

此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。

温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。

试验动物:８～９周龄健康雌性小鼠１０只。

供试小鼠自由饮食，二级饲养，试验前２４ｈ禁食。

主要试剂:1.Solution C:480Mm KCL120Mm MgSO4120Mm KH2PO42.Buffer A(1L):NaCL 7gNaHCO3 2g1M HEPES Ph7.45 5mlSolution c 10mlGlucose 1gAdd ddw and adjust pH to 7.43.灌洗液A:Buffer A with 1Mm EGTA +PS 过滤，37度温浴待用4.灌洗液B（50ml）：Buffer A with 5Mm CaCL2, 25mg胶原酶IV + PS 过滤，37度温浴待用5.胶原酶Ⅳ，购自Ｓｉｇｍａ公司；6.ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液7.透析胎牛血清（ＦＢＳ）8.青霉素－链霉素双抗9.0.4%的Trypan Blue：0.4g Trypan Blue to 100ml ddw用NaOH调PH值7.2-7.3, 4度储存。

步骤:1.经腹部注射巴比妥钠（50-100ｍｇ／ｋｇ）麻醉供试小鼠，5-10min。

70％乙醇消毒皮肤后，将小鼠移至超净工作台，固定于消毒的聚乙烯泡沫板上.2.剪开小鼠腹部，剥离皮肤，将静脉留置针插入肝脏门静脉，剪开下腔静脉，灌注预热（37 ℃）的灌注液A，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ3.至小鼠肝脏完全变灰黄、下腔静脉已无血丝流出时，改用３７～３８℃预热的灌注液B继续灌注小鼠肝脏，同时在下腔静脉插入留置针，通过医用输液管收集消化酶液，循环灌注液B，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ，持续灌注10～15min，使肝脏完全充盈消化酶液；4.剪下整个肝脏组织，将肝脏置于60mm培养皿中用10％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液终止消化，撕去肝包膜，用移液管轻轻吹吸两次，经100目网过滤到50ml离心管中，去除未消化肝脏组织块，补至30ml，于室温下1500转/分钟（50-80g）离心5ｍｉｎ重复2-3次，收集纯化的小鼠肝细胞，将纯化的小鼠肝脏细胞重悬于10ｍＬＲＰＭＩ－１６４０培养液中。

一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。

二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。

三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。

2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。

3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。

四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。

小鼠肝细胞的原代和传代培养的研究作者：李维维来源：《学校教育研究》2021年第07期一、实验原理细胞培养是用无菌操作的方法，将动物体内的组织取出，模拟体内的生理条件，在体外进行培养。

培养过程分为原代培养和传代培养。

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞，组织和器官，用无菌操作的方法，经销化，分散成为单个游离的细胞。

在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

传代培养是指细胞自从一个培养瓶以1：2比例转移，接种到另一培养瓶的培养。

这次实验我所用的抗生素瓶和小玻璃珠便用于细胞的传代培养。

本来这次实验用小玻璃珠，这种模式融汇了扩大贴壁面积和便于观察的优点，并且重演性好。

二、材料（一）实验动物乳鼠10只，体质量7～8g，刚出生三天，保持室温20℃～25℃;（二）实验器材空的抗生素瓶玻璃珠眼科剪眼科镊试管吸管等（三）实验试剂磷酸缓冲液（PBS）;平衡盐液：Hank原液 Hank液;细胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA钠盐液。

以上溶液经包装，灭菌后备用三、实验步骤（一）试剂的配制1.Hank原液与Hank液的配制配制程序：（1）称取1.4g Hank原液，溶于30～50ml的蒸馏水中。

（2）取1000ml烧杯及容量瓶各一个，先放蒸馏水800ml于烧杯中，然后逐一称取药品，但必须在前一药品溶解后，方可加入下一药品，充分混匀后，分装，盖紧瓶盖，写好标签，置于4°C冰箱保存。

2.胰蛋白溶液的配制3.0.02%的EDTA鈉盐溶液的配制4.水解乳蛋白—Hank液的配制5.E-MEM营养液的配制6.104U/ml青霉素、链霉素的配制（二）实验营养液的配制1.原代细胞营养液的配制2.传代细胞营养液的配制（三）培养器皿1.玻璃漏斗式滤器玻璃漏斗式滤器将滤板与玻璃漏斗烧结成一体，适用于各种培养用液的过滤除菌，但不宜血清等粘稠液体。

2.手术器械主要用于解剖动物，取材和原代培养中切割组织。

各种器械至少需配置两套3.培养瓶用于原代培养的需要卡氏瓶10～15瓶，而传代培养需用12～25个卡氏瓶，另准备5瓶抗生素瓶，每次用完后，清洗时一定要彻底，以防下次用时污染。

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。

1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。

1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。

2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。

5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。

待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。

1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。