细胞毒理学实验一小鼠肝细胞原代培养

细胞的原代培养实验报告一、实验目的细胞原代培养是指从机体取出细胞、组织或器官后，通过机械或酶学方法分散成单个细胞，在体外进行培养的过程。

本次实验的目的是掌握细胞原代培养的基本技术和方法，观察细胞在体外的生长和形态变化，为进一步的细胞生物学研究奠定基础。

二、实验原理细胞原代培养的关键在于保持细胞的活性和完整性，同时提供适宜的生长环境。

通常采用酶消化法或组织块培养法来获取单细胞或细胞团。

在培养过程中，细胞需要充足的营养物质、适宜的温度、pH 值和气体环境，以促进细胞的生长和分裂。

三、实验材料1、实验动物：新生小鼠2、试剂和培养基：DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、青霉素链霉素溶液、PBS 缓冲液等3、实验器材：超净工作台、CO₂培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器、培养瓶、培养皿、手术器械等四、实验步骤1、取材处死新生小鼠，用 75%酒精消毒其腹部皮肤。

用手术剪剪开腹部皮肤和肌肉，取出肝脏组织，置于预冷的 PBS缓冲液中。

2、组织处理将肝脏组织转移至培养皿中，用 PBS 缓冲液冲洗 2-3 次，去除血液和杂质。

用眼科剪将组织剪成 1-2mm³的小块。

3、酶消化将组织小块转移至离心管中，加入适量的胰蛋白酶EDTA 溶液，置于 37℃水浴中消化 15-20 分钟，期间每隔 5 分钟轻轻振荡一次。

消化结束后，加入等量的含血清的培养基终止消化，用移液器轻轻吹打制成细胞悬液。

4、细胞过滤将细胞悬液通过 200 目滤网过滤，去除未消化的组织块和细胞团。

5、细胞计数和接种吸取少量细胞悬液，加入台盼蓝染液，在显微镜下计数活细胞数。

根据细胞计数结果，将细胞以适当的密度接种于培养瓶或培养皿中，置于 CO₂培养箱中培养。

6、培养和观察培养 24 小时后，在倒置显微镜下观察细胞的贴壁情况。

每隔 2-3 天更换一次培养基，观察细胞的生长和形态变化。

五、实验结果1、细胞贴壁情况培养 24 小时后，大部分细胞已贴壁，呈圆形或多边形，贴壁细胞周围有光晕。

Vo l.28No .12Dec 2012赤峰学院学报(自然科学版)J o urnal o f Chifeng University (Natural S cience Editio n )第28卷第12期(下)2012年12月建立体外的原代肝细胞培养模型,用于肝细胞分子生物学特征的研究,在肝病研究中发挥日益重要的作用.本研究采用改良的灌流方法将肝脏中的肝实质细胞分离、纯化、体外培养.为肝细胞体外实验研究奠定基础.1材料与方法1.1材料S P F (special pathog en free )级雄性C57BL/6小鼠,体重20～25g ,由中国科学院上海实验动物中心提供.Ⅳ型胶原酶购自sig ma 公司,高糖DMEM 干粉、Insulin-Transferrin-S ele-nium 购自Gibco 公司.C yto keratin 18抗体购自santa cruz 公司.FITC 标记的羊抗小鼠Ig G 购自上海博蕴生物公司.其余试剂均为国产分析纯.鼠尾胶自制.Langendo rff 灌流装置购自保定兰格恒流泵有限公司.超级恒温槽购自上海衡平仪器厂.1.2小鼠原代肝细胞培养方法提前30分钟打开恒温装置,用75%酒精100ml 清洗灌流装置,然后用100ml 含双抗的D-Hank ’s-EDTA (NaC l 8.0g ,KCl0.4g ,NaHC O 30.35g ,Na 2HP O 4·12H 2O0.06g ,KH 2P O 40.06g ,EDTA 0.2g ,Gluco se 1.0g ,硫酸链霉素0.1g ,青霉素G 钠0.06g )溶液清洗灌流装置,烧杯内留20ml 灌流肝脏;小鼠6%水合氯醛麻醉后,置入75%酒精中浸泡5分钟,转移至木板四肢固定;铺无菌巾,腹部”U ”型切口,暴露出门静脉,分离门静脉,远端穿线并结扎;开胸腔,止血钳夹住心尖,分离下腔静脉,下腔静脉下穿线备用,眼科剪在右心房剪一个小口,将P E50聚乙烯导管插入下腔静脉结扎;门静脉远端用眼科剪剪一个小口,止血钳夹住腹腔的腹腔静脉及其分支;打开蠕动泵,用D-Hank ’s-EDTA 溶液灌流至肝脏发白,将门静脉用动脉夹夹住,改用5%的Ⅳ型胶原酶45ml 灌流,直至全部灌完;铺无菌巾暴露出肝脏,将胸腔的下腔静脉剪断,棉签将胸腔内的血液吸干,切断肝脏周围的血管,将肝脏移入烧杯;将取下的肝脏移入超净台内,摘除胆囊,剥离肝脏包膜,用20ml 培养液将肝脏吹散,混匀液体用200目筛网过滤至另一烧杯内,收集置入离心管中.1000转/分钟,8分钟,弃上清;培养液重悬细胞沉淀,1000转/分钟,8分钟,离心2次;接种加入40ml 含有10%胎牛血清和1%Insulin-Transferrin-S elenium 的DMEM 含双抗悬浮沉淀,并用吸管充分吹打混匀.接种于铺鼠尾胶的60mm 培养皿中.置于37℃二氧化碳恒温培养箱中静置培养.4小时后换培养液,去掉不贴壁的细胞.以后隔2天换一次培养液.2细胞鉴定2.1免疫荧光鉴定细胞接种到12m m ×12mm 盖玻片上,培养至铺满80%左右;4%多聚甲醛室温固定20～30m in ,用PBS 洗3遍;1%羊血清+0.05%Triton 室温封闭30min ;用封闭液稀释一抗(1:100),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱孵育过夜;PBS 洗3遍,每次10min ;封闭液稀释二抗(1:200),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱避光孵育过夜;P BS 洗3遍,每次10min ;10%缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察,摄像(注意:实验中设置不加一抗,只加二抗的阴性对照).2.2透射电镜鉴定将培养生长成单层的细胞用刮匙刮下,2.5%戊二醛固定细胞,1%锇酸再固定,环氧树脂包埋,超薄切片机切片,透射电镜下观察细胞的显微结构.3结果3.1光镜观察Olym pus 光镜下培养4h 活细胞已基本贴壁,此时换液以去除血细胞及死细胞.肝细胞培养12h 后可见细胞贴附、小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定郝丹丹,张凤宁,瑞云,叶冬梅,贾晓丽,杨立新,乌英嘎(赤峰学院医学院,内蒙古赤峰024000)摘要:目的:寻求一种简单的原代小鼠肝细胞培养方法.方法采用Ⅳ型胶原酶原位灌流方法分离肝细胞,并采用免疫荧光和透射电镜方法对其进行鉴定.结果:光镜下细胞贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见.采用Cytokera tin 18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定,显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰.采用透射电镜鉴定,细胞在电镜下均可见到:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器.结论:成功地在体外培养了小鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定基础.关键词:小鼠;肝细胞;原代培养;鉴定中图分类号:R965.1文献标识码:A文章编号:1673-260X (2012)12-0091-02９１--. All Rights Reserved.图1倒置相差显微镜A(88×)B B(220×)C(880×)图2图3透射电镜下的肝细胞伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见(图1).3.2肝细胞鉴定3.2.1采用Cytokeratin18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定[1,2],显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰(图2).3.2.2采用透射电镜进行肝细胞鉴定,细胞在电镜下均可见到[1]:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器,如大量内质网,包括粗面内质网及滑面型内质网,大量的线粒体,其中有典型的车轮状线粒体,大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器(图3).4讨论本文采用改良的S eg len[3-5]二步灌注法分离培养C57BL/6小鼠肝细胞,采用无Ca2+、Mg2+的Hank’s-EDTA液及胶原酶原位两步灌注法,去除红细胞效果好,所分离的肝细胞较纯,细胞存活率高且节约胶原酶.实验操作时需注意以下几点:插管动作轻柔迅速,手术时间不宜过长;肝脏灌流以及移入超净台内的过程中要严格保持无菌.与乳鼠肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法[6]比较,本方法比较简单,时间短,分离的细胞存活率较高,是种简单可靠的肝细胞分离方法,是普通实验室开展肝细胞培养值得借鉴的方法.———————————————————参考文献:〔1〕Lazaro,C.A.,Croager,E.J.,Mitchell,C.et al.Estab⁃lishment,characterization,and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes[J].Hepatology, 2003,38(5):1095-1106.〔2〕Ku,N.O.,Liao,J.,Omary,M.B.Phosphorylation of human keratin18serine33regulates binding to14-3-3proteins[J].EMBO J,1998,17(7):1892-1906.〔3〕Renton,K.W.,Deloria,L.B.,Mannering,G.J.Ef⁃fects of polyribonoinosinic acid polyribocytidylic acid and a mouse interferon preparation on cytochrome P-450-dependent monooxygenase systems in cultures of primary mouse hepatocytes[J].Mol Pharmacol,1978,14 (4):672-681.〔4〕Michalopoulos,G.,Sattler,C.A.,Sattler,G.L.et al.Cytochrome P-450induction by phenobarbital and3-methylcholanthrene in primary cultures of hepatocytes[J].Science,1976,193(4256):907-909.〔5〕Seglen,P.O.Preparation of rat liver cells.3.Enzymat⁃ic requirements for tissue dispersion[J].Exp Cell Res, 1973,82(2):391-398.〔6〕张阳德,赖毅,赵俊玲.新生小鼠肝细胞的体外培养[J].中国现代医学杂志,2001,11(4).９２--. All Rights Reserved.。

小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

细胞原代培养方法1. 胰酶消化法(1) 器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏，置平皿中。

(2) 用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

130(3) 用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2)，再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

(4) 视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

(5) 加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。

(6) 静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

(7) 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

(8) 加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

(9) 加入培养液l—2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。

(10) 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。

细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同(如胶原酶，透明质酶等)。

2. 组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中(勿使组织漂起)，37℃继续培养。

3. 贴壁细胞传代方法(1) 吸光培养瓶中的培养液。

(2) 加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置2-10min(显微镜下动态监测) 。

(3) 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。

(4) 吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。

(5) 吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内。

(6) 加适量新鲜培养液于新培养瓶内。

一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。

二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。

三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。

2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。

3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。

四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。

小鼠肝细胞的原代和传代培养的研究作者：李维维来源：《学校教育研究》2021年第07期一、实验原理细胞培养是用无菌操作的方法，将动物体内的组织取出，模拟体内的生理条件，在体外进行培养。

培养过程分为原代培养和传代培养。

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞，组织和器官，用无菌操作的方法，经销化，分散成为单个游离的细胞。

在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

传代培养是指细胞自从一个培养瓶以1：2比例转移，接种到另一培养瓶的培养。

这次实验我所用的抗生素瓶和小玻璃珠便用于细胞的传代培养。

本来这次实验用小玻璃珠，这种模式融汇了扩大贴壁面积和便于观察的优点，并且重演性好。

二、材料（一）实验动物乳鼠10只，体质量7～8g，刚出生三天，保持室温20℃～25℃;（二）实验器材空的抗生素瓶玻璃珠眼科剪眼科镊试管吸管等（三）实验试剂磷酸缓冲液（PBS）;平衡盐液：Hank原液 Hank液;细胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA钠盐液。

以上溶液经包装，灭菌后备用三、实验步骤（一）试剂的配制1.Hank原液与Hank液的配制配制程序：（1）称取1.4g Hank原液，溶于30～50ml的蒸馏水中。

（2）取1000ml烧杯及容量瓶各一个，先放蒸馏水800ml于烧杯中，然后逐一称取药品，但必须在前一药品溶解后，方可加入下一药品，充分混匀后，分装，盖紧瓶盖，写好标签，置于4°C冰箱保存。

2.胰蛋白溶液的配制3.0.02%的EDTA鈉盐溶液的配制4.水解乳蛋白—Hank液的配制5.E-MEM营养液的配制6.104U/ml青霉素、链霉素的配制（二）实验营养液的配制1.原代细胞营养液的配制2.传代细胞营养液的配制（三）培养器皿1.玻璃漏斗式滤器玻璃漏斗式滤器将滤板与玻璃漏斗烧结成一体，适用于各种培养用液的过滤除菌，但不宜血清等粘稠液体。

2.手术器械主要用于解剖动物，取材和原代培养中切割组织。

各种器械至少需配置两套3.培养瓶用于原代培养的需要卡氏瓶10～15瓶，而传代培养需用12～25个卡氏瓶，另准备5瓶抗生素瓶，每次用完后，清洗时一定要彻底，以防下次用时污染。

一、实验材料准备1. 动物：小鼠。

2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM 培养基、胰酶、PBS 。

3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。

4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

二、方法1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS 的平皿中。

2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS 液的平皿中。

实验方法原理 将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA ）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

实验材料 小鼠试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM 培养基 胰酶PBS仪器、耗材 饭盒 纱布 剪子 镊子 烧杯 平皿 研磨玻片 滤网 离心管 6孔培养板 吸管移液管 手套 微量加样器2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。

4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。

6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7. 再次离心5 min，弃上清液。

8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。

10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。

原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。

因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。

一般采用2-5代的细胞进行实验。

当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。

但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。

2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。

1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。

1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。

2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。

5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。

待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。

1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。

小鼠肝细胞培养的方法优化及其应用近年来，小鼠肝细胞在许多生物医学研究中扮演着至关重要的角色。

小鼠肝细胞培养是研究肝功能和疾病发生机制的重要手段，但它的成功与否则依赖于培养方法的质量和有效性。

因此，本文将探讨小鼠肝细胞培养的方法优化及其应用。

一、小鼠肝细胞培养的基本要素在小鼠肝细胞培养前，我们需要对一些基本要素有所了解。

首先是培养基的选择，培养基中的主要成分包括营养元素、生长因子、血清和抗生素等。

其次是小鼠肝细胞的来源，可以是肝组织、肝细胞分离后培养或者肝细胞株。

最后是培养环境的控制，包括温度、CO2浓度、湿度等因素。

基于以上要素，我们可以通过以下几个方面来优化小鼠肝细胞培养方法。

二、培养基的优化培养基中的营养元素和血清等因素的浓度会影响细胞的代谢和增殖。

经过不断的调整和改进，研究人员发现一些培养基组合能够更好地维持小鼠肝细胞的代谢需求和增殖能力。

例如，Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）添加适量的生长因子（如表皮生长因子、胰岛素样生长因子和基质金属蛋白酶）和血清可有效提高小鼠肝细胞培养的成功率和长期维持细胞的质量。

三、小鼠肝细胞来源的优化小鼠肝细胞的来源通常可以是肝组织、肝细胞分离后培养或者肝细胞株。

一般来说，从小鼠肝组织取得肝细胞可获得更好的细胞活性和代谢能力。

特别地，通过胆汁灌注分离法得到的小鼠肝细胞，更为有效和高质量。

四、培养环境的优化培养环境中的温度、湿度和CO2浓度等因素对小鼠肝细胞的生长和代谢都会产生影响。

一般情况下，20-25°C的室温、5%CO2浓度和相对湿度在50-70%之间是最为适宜的条件。

在细胞培养过程中，应尽可能避免一些较大的生理环境波动，以维持细胞充足的营养和稳定的代谢水平。

总之，小鼠肝细胞的培养方法优化能够提高小鼠肝细胞的长期保存能力和维持其正常生理和代谢状态。

在生物医学领域的广泛应用中，小鼠肝细胞培养将为寻找肝疾病的防治策略和治疗方案提供更多的科学依据。

细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。

小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。

㈡、[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。

2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。

3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。

（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。

实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。

2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。

3．初步掌握无菌操作方法。

二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。

细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。

因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。

细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。

如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。

为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。

原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。

三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。

原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。

长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。

早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。

机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。

后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。

后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。

胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。

胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。

这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。

这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。

因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。

Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。

本研究在其基础上略加改进。

作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。

胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。

事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。

在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。