小鼠肝细胞原代培养ppt课件

Vo l.28No .12Dec 2012赤峰学院学报(自然科学版)J o urnal o f Chifeng University (Natural S cience Editio n )第28卷第12期(下)2012年12月建立体外的原代肝细胞培养模型,用于肝细胞分子生物学特征的研究,在肝病研究中发挥日益重要的作用.本研究采用改良的灌流方法将肝脏中的肝实质细胞分离、纯化、体外培养.为肝细胞体外实验研究奠定基础.1材料与方法1.1材料S P F (special pathog en free )级雄性C57BL/6小鼠,体重20～25g ,由中国科学院上海实验动物中心提供.Ⅳ型胶原酶购自sig ma 公司,高糖DMEM 干粉、Insulin-Transferrin-S ele-nium 购自Gibco 公司.C yto keratin 18抗体购自santa cruz 公司.FITC 标记的羊抗小鼠Ig G 购自上海博蕴生物公司.其余试剂均为国产分析纯.鼠尾胶自制.Langendo rff 灌流装置购自保定兰格恒流泵有限公司.超级恒温槽购自上海衡平仪器厂.1.2小鼠原代肝细胞培养方法提前30分钟打开恒温装置,用75%酒精100ml 清洗灌流装置,然后用100ml 含双抗的D-Hank ’s-EDTA (NaC l 8.0g ,KCl0.4g ,NaHC O 30.35g ,Na 2HP O 4·12H 2O0.06g ,KH 2P O 40.06g ,EDTA 0.2g ,Gluco se 1.0g ,硫酸链霉素0.1g ,青霉素G 钠0.06g )溶液清洗灌流装置,烧杯内留20ml 灌流肝脏;小鼠6%水合氯醛麻醉后,置入75%酒精中浸泡5分钟,转移至木板四肢固定;铺无菌巾,腹部”U ”型切口,暴露出门静脉,分离门静脉,远端穿线并结扎;开胸腔,止血钳夹住心尖,分离下腔静脉,下腔静脉下穿线备用,眼科剪在右心房剪一个小口,将P E50聚乙烯导管插入下腔静脉结扎;门静脉远端用眼科剪剪一个小口,止血钳夹住腹腔的腹腔静脉及其分支;打开蠕动泵,用D-Hank ’s-EDTA 溶液灌流至肝脏发白,将门静脉用动脉夹夹住,改用5%的Ⅳ型胶原酶45ml 灌流,直至全部灌完;铺无菌巾暴露出肝脏,将胸腔的下腔静脉剪断,棉签将胸腔内的血液吸干,切断肝脏周围的血管,将肝脏移入烧杯;将取下的肝脏移入超净台内,摘除胆囊,剥离肝脏包膜,用20ml 培养液将肝脏吹散,混匀液体用200目筛网过滤至另一烧杯内,收集置入离心管中.1000转/分钟,8分钟,弃上清;培养液重悬细胞沉淀,1000转/分钟,8分钟,离心2次;接种加入40ml 含有10%胎牛血清和1%Insulin-Transferrin-S elenium 的DMEM 含双抗悬浮沉淀,并用吸管充分吹打混匀.接种于铺鼠尾胶的60mm 培养皿中.置于37℃二氧化碳恒温培养箱中静置培养.4小时后换培养液,去掉不贴壁的细胞.以后隔2天换一次培养液.2细胞鉴定2.1免疫荧光鉴定细胞接种到12m m ×12mm 盖玻片上,培养至铺满80%左右;4%多聚甲醛室温固定20～30m in ,用PBS 洗3遍;1%羊血清+0.05%Triton 室温封闭30min ;用封闭液稀释一抗(1:100),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱孵育过夜;PBS 洗3遍,每次10min ;封闭液稀释二抗(1:200),滴加到含细胞的盖玻片上;4℃冰箱避光孵育过夜;P BS 洗3遍,每次10min ;10%缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察,摄像(注意:实验中设置不加一抗,只加二抗的阴性对照).2.2透射电镜鉴定将培养生长成单层的细胞用刮匙刮下,2.5%戊二醛固定细胞,1%锇酸再固定,环氧树脂包埋,超薄切片机切片,透射电镜下观察细胞的显微结构.3结果3.1光镜观察Olym pus 光镜下培养4h 活细胞已基本贴壁,此时换液以去除血细胞及死细胞.肝细胞培养12h 后可见细胞贴附、小鼠肝实质细胞原代培养方法及鉴定郝丹丹,张凤宁,瑞云,叶冬梅,贾晓丽,杨立新,乌英嘎(赤峰学院医学院,内蒙古赤峰024000)摘要:目的:寻求一种简单的原代小鼠肝细胞培养方法.方法采用Ⅳ型胶原酶原位灌流方法分离肝细胞,并采用免疫荧光和透射电镜方法对其进行鉴定.结果:光镜下细胞贴附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见.采用Cytokera tin 18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定,显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰.采用透射电镜鉴定,细胞在电镜下均可见到:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器.结论:成功地在体外培养了小鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定基础.关键词:小鼠;肝细胞;原代培养;鉴定中图分类号:R965.1文献标识码:A文章编号:1673-260X (2012)12-0091-02９１--. All Rights Reserved.图1倒置相差显微镜A(88×)B B(220×)C(880×)图2图3透射电镜下的肝细胞伸展、呈圆形、椭圆形及多边形.细胞核体积较大,其中有许多双核的肝细胞.细胞浆为颗粒状,细胞边界轮廓清晰可见(图1).3.2肝细胞鉴定3.2.1采用Cytokeratin18的抗体进行肝细胞免疫荧光染色鉴定[1,2],显示细胞染上绿色荧光,细胞轮廓清晰(图2).3.2.2采用透射电镜进行肝细胞鉴定,细胞在电镜下均可见到[1]:肝细胞上有大量微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞浆内有丰富的细胞器,如大量内质网,包括粗面内质网及滑面型内质网,大量的线粒体,其中有典型的车轮状线粒体,大量玫瑰花瓣形的糖原颗粒等细胞器(图3).4讨论本文采用改良的S eg len[3-5]二步灌注法分离培养C57BL/6小鼠肝细胞,采用无Ca2+、Mg2+的Hank’s-EDTA液及胶原酶原位两步灌注法,去除红细胞效果好,所分离的肝细胞较纯,细胞存活率高且节约胶原酶.实验操作时需注意以下几点:插管动作轻柔迅速,手术时间不宜过长;肝脏灌流以及移入超净台内的过程中要严格保持无菌.与乳鼠肝组织块外植培养和肝组织块胶原酶消化法[6]比较,本方法比较简单,时间短,分离的细胞存活率较高,是种简单可靠的肝细胞分离方法,是普通实验室开展肝细胞培养值得借鉴的方法.———————————————————参考文献:〔1〕Lazaro,C.A.,Croager,E.J.,Mitchell,C.et al.Estab⁃lishment,characterization,and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes[J].Hepatology, 2003,38(5):1095-1106.〔2〕Ku,N.O.,Liao,J.,Omary,M.B.Phosphorylation of human keratin18serine33regulates binding to14-3-3proteins[J].EMBO J,1998,17(7):1892-1906.〔3〕Renton,K.W.,Deloria,L.B.,Mannering,G.J.Ef⁃fects of polyribonoinosinic acid polyribocytidylic acid and a mouse interferon preparation on cytochrome P-450-dependent monooxygenase systems in cultures of primary mouse hepatocytes[J].Mol Pharmacol,1978,14 (4):672-681.〔4〕Michalopoulos,G.,Sattler,C.A.,Sattler,G.L.et al.Cytochrome P-450induction by phenobarbital and3-methylcholanthrene in primary cultures of hepatocytes[J].Science,1976,193(4256):907-909.〔5〕Seglen,P.O.Preparation of rat liver cells.3.Enzymat⁃ic requirements for tissue dispersion[J].Exp Cell Res, 1973,82(2):391-398.〔6〕张阳德,赖毅,赵俊玲.新生小鼠肝细胞的体外培养[J].中国现代医学杂志,2001,11(4).９２--. All Rights Reserved.。

原代肝细胞培养原代肝细胞培养1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。

消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。

Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。

麻醉剂：10%水合氯醛。

实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。

2. 实验前准备1) 灌流液Perfusion SolutionNaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose离子）。

用前37℃温育。

每只老鼠消耗15ml灌流液。

2）消化液100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。

10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。

消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。

每只老鼠消耗15ml消化液。

3）40%Percollg/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。

（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。

小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。

原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。

因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。

一般采用2-5代的细胞进行实验。

当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。

但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。

2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。

小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

试验动物:８～９周龄健康雌性小鼠１０只。

供试小鼠自由饮食，二级饲养，试验前２４ｈ禁食。

主要试剂:1.Solution C:480Mm KCL120Mm MgSO4120Mm KH2PO42.Buffer A(1L):NaCL 7gNaHCO3 2g1M HEPES Ph7.45 5mlSolution c 10mlGlucose 1gAdd ddw and adjust pH to 7.43.灌洗液A:Buffer A with 1Mm EGTA +PS 过滤，37度温浴待用4.灌洗液B（50ml）：Buffer A with 5Mm CaCL2, 25mg胶原酶IV + PS 过滤，37度温浴待用5.胶原酶Ⅳ，购自Ｓｉｇｍａ公司；6.ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液7.透析胎牛血清（ＦＢＳ）8.青霉素－链霉素双抗9.0.4%的Trypan Blue：0.4g Trypan Blue to 100ml ddw用NaOH调PH值7.2-7.3, 4度储存。

步骤:1.经腹部注射巴比妥钠（50-100ｍｇ／ｋｇ）麻醉供试小鼠，5-10min。

70％乙醇消毒皮肤后，将小鼠移至超净工作台，固定于消毒的聚乙烯泡沫板上.2.剪开小鼠腹部，剥离皮肤，将静脉留置针插入肝脏门静脉，剪开下腔静脉，灌注预热（37 ℃）的灌注液A，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ3.至小鼠肝脏完全变灰黄、下腔静脉已无血丝流出时，改用３７～３８℃预热的灌注液B继续灌注小鼠肝脏，同时在下腔静脉插入留置针，通过医用输液管收集消化酶液，循环灌注液B，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ，持续灌注10～15min，使肝脏完全充盈消化酶液；4.剪下整个肝脏组织，将肝脏置于60mm培养皿中用10％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液终止消化，撕去肝包膜，用移液管轻轻吹吸两次，经100目网过滤到50ml离心管中，去除未消化肝脏组织块，补至30ml，于室温下1500转/分钟（50-80g）离心5ｍｉｎ重复2-3次，收集纯化的小鼠肝细胞，将纯化的小鼠肝脏细胞重悬于10ｍＬＲＰＭＩ－１６４０培养液中。

小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。

原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。

因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。

一般采用2-5代的细胞进行实验。

当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。

但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。

2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。

1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。

1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。

2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。

5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。

待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。

1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。

原代小鼠肝细胞体外培养的研究附图图２－１植块法培养３ｄ的肝细胞（ｘ１０）Ｆｉ９２－１Ｅｘｐｌａｎｔｓｃｕｌｔｕｒｅｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｆｏｒ３ｄａｙｓ图２－２分离细胞法培养３ｄ的肝细胞（×１０）Ｆｉ９２－２Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｆｏｒ３ｄａｙｓ图２－３经ＰＡＳ糖原染色的肝细胞ｐ７ＪＦｉ９２—３ＢｙＰＡＳｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ３３陕西科技大学硕士学位论文图２－４经台盼蓝染色的肝细胞（ｘ１０）Ｆｉ９２－４Ｂｙｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ图２－５刚分离制备的肝细胞（ｘ４０）Ｆｉ９２－５Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ原代小鼠肝细胞体外培养的研究图３－３Ａｌｂ分泌量图３—４培养第３天细胞密度Ｆｉ９３··３ＡｌｂｓｅｃｒｅｔｉｏｎＦｉ９３－４Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３ｄａｙｓ根据ｐＨ变化的缓慢程度、培养第三天细胞密度的高低、Ｕｒｅａ和Ａｌｂ生成量、稳定性的综合比较，最后选择转速为１５００ｒ／ｒａｉｎ。

３．３．１．２离心时间的研究图３－５培养上清．旋ｐＨ变化图３－６Ｕｒｅａ生成量Ｆｉ９３—５ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｐＨｃｈａｎｇｅＦｉ９３·６Ｕｒｅａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ图３－７Ａｌｂ分泌量图３－８培养第３天细胞密度Ｆｉ９３—７ＡｌｂｓｅｃｒｅｔｉｏｎＦｉ９３—８Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３ｄａｙｓ根据ｐＨ变化的缓慢程度、细胞密度的高低、Ｕｒｅａ和Ａｌｂ生成量、稳定性的综合比较，最后选择离心时间１５ｍｉｎ。

陕西科技大学硕士学位论文３．３．１．３合成培养液ｐＨ的研究图３－９培养上清波ｐＨ变化Ｆｉ９３·９ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｐＨｃｈａｎｇｅ图３一１０Ｕｒｅａ生成量Ｆｉ９３·１０Ｕｒｅａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ图３－１１Ａｌｂ分泌量图３－１２培养第３天细胞密度Ｆｉ９３··１１ＡｌｂｓｅｃｒｅｔｉｏｎＦｉ９３－１２Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３ｄａｙｓ根据培养上清液ｐＨ变化的缓慢程度、细胞密度的高低、上清液中Ｕｒｅａ和Ａｌｂ生成量、稳定性的比较，最后选择合成培养液ｐＨ７．２０．３．３．１．４发酵液加量的研究图３－１３培养上清液ｐＨ变化Ｆｉ９３—１３ＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｐＨｃｈａｎｇｅ图３－１４Ｕｒｅａ生成量Ｆｉ９３－１４Ｕｒｅａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ。

1、在前一天晚上铺三明治培养基的下层胶：100ml超纯水+114ul冰醋酸，然后到细胞房超净台用0.22um的滤膜过滤后加入1.6ml 的I型鼠尾胶原后铺板6-well plate：1000ul12-well plate：500ul24-well plate：250ul96-well plate：30ul铺板后晃荡混匀，打开盖子置于超净台中，开紫外灯过夜，第二天吸弃上层液体，收起plate备用（若要放置长时间，则要用封口膜）；2、在前一天确认buffer1、beffer2（未加酶）是否准备好Buffer1：1*EBSS，0.5mM EGTA，无Ca、Mg；Buffer2：1*EBSS，0.2mg/ml 胶原酶IV，10mM HEPES（500ml；1.191g），2mM CaCl（500ml；0.11g）两种buffer都用NaHCO3调pH至7.3~7.5，不可低于7.3；3、当天上午器材灭菌，两个铁饭盒，one for剪刀，小镊子，橡胶管，细线，another for三个筛子，2把弯头镊子,1把剪刀；两个fisher瓶子装过滤后的buffer1,buffer2；4、准备30ml的WEM（或DMEM）置于4°，盛放剥下的肝脏；预先打开37°水浴槽两个；buffer1,buffer2过滤除菌，并置于37°中预热；检查泵是否正常工作；※灌流一只20g左右的小鼠肝脏，buffer1需100ml即够，buffer2需60ml，加0.18mg/ml 的胶原酶IV。

5、解剖腹腔与胸腔之间的部分，找到门静脉顺行插管，（橡皮管内径为4.8mm），先用buffer1灌注，调节流速为3.1rpm（约5ml/min），灌流6min。

然后用buffer2，调节流速为3.1rpm，将60mlbuffer2灌完（最好控制在8min内）；6、剪下肝脏组织放至预先放在4°冰箱的WEM中；去细胞房预冷离心机7、准备4-5个10cm dish，将肝脏并WEM一并倒入dish清洗一下，转入倒有DMEM的dish中，用镊子轻轻撕去肝脏表面一层膜（撕时要抖动，以便干细胞掉下来），再将肝脏转入新dish中继续撕；8、将dish中的细胞悬液倒入筛子中，用新dish盛接，筛下来的细胞悬液转移至50ml离心管；9、初步离心，50g，2min，4°，吸弃上清；离心过程中配制梯度离心液：5ml 10*PBS + 45ml percoll + 50ml DMEM10、加25ml梯度离心液重悬（先加2ml重悬，再补加）：1500rpm 8min，4°，吸弃上清；离心过程中配制PM液11、加30ml DMEM重悬50g，2min，4°，吸弃上清；12、重复步骤11（可不重复）；13、加入PM 5ml（根据细胞量来决定加多少），混匀后计数6孔板，2ml，5*10E5个/ml14、4h后换PM液（PM要预热）24h后换成FM液（若铺上胶则不能预热）。