细胞生物学小鼠细胞培养实验报告

广州大学

综合设计性实验报告

学院生命科学学院

课程细胞生物学实验

实验项目细胞培养

实验题目小鼠肝细胞的原代培养

专业生物技术

年级、班别生技142 姓名徐嘉宽

学号 1414300030 任课教师陈鲲

细胞培养

——小鼠细胞的原代培养

摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。

关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法

1前言

初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。

2实验原理

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。

3实验用品

3.1器材

解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。

3.2试剂

3.2.1清洗用液：5%稀盐酸、1%稀盐酸、2%NaOH、洗洁精、单蒸水、三蒸水、清洗液（用

浓硫酸和重铬酸钾配制、全班共用）等。

3.2.2消毒剂（用前配制）：甲醛、高锰酸钾、新洁尔灭、75%酒精、碘酒、过氧乙酸等。

3.2.3 培养用液：

3.2.3.1 细胞培养用液（每大组100mL，用100mL盐水瓶装）：经过滤过的F10 （RPMI1640）

培养基占80~90%、经过滤除菌的小牛血清占10~20%,加入经过滤除菌、终浓度各为

100国际单位的抗菌素。

3.2.3.2细胞消化液（每小组1青霉素瓶，约5mL）：经过滤除菌的0.25%胰蛋白酶或

EDTA—胰蛋白酶液。

3.2.3.3平衡盐溶液：不含钙、镁离子的Hank液：每组约50mL，用50（或100）mL 盐

水瓶装。

3.3 材料

新生白小鼠

4实验方法

4.1技术路线

清洗玻璃仪器,胶塞→制备消毒棉球→包装分装培养液用液用品→消毒分装培养用液用品→分装培养用液→包装原代培养接种用品→实验时的准备工作如小组所示→在小组其他成员已打开腹腔的基础上切取小鼠肾（心肌、脑）组织块→洗去血污→剔除多余成份→剪成小于1mm³大小的植块→接种→贴壁→培养→观察和记录

4.2实验步骤

a)玻璃仪器的初步清洗、开始培育小白鼠（第一批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口

的情况等）

b)继续培养乳鼠（第二批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等），玻璃仪器的

清洗（清洗液浸泡）、胶制品的清洗。

c)继续培养乳鼠（常规饲养工作）、完成清洗工作（包括各类物品）、制备消毒用棉球、

包装分装培养用液用品。

d)继续培养乳鼠（常规饲养工作、留意小鼠的出生）、消毒分装培养用液用品、分装

培养用液、包装原代培养接种用品。

e)消毒原代培养接种用品

f)细胞原代培养

(1)洗手操作者用洗涤剂刷洗双手→自来水冲净→新洁尔灭浸泡→进入无菌室

(2)准备工作：

［1］操作者于超净台内用酒精棉球消毒双手，待酒精稍干后，然后用酒精棉球消毒工作面。

［2］去掉Hank液、细胞培养液、酶液的包装纸。

［3］打开试管、吸管胶头包装，将试管插（尽量斜插）入试管架

［4］取出需用的吸管（直、弯吸管各一支，刻度吸管一支）套上胶头，试管一支，插入相应的试管中。

［5］打开培养皿以及解剖工具手持端的包装

(3)处死小鼠(脱臼法)→消毒（放入含75%酒精的烧杯中浸泡数秒）。将以处死消毒

的小鼠转移至超净工作台内的培养皿盖内，背部朝上。培养皿倒扣于包装纸上

待用。

(4)解剖取肾：用酒精棉球擦拭背部，在腰部后缘用解剖镊提起皮肤，用解剖剪呈

倒T形剪开皮肤，再用解剖剪剪开腰部两侧肌肉，用眼科剪拿出2个肾脏置于

无菌培养皿中。

(5)用Hank液洗涤皮肤组织2次，吸去Hank。

(6)剪碎组织块：换另一套眼科剪将组织块剪成小于1mm³的组织块（大小尽量一致）。

用Hank液洗涤，弃Hank液。

(7)酶消化：将胰蛋白酶液加入装有组织块的青霉素瓶中，盖紧盖子，置超净工作

台内中消化5—10min，知道组织块变松软、粘稠状，颜色略变白色为止。

(8)将培养液直接加入盛有胰蛋白酶和皮肤组织块的青霉素瓶中，利用其中的牛血

清终止酶消化的作用，弃去酶液和培养液的混合液。加入培养液重复此操作

2—3次。

(9)取一培养瓶，在培养瓶的上面做好标志（在瓶侧注明班、组别、姓名、材料名

称等信息）

(10)用培养液湿润的吸管小心吸取组织块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面内,按照

一定的间隔和形式用弯吸管将植块排列好

(11)翻转培养瓶（培养面在上方），加入4ml的培养液。

(12)将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱内,静置（加入的培养液不浸泡植块，不

从瓶口流出）

(13)按相同的方法取出心脏和脑组织，清洗后直接植块培养。

(14)4小时后，待组织块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮；

(15)观察至于37度培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：

［1］培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。

［2］细胞生长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。

可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。

［3］培养液若变为桔红色，一般表示细胞生长良好。经过1～2天培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌

操作（若经过1～2天培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液。

无菌室的准备工作如小组方案中所示：

1)从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台内吸去全部旧培养液；

2)用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1～2次,弃平衡盐溶液；

3)加入与换液前相同的量的培养液；

4)放回原来的培养箱继续培养。

若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。

每日观察结果用文字记录，换液也需记录，在整个培养过程的不同阶段（最少在前、中、后阶段）置倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。