原代细胞培养：原代肝细胞

细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。

细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。

细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。

一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。

原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。

步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。

2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。

3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。

4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。

5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。

二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。

步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。

2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。

3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。

4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。

5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。

6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。

三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。

操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。

2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。

3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。

4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。

原代肝细胞培养原代肝细胞培养1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。

消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。

Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。

麻醉剂：10%水合氯醛。

实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。

2. 实验前准备1) 灌流液Perfusion SolutionNaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose离子）。

用前37℃温育。

每只老鼠消耗15ml灌流液。

2）消化液100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。

10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。

消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。

每只老鼠消耗15ml消化液。

3）40%Percollg/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。

（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。

原代肝细胞分离培养与方法肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞.1 非酶分离细胞法1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。

该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。

但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。

1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。

的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。

该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。

但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。

可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。

2．离体肝脏酶消化分离法2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。

的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。

胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。

心肌细胞或肝细胞原代培养的方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。

肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。

因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。

一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。

贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。

单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。

这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。

三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。

二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。

在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。

其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。

细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。

其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。

细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。

同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。

三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。

目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。

Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。

原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。

本文将探讨原代肝细胞培养的方法。

原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。

它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。

原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。

首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。

一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。

然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。

常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。

这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。

接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。

一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。

在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。

此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。

然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。

首先，选择合适的培养基是非常重要的。

常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。

这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。

其次，细胞密度的控制也非常重要。

通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。

此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。

温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。

细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程实验试剂培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。

D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存）0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃保存）)PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配）0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mLOverlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配）Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2•6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4•7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）实验仪器CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）；Sigma高速离心机；IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）；Sigma5310离心机；ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。

试验动物:８～９周龄健康雌性小鼠１０只。

供试小鼠自由饮食，二级饲养，试验前２４ｈ禁食。

主要试剂:1.Solution C:480Mm KCL120Mm MgSO4120Mm KH2PO42.Buffer A(1L):NaCL 7gNaHCO3 2g1M HEPES Ph7.45 5mlSolution c 10mlGlucose 1gAdd ddw and adjust pH to 7.43.灌洗液A:Buffer A with 1Mm EGTA +PS 过滤，37度温浴待用4.灌洗液B（50ml）：Buffer A with 5Mm CaCL2, 25mg胶原酶IV + PS 过滤，37度温浴待用5.胶原酶Ⅳ，购自Ｓｉｇｍａ公司；6.ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液7.透析胎牛血清（ＦＢＳ）8.青霉素－链霉素双抗9.0.4%的Trypan Blue：0.4g Trypan Blue to 100ml ddw用NaOH调PH值7.2-7.3, 4度储存。

步骤:1.经腹部注射巴比妥钠（50-100ｍｇ／ｋｇ）麻醉供试小鼠，5-10min。

70％乙醇消毒皮肤后，将小鼠移至超净工作台，固定于消毒的聚乙烯泡沫板上.2.剪开小鼠腹部，剥离皮肤，将静脉留置针插入肝脏门静脉，剪开下腔静脉，灌注预热（37 ℃）的灌注液A，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ3.至小鼠肝脏完全变灰黄、下腔静脉已无血丝流出时，改用３７～３８℃预热的灌注液B继续灌注小鼠肝脏，同时在下腔静脉插入留置针，通过医用输液管收集消化酶液，循环灌注液B，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ，持续灌注10～15min，使肝脏完全充盈消化酶液；4.剪下整个肝脏组织，将肝脏置于60mm培养皿中用10％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液终止消化，撕去肝包膜，用移液管轻轻吹吸两次，经100目网过滤到50ml离心管中，去除未消化肝脏组织块，补至30ml，于室温下1500转/分钟（50-80g）离心5ｍｉｎ重复2-3次，收集纯化的小鼠肝细胞，将纯化的小鼠肝脏细胞重悬于10ｍＬＲＰＭＩ－１６４０培养液中。

一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。

二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。

三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。

2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。

3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。

四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。

肝细胞的原代培养1．准备工作及肝细胞的分离（1）对所要用的工具和器械进行高温高压消毒，对所要的培养液，平衡盐溶液，蛋白酶消化液用微孔滤膜过滤除菌（手术剪，镊子，止血钳，空针，解剖针，不锈钢呢绒晒网，培养皿，小烧杯，吸管，离心管，三角瓶，棉球，血细胞技术板）（2）工作台面取材前30分钟紫外线消毒，酒精棉球擦洗（3）操作者洗手着装（新洁尔灭浸泡前臂1min）（4）试验动物消毒（70％或75％乙醇浸泡）（5）切取动物组织，洗取血污，剔去多余部分，将所取组织放入不含Ca2＋的HEPES缓冲液（培养液）的培养皿中（6）将所取组织切碎，将组织块连同组织液用吸管吸至离心管中静置片刻待组织块下沉后吸去上清液（7）将组织块转移至一加入含0。

05％胶原酶－2和5mMCacl2的HEPES的小烧杯或小培养瓶中37C恒温床消化15－45min（也可加磁力棒）（8）用吸管吸去含酶溶液加入不含Ca2＋的HEPES 缓冲液并用吸管吹打使组织块刚好散开（9）用不锈钢筛网过滤，若未过滤组织块较多重复（7）（10）对过滤液离心，转速80－1000r /min 时间5－10min（50×g？）（11）弃上清液，将细胞沉淀用少量培养液重新悬浮（12）重复（10）（11）3次（13）用血细胞计数板计数密度（14）用培养液调节细胞悬液密度至期望密度（每75ml烧瓶8×106个细胞）准备接种2．培养(1) 培养基：75％Eagle MEM＋25％medium 199＋10nginsulin/m+0.2%bovin serum albumin+10%fetal calf serum(2) 将分离的肝细胞种在10ml培养基里(3) 过12小时换液(4) 以后每天换液且加入7×10-5 hydrocortisone hemisaccinate（去小牛血清加入1.5%的二甲基亚砜）。

肝细胞原代培养的相关研究肝是人体内的重要器官，具有许多生理功能，如解毒、合成和分解代谢物、合成血浆蛋白等。

肝细胞是组成肝脏的主要细胞类型，对维持肝脏正常生理功能起着重要作用。

为深入了解肝细胞的生理功能及其发生的调控机制，需要进行肝细胞的原代培养研究。

本文将针对肝细胞原代培养的相关研究进行简述。

肝细胞原代培养是利用组织学和细胞学的基本原理，从新鲜切片的肝脏组织中分离出肝细胞，将其在培养基中进行培养而得到的肝细胞。

肝细胞的分离和培养需要一定的技术和耐心。

首先需要将新鲜的肝脏组织取出，去除其他组织，然后使用酶、胆汁等杂质酶类物质来加速细胞的分离。

在细胞培养的过程中，需要控制培养基的成分，如氧气浓度、温度、pH值，同时添加必要的营养物质和生长因子，有助于细胞的生长和分裂。

其中，细胞减数分裂和有性生殖对于原代培养的影响极大。

1. 培养基的成分对于肝细胞的原代培养，培养基的成分非常重要。

肝细胞培养基需保持生理环境，必须加入肝细胞生长所需要的基本营养成分和生长因子，如葡萄糖、氨基酸、维生素、铁、硒等。

同时，由于肝细胞的特殊形态和生理功能，培养基中还需添加肝细胞分泌的细胞因子，如HGF、EGF、FGF等。

其中，HGF是肝细胞的重要生长因子，对肝细胞的生长与分化起着重要作用。

2. 体外培养条件对肝细胞的原代培养过程中，体外培养条件也是非常重要的因素。

如气氛调节，CO2浓度、含量、温度的调节等都影响着肝细胞的培养效果。

另外，关于pH的控制和细胞生长周期的控制等方面的调节也会直接影响肝细胞的细胞生长和分裂情况。

3. 细胞来源不同来源的肝细胞在原代培养过程中，其存在的状况也不同，从而影响肝细胞的生长情况。

如来自肉蛋白中心的肝细胞经过长时间的衰老，其代谢能力会逐渐减弱，但经过短时间的逆转，其代谢能力会再次得到恢复。

4. 细胞密度肝细胞原代培养中，细胞密度也是影响肝细胞生长和培养的重要因素之一。

较低的细胞密度和过多的细胞都会影响细胞的生长和分化。

常用细胞培养方法整理细胞培养是一种在体外培养细胞的技术，广泛应用于医学研究、药物筛选和生物工程等领域。

常用的细胞培养方法包括原代细胞培养、细胞系培养、体外血管生成实验和三维培养等。

1.原代细胞培养原代细胞培养是从组织中分离和培养原始细胞的方法。

常用的原代细胞包括肝细胞、肺细胞、心肌细胞等。

通常，将组织样品切碎并用酶溶解，然后通过筛网过滤，以分离单个细胞。

分离的细胞可以通过离心或贴壁培养等方法进行培养。

2.细胞系培养细胞系培养是一种从原代培养细胞中建立的“永生”细胞系。

常用的细胞系有HEK293细胞、HeLa细胞等。

一般来说，细胞系生长速度更快且更易于培养。

细胞系培养常用的方法包括贴壁培养、悬浮培养和旋转培养等。

3.体外血管生成实验体外血管生成实验是一种研究血管生成过程的常用方法。

通过培养内皮细胞和其他细胞在三维基质中形成管状结构，模拟体内血管生成的过程。

这一方法被广泛应用于研究血管生成的机制、药物筛选和治疗的评估。

4.三维培养三维培养是一种在三维基质中培养细胞的方法，模拟细胞在体内的生长环境。

相对于传统的二维培养，在三维培养中，细胞能够形成更复杂的结构和组织，更贴近真实生理情况。

这一方法被广泛应用于组织工程、疾病模型的构建和药物筛选等研究领域。

除了上述常用的细胞培养方法外，还有一些其他的方法也值得关注。

例如，共培养是一种将不同类型的细胞一起培养的方法，用于研究细胞间相互作用。

过去，常规的细胞培养方法主要是在培养皿中进行，但现在也发展出了一些其他容器，如微流控芯片和生物反应器等，用于更精确地控制和监测细胞培养的环境。

细胞培养是现代生物学研究不可或缺的一部分，不断发展和改进的细胞培养方法为科学家们提供了更丰富和多样的工具，以便更好地理解细胞的生理机制和生命过程。

大鼠原代肝细胞培养方法的建立摘要体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多，但均存在一些缺陷。

对胶原酶灌流法进行改良，采用细胞密度为6×105个/ml，细胞生长状态好，既能保证细胞活率，又能满足下一步试验要求。

用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注，胰酶最适浓度为0.18%，且灌流时维持最适温度37 ℃，分离得到的肝细胞存活率大于90%，且纯度很高，是一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。

关键词细胞培养；原代；大鼠中图分类号q813.1+1文献标识码a文章编号 1007-5739（2013）12-0226-02体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多[1-4]，常用的有直接剪切法[5]、组织块消化法[6]和两步胶原酶灌流法[7-8]等。

由于肝细胞体外培养增殖能力差，原代培养的细胞存活率不高，故在一定程度上阻碍了肝细胞体外模型的广泛应用[9]。

直接剪切法和组织块消化法所分离肝细胞杂质较多，细胞纯度不高，酶消化反应不易控制，且过多的结缔组织直接影响细胞的正常生长等，不利于细胞生物学和分子生物学的进一步研究。

胶原酶灌流法分离的肝细胞数量多且活力好，是分离大鼠原代肝细胞的经典方法[3]，但由于操作方法较为复杂，限制了该方法的广泛应用。

该试验对胶原酶灌流法进行了改良，试图建立一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。

1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物。

健康雄性sd大鼠，体重180～220 g，由江苏大学实验动物中心提供。

1.1.2试剂及仪器。

williams’medium e（wme），胰岛素，青链霉素（penicillin/streptomycin）：sigma-aldrich，usa；l-谷氨酰胺（l-glutamine），胰蛋白酶（trypsin），噻唑兰（mtt），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，bsa）：amresco，usa；胎牛血清（fetal bovine serum，fbs）：gibco，usa；其他相关试剂均为国产分析纯。

小鼠肝细胞原代培养小鼠肝细胞原代培养实验目的：1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法实验器材：二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。

原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。

原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。

原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。

原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。

因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。

一般采用2-5代的细胞进行实验。

当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。

原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。

组织块原代培养：组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。

但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养的程序一般为：1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。

2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。

1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。

1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。

2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。

5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。

待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。

1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。