大鼠骨髓基质细胞培养的实验研究

体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性袁志萍;刘宏伟;刘斌【期刊名称】《实用口腔医学杂志》【年(卷),期】2001(017)002【摘要】Objective:To study the biological characteristics and mineralization activity of strom cells (MSC) isolated from rat bone marrow.Methods: MSCs were isolated from rat bone marrow using gradient centrifuge (460 g,20 min) with 70% percoll and cultured with DMEM. The cells were then incubated with mineralization culture medium (MCM) in the presence of Dex (10～7 mol/L), β-GP (10 mmol/L) and AcA (50 g/L).Cell growth was studied with cell counting,alkaline phosphatase (ALP) expression with a kit and mineralization with a saturated solution of alizarin red S (pH 4.3) stainning.Results: The isolated cells from bone marrow of rat were epithelial-like. The doubling time (DT) of the cells in MCM or DMEM were 50.3 h and 66.1 h respectively. Mineralization was observed after the cells had been cultured in MCM for 28 days. bFGF and rhBMP-2 increased ALP expression of MSC in a dosage dependent manner. Conclusion:In vitro cultured MSCs may be induced to differentiate towards osteoblasts.%目的：研究体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性及其成骨细胞表型特征。

一、实验目的本实验旨在探讨异种生物衍生材料在组织工程中的应用潜力，通过对新西兰大白兔的四肢长骨进行加工处理，制备生物骨衍生材料，并将其与大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）进行体外联合培养，评估该材料与BMSCs的生物相容性和粘附情况，为构建组织工程骨的支架材料提供实验依据。

二、实验材料与方法1. 材料- 新西兰大白兔四肢长骨- 大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）- Percoll分离液- 小牛血清（FBS）- 低糖DMEM培养液- 胰蛋白酶- 生物骨衍生材料制备工具2. 方法（1）生物骨衍生材料的制备- 将新西兰大白兔的四肢长骨制成骨条。

- 使用改良的过氧化氢乙醚法对骨条进行处理，进行消毒并80℃冻存。

- 将处理后的骨条进行分离，得到纯净的生物骨衍生材料。

（2）大鼠骨髓基质细胞的分离与培养- 使用Percoll分离液密度梯度离心分离大鼠骨髓。

- 将分离得到的骨髓细胞在含10%小牛血清的低糖DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2培养箱内进行体外培养。

- 保留贴壁细胞进行传代培养，至第5代时，使用胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。

（3）异种生物骨衍生材料与BMSCs的联合培养- 将制备好的生物骨衍生材料与细胞悬液混合，使之充分渗入材料表面。

- 加入10%小牛血清DMEM培养液，进行联合培养。

（4）观察与分析- 通过光镜和电镜对联合培养过程进行连续观察，记录BMSCs在材料表面的粘附、生长情况。

- 分析实验数据，评估生物骨衍生材料与BMSCs的生物相容性和粘附情况。

三、实验结果1. 生物骨衍生材料的制备成功制备了纯净的生物骨衍生材料，其表面具有一定的粗糙度，有利于细胞的粘附。

2. 大鼠骨髓基质细胞的培养成功分离并培养了大鼠骨髓基质细胞，细胞生长良好，形态呈长梭形。

3. 异种生物骨衍生材料与BMSCs的联合培养BMSCs在生物骨衍生材料表面粘附良好，细胞形态呈长梭形，生长旺盛。

4. 观察与分析通过光镜和电镜观察，发现BMSCs在生物骨衍生材料表面粘附牢固，细胞生长良好，表明该材料具有良好的生物相容性和粘附性。

ＩＳＳＮ１００６－７１６７ＣＮ３１－１７０７／ＴＲＥＳＥＡＲＣＨＡＮＤＥＸＰＬＯＲＡＴＩＯＮＩＮＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ第４０卷第１０期　Ｖｏｌ．４０Ｎｏ．１０２０２１年１０月Ｏｃｔ．２０２１　ＤＯＩ：１０．１９９２７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｓｙｙｔ．２０２１．１０．０３８以大鼠骨髓基质干细胞进行流式细胞术教学的效果研究邵志华ａ，　李　姣ｂ，　许　洁ｂ，　贾　松ｂ，　沙继宏ａ，吕立夏ｃ，　徐　磊ｃ，　李思光ａ（同济大学医学院ａ．细胞生物学系；ｂ．医学与生命科学实验教学中心；ｃ．生物化学与分子生物学系，上海２０００９２）摘　要：为了优化精品实验项目，提高实验教学水平，在原有大鼠骨髓基质干细胞培养与分化实验基础上，将干细胞培养与流式细胞术相结合，建立了以“大鼠骨髓基质干细胞为材料的流式细胞术实验”。

实验采用翻转课堂教学法，注重理论知识、实验操作、软件使用和数据分析多种能力的培养。

结果显示实验稳定、可行，１００％的学生认为实验促进了对干细胞特性的理解，提高了学习效果。

课后测试平均成绩明显高于课前，差异有统计学意义。

问卷调查显示，学生已基本熟练掌握流式工作原理、操作流程、对照实验设计、软件的使用和结果分析。

实验首次以干细胞为材料进行流式细胞术教学，提高了学生的流式技能，加深了学生对干细胞特征的理解，提高了学生的前沿知识水平和实验技能。

关键词：实验教学；流式细胞术；干细胞；临床医学中图分类号：Ｇ６４２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００６－７１６７（２０２１）１０－０１８９－０４收稿日期：２０２１ ０４ ０５基金项目：国家自然科学基金项目（８１７７１３３３）；同济大学实验教改基金项目（１５００１０４１８５）作者简介：邵志华（１９７６－），女，上海人，博士，讲师，研究方向为干细胞临床转化研究。

Ｔｅｌ．：177****9485；Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｉｈｕａ＿ｓｈａｏ＠１６３．ｃｏｍ通信作者：李思光（１９６２－），男，江西南昌人，博士，教授，研究方向为干细胞临床转化研究。

大鼠骨髓基质干细胞体外分离、纯化、培养的实验研究何玉祥;孙岩;刘振川;刘洋;周华;王茂华;袁海;金星;吴学君【摘要】Objective To explore the methods of separation, depuration and cultivation in vitro for bone marrow stromal cells ( BMSCs) of rats. Methods Five-week-old Wistar rats were anesthetized through abdominal cavities using 1% sodium pentobarbital (0. 006 ml/g), and then BMSCs were extracted from the rats'femurs and tibias. The adherent culture method was used to separate, purify and culture the BMSCs. The changes in cell morphology were observed, and characteristics of cell growth, passage and amplification were studied by drawing curve of growth. The cells were identi-fied with flow cytometry. Results The BMSCs obtained with adherent culture method had rapid proliferation and good growth curve, which proved BMSCs by the detection of cell surface marker, and the cells had good homogeneity (96. 36%). Conclusion Adherent culture can well separate, purify and culture the BMSCs, and the obtained cells have better proliferative capacity, and the 3th -6th generations are more suitable for experimental research.%目的：探讨Wistar大鼠骨髓基质干细胞( BMSCs)体外分离、纯化、培养的方法。

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。

大鼠骨髓基质细胞的培养周谊芬;董玉林【摘要】目的：探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法，观察骨髓基质细胞的形态。

方法：从SD大鼠中分离骨髓基质细胞，采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法将分离的骨髓基质细胞体外扩增，倒置显微镜下观察细胞形态学特征。

结果：倒置相差显微镜观察发现，接种后24 h内细胞开始贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形。

48 h后贴壁细胞沿培养瓶壁伸展开，圆形，折光性强，细胞壁完整，胞核隐约可见，胞质丰富。

传至第5代MSCs纯度高，增殖能力旺盛，呈梭形或纺锤形的细胞，呈漩涡状、菊花状排列生长。

结论：骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得，传至第5代的骨髓基质细胞纯度高，密度梯度离心法结合贴壁筛选法可作为是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法。

%Objective:To investigate the isolate and culture method of bone marrow stromal cells (MSCs) in vitro, to observe the morphology of MSCs. Methods: MSCs from rat bone marrow were separated and purified by means of gradient centrifugation and adherence to the culture plastic, morphological characteristics of which were observed by Inverted mi-croscope. Results: MSCs were isolated and cultured in vitro with high purity and strong proliferative capacity, fusiform or spindle-shaped cells were swirling, and daisy-like arrangement of growth were observed. Conclusions: MSCs can be cul-tured in vitro, MSCs spread to the fifth generation of high purity, and the means of gradient centrifugation and adherence to the culture plastic can be used as an ideal MSCs culture method.【期刊名称】《交通医学》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】3页(P205-206,213)【关键词】骨髓基质细胞;密度梯度离心法;贴壁筛选法;大鼠【作者】周谊芬;董玉林【作者单位】南通大学医学院人体解剖学系，江苏226001;南通大学医学院人体解剖学系，江苏226001【正文语种】中文【中图分类】R329.2骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）是一种广泛存在于骨髓组织中而非造血的实质干细胞[1-2]。