宫内铅、镉及拟除虫菊酯类杀虫剂暴露对婴幼儿生长发育的影响

常见的农药的原药成分作用机理及防治对象农药是农业生产中用于防治农作物病虫害的化学制剂，主要分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂和植物生长调节剂等几类。

常见的农药有很多种类，每种农药都有其独特的化学成分和作用机理。

下面将介绍几种常见的农药，包括其原药成分、作用机理和防治对象。

1.杀虫剂杀虫剂是用来防治农作物的昆虫害的农药。

常见的杀虫剂包括氨基甲酸酯类、有机磷类、拟除虫菊酯类和氯化硫酰类等。

（1）氨基甲酸酯类杀虫剂：主要以氨基甲酸酯作为原药成分，作用机理是破坏昆虫的神经递质传递，导致神经紊乱和死亡。

常见的氨基甲酸酯类杀虫剂有氨基甲酸乙酯，防治对象包括蚜虫、白蚁、秧蛾等。

（2）有机磷类杀虫剂：主要以有机磷酸酯作为原药成分，通过抑制昆虫体内的胆碱酯酶活性，导致神经递质不能正常分解，引起昆虫神经系统紊乱和死亡。

常见的有机磷类杀虫剂有敌敌畏、马拉硫磷等，防治对象包括蚜虫、甲虫、粘虫等。

（3）拟除虫菊酯类杀虫剂：主要以拟除虫菊酯作为原药成分，作用机理是通过抑制昆虫的神经生长调节激素（JH）的合成和释放，从而阻止蜕皮和生长，导致昆虫死亡。

常见的拟除虫菊酯类杀虫剂有氟虫腈、虱螨脲等，防治对象包括害虫、螨虫等。

2.杀菌剂杀菌剂是用来防治农作物的真菌病害的农药。

常见的杀菌剂包括三唑酮类、磺酰类、苯酰脒类和吡唑酮类等。

（1）三唑酮类杀菌剂：主要以三唑酮作为原药成分，作用机理是通过抑制真菌细胞色素P450酶和酶系统活性，阻断真菌的细胞壁合成和生长，导致真菌死亡。

常见的三唑酮类杀菌剂有弯唑酮、硅唑酮等，防治对象包括多种真菌。

（2）磺酰类杀菌剂：主要以磺酰脲类、磺酰胺类和磺酰氨基甲酸酯类作为原药成分，作用机理是通过抑制真菌细胞内酶活性，干扰真菌细胞的代谢过程，导致真菌死亡。

常见的磺酰类杀菌剂有多菌灵、咪鲜胺等，防治对象包括白粉病、黑斑病等。

3.除草剂除草剂是用来防除杂草的农药。

常见的除草剂包括对氨基苯甲酸类、氨基甲酸酯类、吡唑酮类和三嗪类等。

拟除虫菊酯农药小组成员：吕婧、赵静、王婷、原野、毕波、刘旋一、天然除虫菊⏹㈠发现和传播⏹⒈发现传说：⏹⑴波斯一妇女发现美丽小花能杀死昆虫⏹⑵产自中国⏹⑶Lodeman(1903)记载：19世纪初Jumtikoff（亚美尼亚人）发现北高加索一个部落用除虫菊花粉杀虫，1928年起开始大量加工制造这种药粉。

⏹⒉传播⏹1840年左右在波斯栽培（或产于中国）⏹19世纪中期传至欧洲⏹后半期传至日本（1885）及美国⏹20世纪初传至非洲❖1950年传至南美❖20世纪初主产南斯拉夫❖二次大战前主产日本（1.3万吨干花／年，占全世界70%）❖除虫菊素为黄色粘稠状液体，在碱、强光、高温（60℃)下不稳定（需加增效剂），不溶于水，安全无药害。

❖除虫菊（0.7-1.0%）❖加工剂型除虫菊乳油（3%）❖油剂、气雾剂、蚊香❖卫生害虫：蚊、蝇、蜚蠊❖防治对象家畜害虫：厩蝇、角蝇❖贮粮害虫：米象拟除虫菊酯简介拟除虫菊酯类杀虫剂是仿效天然除虫菊化学结构的合成农药，其分子由菊酸和醇两部分组成。

本类农药杀虫谱广、效率高，对哺乳类动物毒性一般较低(对水生动物毒性较大)，环境中残留时间较短，除具有杀虫作用外，并兼有杀螨、杀菌、抑制霉菌的作用。

目前，常用的拟除虫菊酯类农药主要有：氯菊酯、杀虫菊酯、溴氰菊酯、甲醚菊酯、氯氰菊酯等。

拟除虫菊酯类农药绝大多数为黄色或黄褐色粘稠油状液体，易溶解于有机溶剂，难溶解与水，大多不易挥发，在酸性溶液中稳定遇碱则易分解失效。

常用的拟除虫菊酯毒性一般为中毒或低毒，可经皮肤、呼吸道吸收。

在哺乳动物体内代谢转化很快。

拟除虫菊酯作用拟除虫菊酯是一类能防治多种害虫的广谱杀虫剂，其杀虫毒力比老一代杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类提高10～100倍。

拟除虫菊酯对昆虫具有强烈的触杀作用，有些品种兼具胃毒或熏蒸作用，但都没有内吸作用。

其作用机理是扰乱昆虫神经的正常生理，使之由兴奋、痉挛到麻痹而死亡。

对生物产生的影响对冷-温血动物产生的影响神经中毒行为对脑组织神经膜的影响对神经递质和神经细胞的影响鲤鱼等鱼类暴露于拟除虫菊酯类农药后，立刻表现出兴奋且无规律的游动，而后鳃组织红肿出血，肌肉痉挛，上下翻动.拟除虫菊酯分为I型拟除虫菊酯（Ⅰ型：胺菊酯、丙烯菊酯、苄呋菊酯、苯醚菊酯、二氯苯醚菊酯等）和Ⅱ型拟除虫菊酯。

第四节氨基甲酸酯类杀虫剂一、特点1.多数品种速效，残效期短，选择性强。

对叶蝉、飞虱、蓟马、玉米螟防效好，对天敌安全2.多数品种对高等植物低毒，在生物和环境中易降解，个别品种克百威等急性毒性极高3.不同结构类型的品种、生物活性和防治对象差别很大4.与有机磷作用机理相似，抑制乙酰胆碱酯酶，但反应过程有差异5.与有机磷混用，有产生拮抗作用，有的增效作用。

二、常用品种1.异丙威（叶蝉散）：2.涕灭威（铁灭克）：3.灭多威(万灵)：4.丁硫克百威(好年冬)：克百威(呋喃、大扶农、加保扶)1.理化性质及毒性(1)碱性介质中不稳定，不易燃，无腐蚀作用(2)高毒，LD50=8-14 mg/kg，经皮>10200 mg/kg2.作用特点及剂型(1)广谱杀虫、线虫剂，具有内吸，触杀胃毒(2)抑制胆碱酯酶，与其结合不可逆，因此毒性高(3)根系吸收，叶部积累较多，果实含量较少，土壤中半衰期30-60天(4)对水稻、棉花有明显刺激生长的作用(5)剂型：35%种子处理剂，3%颗粒剂3.防治对象及使用方法适于棉花、水稻、甘蔗、等80多种作物防治300多种地下害虫、叶面害虫、及线虫4.注意事项(1)毒性高，严禁加水制成悬浮液直接喷施(2)对鱼类及水生动物毒性大(3)人体每日允许摄入量0.01第五节拟除虫菊酯类杀虫剂一、天然除虫菊素及发展概况（一）天然除虫菊素（二）仿生合成的拟除虫菊酯类杀虫剂1.广谱高效，用药量少，2.使用安全，多数品种低毒，残留量很低3.促进生长，增加产量，在棉田、烟草、茶叶、蔬菜上使用有增产效果4.触突部位传导抑制剂5.负温度系数杀虫剂6.易产生抗药性三、主要品种氯菊酯(百灭灵、除虫精、闯入者、二氯苯醚菊酯、蛀王醇) 1.理化性质及毒性(4)原药为暗黄色至棕黄色液体，难溶于水(5)碱性及土壤中易分解失效(6)低毒，LD50>2000 mg/kg，2.作用特点及剂型(1)具触杀和胃毒作用，杀虫谱广(2)与含氰基结构的菊酯相比毒性更低、刺激性较小、击倒速度更快(3)剂型：10%、20%、25%EC，0.04%、0.5%、10%D，速杀0.175%杀虫喷射剂，与胺菊酯混用最多制成气雾剂，超过100种气雾剂，0.42%金童灭虫灵气雾剂(与胺菊酯混用)3.防治对象及使用方法(1)可防治多种农作物、果蔬、卫生等100多种害虫(2)有效成分：7-15克亩，卫生害虫：10%EC3000-5000倍4.注意事项(1)对鱼虾、蜜蜂高毒(2)施药均匀，最好使虫体直接接触药液溴氰菊酯(保棉丹、敌杀死、谷虫净、金鹿、凯素灵、扑虫净) 1.理化性质及毒性(1)对光热稳定-光稳定菊酯(2)中毒，LD50=126.5-138.7 mg/kg，对鱼类蜜蜂高毒2.作用特点及剂型(1)强烈触杀及胃毒作用(2)广谱、击倒速度快(3)田间用量极少(4)有明显增产效果(5)剂型：EC、WP、D、0.4%神奇药笔3.防治对象及使用方法能防治45种作物上140多种害虫4.注意事项(1)易产生抗药性(2)对钻蛀性害虫应在幼虫蛀入作物之前施药第六节其它类型杀虫剂一、沙蚕毒素类杀虫剂：杀螟丹、杀虫双、杀虫单、杀虫环杀虫双1.理化性质及毒性(1)易溶于水和部分有机溶剂(2)有很强的吸水性，遇热、酸、碱不稳定(3)中毒，LD50=342 mg/kg2.作用特点及剂型(1)具有内吸、胃毒、触杀作用(2)氧化转变为沙蚕毒素起杀虫作用，作用于乙酰胆碱受体。

杀虫剂种类及作用机制杀虫剂是用于防治害虫的化学物质，根据其作用机制的不同可以分为以下几类：神经毒剂、肠胃毒剂、转录和翻译抑制剂、生长调节剂和光合作用抑制剂，下面将逐一进行介绍。

1.神经毒剂神经毒剂是最常见的杀虫剂类型之一，其作用机制主要是通过影响昆虫的神经系统而引起虫体麻痹、瘫痪甚至死亡。

常见的神经毒剂有有机磷杀虫剂和拟除虫菊酯类杀虫剂。

有机磷杀虫剂通常通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使得乙酰胆碱在突触间隙内积累，影响神经递质的正常传递，最终导致虫体麻痹和死亡。

典型的有机磷杀虫剂包括敌敌畏和马拉硫磷。

拟除虫菊酯类杀虫剂主要通过作用于神经系统的神经递质乙酰胆碱受体来产生杀虫效果。

它们可以选择性地作用于昆虫的神经递质受体，导致虫体麻痹和死亡，而对人和其他非靶标昆虫的影响较小，具有较高的安全性。

常见的拟除虫菊酯有氯虫苯、氟虫腈等。

2.肠胃毒剂肠胃毒剂主要通过虫体口器摄入，并在肠道中产生毒作用。

这类杀虫剂对于具有咀嚼取食习性的害虫效果较好。

肠胃毒剂的作用机制一般是通过抑制虫体体内酶的正常活性或对细胞膜的破坏，导致虫体的代谢和消化功能受到损害。

常见的肠胃毒剂包括有机磺酰脲类杀虫剂、吡蚜唑等。

3.转录和翻译抑制剂转录和翻译抑制剂对于虫体的RNA和蛋白质合成过程具有双重抑制作用，从而引起虫体死亡。

它们通常通过与RNA聚合酶或核糖体相互作用，阻断RNA或蛋白质的正常合成。

常见的转录和翻译抑制剂有苯酚类和氨基甲酸酯类杀虫剂等。

4.生长调节剂生长调节剂主要用于幼虫期害虫的控制，通过模拟虫体内存在的激素或干扰其内分泌系统，从而影响虫体的发育进程和生长途径。

生长调节剂可以分为昆虫准激素和昆虫抑制激素两大类。

昆虫准激素促进虫体的生长和蜕皮过程，使虫体发育到下一个发育阶段。

昆虫抑制激素则能够抑制昆虫的发育，导致幼虫和蛹无法蜕皮成为成虫，最终导致虫体死亡。

常见的生长调节剂有杀幼激素、昆虫抑制激素和虫化激素等。

5.光合作用抑制剂光合作用抑制剂主要用于杀灭水生和滨水昆虫，通过干扰昆虫体内叶绿素的光合作用过程，导致能量供应中断和组织坏死，最终引起虫体死亡。

杀虫剂和杀菌剂的毒性与环境影响随着现代农业技术的进步，农民越来越多地依赖杀虫剂和杀菌剂来保护作物和增加产量。

但随之而来的是它们的毒性和对环境的影响。

在本文中，我们将探讨这些问题以及如何减轻它们的影响。

1. 毒性杀虫剂和杀菌剂的毒性主要是由其成分引起的。

一些常见的成分包括有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯和嗪酰胺等。

这些成分可能对人类和动物造成健康问题，例如中毒和过敏反应。

此外，这些成分还可能对非目标生物产生副作用。

例如，杀虫剂对蜜蜂、蝴蝶和其他昆虫有毒性，并且可能破坏整个生态系统的平衡。

此外，这些化学品还可能影响微生物的生长和土壤质量。

2. 环境影响杀虫剂和杀菌剂使用过程中对环境的影响主要有两个方面：水质问题和土壤污染问题。

水质问题是由于化学品通过降雨或灌溉进入水体中所引起的。

这些化学品可能导致有害物质在环境中累积，对水生生物造成剧烈影响，并造成水体污染和生态系统的破坏。

土壤污染问题是由于农民将化学品用于灌溉和土壤处理。

这些化学品可能在土壤中积累，导致土壤的肥力下降和死亡成本的增加。

3. 如何减轻影响虽然杀虫剂和杀菌剂有它们的好处，但其毒性和对环境的影响不可忽视。

因此，有必要采取一些措施来减轻其影响。

一些减轻影响的措施包括：- 使用有机农业方法有机农业使用天然的方式来控制虫害和病害，减少了化学品的使用。

- 选择可再生材料可再生材料（如棉、麻、木纤维）不需要使用大量的农药和化肥来生产，并且不会造成土壤污染。

- 确保正确的化学品使用正确的使用化学品将减少残留，避免了化学品的大量使用。

此外，农民们应该遵循正确的使用化学品的安全指导。

- 安排生态系统平衡为生态系统上部面添加一些新事物，比如植物、昆虫或动物,其可能会对维持生态系统平衡有积极作用。

例如，在农田中种植一些蔬菜和小草可以增加有益昆虫的数量，减少对作物的侵害。

4. 结论杀虫剂和杀菌剂的毒性和对环境的影响是一个普遍的问题。

尽管这些化学品对种植业起了重要作用，但我们必须认识到化学品带来的风险，并采取措施减轻其影响。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第16卷第2期2021年4月V ol.16,No.2Apr.2021㊀㊀基金项目:安徽省自然科学基金资助项目(2008085QC103);安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2020A0116);国家自然科学基金面上项目(21377139)㊀㊀第一作者:李玲玲(1990 ),女,博士,研究方向为土壤生态毒理学,E -mail:lingiae@ DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20200623002李玲玲,沈章军,宋玉芳,等.2种拟除虫菊酯类农药对赤子爱胜蚓消化酶的毒性效应[J].生态毒理学报,2021,16(2):260-269Li L L,Shen Z J,Song Y F,et al.Toxic effects of two pyrethroids pesticides on digestive enzymes of Eisenia fetida [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2021,16(2):260-269(in Chinese)2种拟除虫菊酯类农药对赤子爱胜蚓消化酶的毒性效应李玲玲1,沈章军1,宋玉芳2,*,史奕21.合肥师范学院,合肥2300092.中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳110016收稿日期:2020-06-23㊀㊀录用日期:2020-07-28摘要:拟除虫菊酯类农药已经逐渐代替有机磷等农药被大量使用,给土壤动物带来潜在生态风险㊂本研究选择了土壤模式生物赤子爱胜蚓为受试生物,考察2种拟除虫菊酯类农药(联苯菊酯和氟氯氰菊酯)对赤子爱胜蚓消化酶活性(α-葡萄糖苷酶和蛋白酶)的影响㊂结果表明,α-葡萄糖苷酶(α-Glu)活性在暴露初期被联苯菊酯诱导,随着时间的延长,出现抑制作用,而氟氯氰菊酯对α-Glu 活性的影响主要呈现抑制作用㊂3种蛋白酶活性在暴露初期被联苯菊酯显著诱导和被氟氯氰菊酯显著抑制,且随着时间的推移,影响作用减弱㊂研究表明,联苯菊酯和氟氯氰菊酯对消化酶的影响呈现相反趋势,3种蛋白酶活性可以作为评估2种拟除虫菊酯类农药毒性的早期指标㊂研究结果为阐释拟除虫菊酯类农药对土壤蚯蚓的毒性机制提供数据支撑,为评估拟除虫菊酯类农药的生态风险提供了潜在生物标志物㊂关键词:拟除虫菊酯类农药;联苯菊酯;氟氯氰菊酯;蚯蚓;消化毒性文章编号:1673-5897(2021)2-260-10㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AToxic Effects of Two Pyrethroids Pesticides on Digestive Enzymes of Eise-nia fetidaLi Lingling 1,Shen Zhangjun 1,Song Yufang 2,*,Shi Yi 21.Hefei Normal University,Hefei 230009,China2.Institute of Applied Ecology,Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016,ChinaReceived 23June 2020㊀㊀accepted 28July 2020Abstract :Pyrethroids pesticides that have gradually replaced organophosphorus pesticides are being widely used,which brings potential ecological risks to soil animals.The soil model organism Eisenia fetida was selected to in -vestigate the effects of two pyrethroids pesticides (i.e.,bifenthrin,cyfluthrin)on the digestive enzyme activities (e.g.,alpha -glucosidase,protease)of Eisenia fetida in this study.The results showed that the activity of alpha -glucosi -dase (α-Glu)was induced by bifenthrin at the initial stage of exposure,but inhibited as time elapsed.By compari -son,the main effect of cyfluthrin on the α-Glu activity was inhibition.The activities of three proteases were signifi -cantly induced by bifenthrin and significantly inhibited by cyfluthrin at the initial stage of exposure,and the effects were reduced over the test time.These results suggested that the effects of bifenthrin and cyfluthrin on digestive en -第2期李玲玲等:2种拟除虫菊酯类农药对赤子爱胜蚓消化酶的毒性效应261㊀zymes were opposite,and the activities of the three proteases could be used as early indicators to evaluate the toxi-cological profiles of the two pyrethroids pesticides.This study provided data support to elucidate the toxicity mech-anism of pyrethroids pesticides on soil earthworms and offered potential biomarkers to evaluate the ecological risk of pyrethroids pesticides.Keywords:pyrethroids pesticides;bifenthrin;cyfluthrin;earthworm;digestive toxicity㊀㊀拟除虫菊酯类农药由于具有高效㊁对哺乳动物和鸟类低毒㊁且易降解等优点,已经逐渐成为有机磷㊁有机氯和氨基甲酸酯类杀虫剂的替代品而被广泛应用于农业生产和公共场所防虫工作中[1]㊂根据构效学和特征学,拟除虫菊酯类农药被划分为Ⅰ型和Ⅱ型[2-3]㊂联苯菊酯,一种Ⅰ型拟除虫菊酯类农药,在农业生产中广泛用于防治昆虫和螨虫[4]㊂氟氯氰菊酯,一种Ⅱ型拟除虫菊酯类农药,广泛应用于农业㊁兽医业以及家庭住宅中的防虫过程中[5]㊂随着疏水性拟除虫菊酯类农药的大量使用,它们被土壤颗粒和沉积物强烈吸附,从而对生态系统的结构和功能产生不可逆的损伤[6-9]㊂α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase,α-Glu)是一种消化酶,可以参与有机体内碳水化合物的消化并释放葡萄糖,具有被用作生物指标以评估环境中农药暴露引发的生态风险的潜力[10-11]㊂蛋白酶是另外一类消化酶,已经在赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内被发现,其不仅具有水解纤维蛋白和其他蛋白成短肽或自由氨基酸的作用,也具有活化一些酶类的作用,例如凝血素和血纤维蛋白溶酶原[12-13]㊂前期研究主要关注蚯蚓蛋白酶的临床应用,而将蛋白酶活性作为评估环境污染物风险指标的研究未见报道[12]㊂消化酶活性与有机体的摄食能力和生长能力息息相关,而在笔者团队前期研究中发现联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下赤子爱胜蚓的体质量增长率被抑制,因此,可以将消化酶作为环境潜在毒性诊断标志物[14-16]㊂基于以上研究,笔者假设联苯菊酯和氟氯氰菊酯影响了蚯蚓体内消化酶的活性,从而导致其体质量增长率被抑制㊂蚯蚓是土壤生态系统中重要的分解者,影响着土壤生态系统中的分解活性㊁营养矿化和初级生产[17]㊂蚯蚓通过其行为活动能够改善土壤结构,提高土壤透气㊁排水和深层持水能力,扮演着 土壤生态系统工程师 的重要角色㊂生活在土壤生态系统中的蚯蚓摄取大量的土壤,可以通过皮肤和肠道直接接触土壤污染物,已经被经济合作与发展组织对土壤生态系统无脊椎动物影响的模式生物[18-19]㊂目前,应用蚯蚓诊断生态毒理的研究多集中在污染物暴露对其生存㊁生长及繁殖等个体水平上的影响㊂然而,随着生态毒理诊断的发展,蚯蚓个体水平指标已经不能满足低剂量污染条件下的风险评估,随之应运而生的是蚯蚓生物标志物在土壤生态系统风险评估中的应用㊂本研究以模式生物赤子爱胜蚓为实验动物,通过探究4种消化酶(α-葡萄糖苷酶㊁酸性蛋白酶㊁中性蛋白酶和碱性蛋白酶)的响应,评估联苯菊酯和氟氯氰菊酯对赤子爱胜蚓的消化毒性效应,从而为进一步评估拟除虫菊酯类农药的土壤生态风险,阐释其毒性机制提供基础实验数据支撑和理论依据㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀实验材料1.1.1㊀供试土壤土壤取自中国科学院沈阳农业生态站保护行0 ~20cm土层,该土壤具有以下理化性质:pH6.2,碱解氮(K-N)0.091%,总磷(TP)0.04%,总钾(TK) 0.18%,有机质(OM)1.65%,阳离子交换量(CEC)12.3 cmol㊃kg-1,最大持水量(WHC)32%㊂土壤的粒径分布如下:砂粒(>50μm)占22%,粉粒(1~50μm)占64%,黏粒(<1μm)占14%㊂土壤采集后去除植物等残渣,室温条件下风干,过20目筛后备用㊂1.1.2㊀蚯蚓赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)购买于沈阳华清源蚯蚓养殖公司,挑选300~400mg具有健康环带的成蚓在洁净土壤中于(20ʃ1)ħ(光照ʒ黑暗比为12hʒ12h)驯化至少2周㊂1.1.3㊀试剂和仪器试剂:联苯菊酯(97%)和氟氯氰菊酯(95%)购买于上海永远化工有限公司㊂牛血清蛋白(ȡ95%)㊁三羟甲基氨基甲烷(Tris)(99.5%)㊁乙二胺四乙酸(EDTA)(ȡ99%)㊁二硫苏糖醇(DTT)(99%)㊁对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(α-pNPG)(ȡ99.7%)㊁转化酶(ȡ300units㊃mg-1固体)㊁酪蛋白(ȡ98%)和酪氨酸262㊀生态毒理学报第16卷氢钠(NaH2PO4)㊁磷酸氢二钠(Na2HPO4)㊁醋酸(HAC)㊁醋酸钠(NaAc)和硼砂(Borax)等其他试剂均为分析纯,购买于沈阳莱博科贸有限责任公司㊂仪器:BS210S万分之一电子分析天平(Sartori-us,德国),HPG-280BX型光照培养箱(哈东联,北京),HPS-280型光照培养箱(哈东联,北京),10mL 手动玻璃匀浆器(凯瑞实验器材,江苏),CP-80MX低温超速离心机(Hitachi,日本),Multiskan FC-51119000酶标仪(Thermo,美国),高效液相色谱仪(Thermo Fisher Ultimate3000,美国)㊂1.2㊀实验方法1.2.1㊀污染暴露实验根据前期急性毒性实验半数致死浓度结果,设置本实验亚致死剂量分别为:联苯菊酯0㊁10㊁20㊁40㊁60和80mg㊃kg-1;氟氯氰菊酯0㊁5㊁10㊁20㊁30和60mg㊃kg-1,暴露期为28d,其中0mg㊃kg-1即为对照组㊂联苯菊酯和氟氯氰菊酯溶解在50mL丙酮中,然后撒到土壤中拌匀,平衡48h以挥发丙酮,调节水分含量至60%WHC㊂每个浓度有3个重复,每个重复含有2000g土壤和40条蚯蚓㊂1.2.2㊀指标测定分别于暴露第3㊁7㊁14㊁21和28天,从每个重复组中取出3条蚯蚓,放于湿润滤纸上清肠24h,然后冰块上解剖获取内脏㊂由于赤子爱胜蚓内脏较少,因此每个重复组中取出的3条蚯蚓内脏合并为一个样品㊂内脏使用0.15mol㊃L-1KCl清洗,然后放于2 mL匀浆缓冲液(包含250mmol㊃L-1蔗糖,50mmol㊃L-1Tris pH7.5,1mmol㊃L-1DTT和1mmol㊃L-1ED-TA)中进行手动匀浆㊂匀浆液于4ħ㊁15000ˑg下离心30min,取上清液用于测定消化酶活性㊂α-Glu活性测定参考Agustí等[20]和Boyd[21]的方法,将80μL内脏上清液和80μL的10mmol㊃L-1α-pNPG溶液放于96孔板内于37ħ下孵育反应1h,而后通过添加80μL的15%Na2CO3溶液以终止反应,然后放于酶标仪405nm处测定其吸光度㊂以转化酶作为标准溶液,α-Glu活性表示为单位质量(mg)蛋白参与反应产生的转化酶的量(U㊃mg-1protein)㊂蛋白酶活性测定采用福林酚法,是在Hidalgo 等[22]的方法基础之上略作调整后的方法㊂酪蛋白作为蛋白酶水解作用的底物,反应缓冲液分别使用0.2 mol㊃L-1NaAc-0.2mol㊃L-1HAC(pH3.6),0.2mol㊃mol㊃L-1Borax-0.2mol㊃L-1NaOH(pH10)㊂100μL 的酪蛋白水溶液(1%)㊁100μL内脏上清液和100μL反应缓冲液,放于40ħ水浴锅中孵育反应15min,之后加入300μL的0.4mol㊃L-1三氯乙酸,然后放于4ħ下静置10min,以10000ˑg离心5min㊂取离心后的100μL上清液,加入500μL的0.4mol ㊃L-1Na2CO3溶液和100μL的福林酚显色液充分混合,放于40ħ水浴中显色15min㊂显色结束后,取200μL溶液加入96孔板中,放于酶标仪测定溶液于650nm处的吸光度㊂酪氨酸溶液作为标准曲线溶液,1U蛋白酶活性定义为在40ħ各pH环境下单位时间(min)产生1μg酪氨酸所需要的酶量(酸性蛋白酶㊁中性蛋白酶和碱性蛋白酶)㊂土壤农药残留量的测定根据张志勇等[23]的方法并加以改进,分别于暴露第3㊁7㊁14㊁21和28天取出联苯菊酯和氟氯氰菊酯染毒的土壤样品,使用气相色谱(GC)测定土壤中2种拟除虫菊酯类农药的残留量,该部分数据已发表[15-16]㊂1.3㊀数据统计与分析使用SPSS21.0进行数据分析,数据均以平均值ʃ标准差表示,Kolmogorov-Smirnov检验和Lev-ene检验用于正态分布和方差齐性检验㊂使用Dunnett多重检验比较各暴露时间下拟除虫菊酯类农药处理组与对照组之间的显著性差异㊂如果数据不能满足匀质性,使用对数转换,如果转换数据后依然不满足方差齐性,则使用Kruskal-Wallis H 非参数检验进行数据分析㊂图形使用SigmaPlot 12.5制作㊂2㊀结果(Results)2.1㊀联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓α-Glu活性的响应如图1所示,在暴露初期第3天时,20~80mg㊃kg-1联苯菊酯处理组中蚯蚓α-Glu活性增加,说明在早期联苯菊酯能够诱导消化酶α-Glu的水解作用㊂随着时间延长,在暴露第7㊁14和28天,高剂量联苯菊酯(60~80mg㊃kg-1)对α-Glu活性起到抑制作用,即消化酶α-Glu的水解作用在长时间的高剂量组暴露下被干扰㊂如图2所示,在暴露21d内,除第14天外,其他暴露时间下,氟氯氰菊酯能够显著抑制蚯蚓体内的α-Glu活性㊂在暴露第28天下,氟氯氰菊酯处理组蚯蚓α-Glu活性与对照组无显著差异㊂2种拟除虫菊酯类农药暴露下,蚯蚓α-Glu第2期李玲玲等:2种拟除虫菊酯类农药对赤子爱胜蚓消化酶的毒性效应263㊀图1㊀联苯菊酯暴露下蚯蚓体内α-葡萄糖苷酶活性的变化注:α-Glu 表示α-葡萄糖苷酶;与对照组相比有显著性差异(*P <0.05㊁**P <0.01㊁***P <0.001)㊂Fig.1㊀Changes of α-Glu activity in earthworms afterexposure to bifenthrin in soilNote:α-Glu represents alpha -glucosidase;compared with the control,there are significant differences (*P <0.05,**P <0.01,***P<0.001).图2㊀氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓体内α-葡萄糖苷酶活性的变化注:α-Glu 表示α-葡萄糖苷酶;与对照组相比有显著性差异(*P <0.05㊁**P <0.01㊁***P <0.001)㊂Fig.2㊀Changes of α-Glu activity in earthworms afterexposure to cyfluthrin in soilNote:α-Glu represents alpha -glucosidase;compared with the control,there are significant differences (*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001).2.2㊀联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓蛋白酶活性的响应在联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下,蚯蚓体内3种蛋白酶活性(酸性蛋白酶㊁中性蛋白酶和碱性蛋白酶)被测定㊂如图3(a)所示,在暴露初期第3天时,酸性蛋白酶活性被20~80mg ㊃kg -1联苯菊酯显著诱(b)所示,与对照组相比,在暴露初期第3天时,中性蛋白酶活性被20~80mg ㊃kg -1联苯菊酯显著诱导,随着暴露时间延长,高剂量组(60~80mg ㊃kg -1)诱导作用减弱㊂如图3(c)所示,在暴露第3天,随着浓度的增加,碱性蛋白酶活性增加,在60mg ㊃kg -1和80mg ㊃kg -1联苯菊酯处理组达到显著诱导,分别是对照组的1.82倍和1.84倍㊂同样,随着暴露时间延长,诱导作用逐渐减弱㊂从响应剂量和显著性分析,3种蛋白酶中中性蛋白酶活性对联苯菊酯暴露的响应更为敏感㊂由图3可知,3种蛋白酶活性在暴露早期能够显著被联苯菊酯诱导,揭示着它们具有早期生物标志物的潜能㊂氟氯氰菊酯暴露下,3种蛋白酶活性的响应情况如图4所示㊂由图4(a)可知,暴露初期第3天时,低剂量氟氯氰菊酯处理组(5mg ㊃kg -1)显著诱导了赤子爱胜蚓体内酸性蛋白酶活性,而10~60mg ㊃kg -1氟氯氰菊酯处理组则抑制了赤子爱胜蚓体内酸性蛋白酶活性㊂在整个暴露期间内,高剂量氟氯氰菊酯处理组(60mg ㊃kg -1)对蚯蚓酸性蛋白酶活性起到抑制作用㊂如图4(b)所示,在第3天,与对照组相比,5mg ㊃kg -1氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓中性蛋白酶活性有所增加,随着暴露浓度的增加,中性蛋白酶活性有所降低㊂暴露第7天时,高剂量氟氯氰菊酯(60mg ㊃kg -1)显著抑制了蚯蚓中性蛋白酶活性,对照组活性是该处理组的1.59倍㊂到暴露中后期,则出现了诱导作用㊂由图4(c)可知,氟氯氰菊酯对蚯蚓碱性蛋白酶的显著影响仅仅发生在暴露早期第3天,蚯蚓碱性蛋白酶活性被5mg ㊃kg -1氟氯氰菊酯显著诱导,被10~60mg ㊃kg -1氟氯氰菊酯显著抑制,其中,对照组蚯蚓碱性蛋白酶活性是最高剂量组的1.37倍㊂随着暴露时间延长,碱性蛋白酶活性在处理组与对照组之间没有显著响应差异㊂从响应剂量和显著性分析,酸性蛋白酶和碱性蛋白酶活性对氟氯氰菊酯的早期暴露的响应更为敏感,在暴露后期,中性蛋白酶活性对低剂量氟氯氰菊酯的响应更敏感㊂由图3和图4结果可知,在联苯菊酯和氟氯氰菊酯早期暴露下3种蛋白酶活性主要呈现出相反的响应趋势㊂2.3㊀联苯菊酯和氟氯氰菊酯残留量与消化酶活性之间的量效关系随着暴露时间的延长,联苯菊酯和氟氯氰菊酯被逐渐降解,2种拟除虫菊酯类农药的降解符合一264㊀生态毒理学报第16卷下,蚯蚓体内消化酶活性与土壤残留的拟除虫菊酯类农药之间的量效关系,本研究选用3种曲线拟合拟除虫菊酯类农药残留量与消化酶活性的回归方程,并进行了显著性检验,P <0.05即表示曲线拟合效果较好,具有统计学意义(*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001)㊂如表1所示,在联苯菊酯暴露下,暴露初期(7d 内)消化系统3种蛋白酶活性与联苯菊酯残留量存在着显著的回归关系;暴露中后期,消化酶α-Glu 活性与土壤联苯菊酯残留量之间存在显著的回归关系㊂如表2所示,在氟氯氰菊酯暴露下,在暴露第7天时,4种消化酶活性与氟氯氰菊酯残留量之间存在较好的拟合方程关系;暴露中期14d 时,仅蚯蚓碱性蛋白酶活性与氟氯氰菊酯残留量存在显著的回归关系;暴露后期第21天时,仅有酸性蛋白酶活性与氟氯氰菊酯残留量存在显著的回归关系;最后暴露第28天时,α-Glu 活性和碱性蛋白酶活性与氟氯氰菊酯残留量之间存在显著的回归关系㊂2.4㊀联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下消化酶活性之间的相关性分析生物体中各生物标志物之间不是相互独立的,而是存在着互相调节的关系,本研究采用Pearson 相关性分析方法分析蚯蚓在2种拟除虫菊酯类农药暴露下,其体内4种消化酶之间的相关性㊂如图5所示,对照组处理下,蚯蚓α-Glu 活性与蛋白酶活性之间相关性不显著,3种蛋白酶活性之间存在显著的两两正相关㊂如图6和图7所示,在联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下,蚯蚓消化系统中α-Glu ㊁酸性蛋白酶㊁中性蛋白酶以及碱性蛋白酶活性之间呈现两两显著正相关㊂与对照组比较可以发现,在添加联苯菊酯和氟氯氰菊酯后,α-Glu 活性与蛋白酶活性出现显著相关性,说明2种拟除虫菊酯类农药的暴露能够诱导2类不同消化酶之间发生协同作用以应对外界胁迫㊂图3㊀联苯菊酯暴露下蚯蚓体内酸性蛋白酶(a )㊁中性蛋白酶(b )和碱性蛋白酶(c )活性的变化注:与对照组相比有显著性差异(*P <0.05㊁**P <0.01㊁***P <0.001)㊂Fig.3㊀Changes of acid (a),neutral (b)and alkaline (c)protease activities in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote:Compared with the control,there are significant differences (*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001).第2期李玲玲等:2种拟除虫菊酯类农药对赤子爱胜蚓消化酶的毒性效应265㊀图4㊀氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓体内酸性蛋白酶(a )㊁中性蛋白酶(b )和碱性蛋白酶(c )活性的变化注:与对照组相比有显著性差异(*P <0.05㊁**P <0.01㊁***P <0.001)㊂Fig.4㊀Changes of acid (a),neutral (b)and alkaline (c)protease activities in earthworms after exposure to cyfluthrin in soilNote:Compared with the control,there are significant differences (*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001).表1㊀土壤中联苯菊酯残留量与蚯蚓体内消化酶活性的量效关系Table 1㊀Dose -response relationship between bifenthrin residue in soil and digestive enzyme activity in earthworm联苯菊酯残留量与指标的回归方程Regression equations between bifenthrin residue and indicatorR 2α-葡萄糖苷酶α-Glu 酸性蛋白酶Acid protease 中性蛋白酶Neutral protease碱性蛋白酶Alkaline protease3dy =ax +b0.5830.834*0.784*0.944**y =ax 2+bx +c 0.7730.8360.944*0.989**y =a ln(x )+b 0.6740.842*0.900*0.988***7dy =ax +b0.5780.1470.1910.206y =ax 2+bx +c 0.5820.1750.2350.264y =a ln(x )+b 0.7310.6800.780*0.886*14dy =ax +b 0.714*0.6000.0230.165y =ax 2+bx +c 0.7140.7570.8300.691y =a ln(x )+b 0.893*0.5820.0470.10521dy =ax +b 0.1100.3020.1170.034y =ax 2+bx +c 0.8590.6080.4770.495y =a ln(x )+b 0.6290.4170.0120.07628dy =ax +b 0.816*0.2710.0190.374y =ax 2+bx +c 0.8340.2730.1510.569y =a ln(x )+b0.832*0.0650.0110.334注:x 表示土壤中联苯菊酯的实际残留浓度,y 表示消化酶活性,R 2表示可决系数,*表示P <0.05,**表示P <0.01,***表示P <0.001㊂Note:x is the concentration of bifenthrin residue;y is the activity of digestive enzyme;R 2represents coefficient of determination;*represents P <0.05,266㊀生态毒理学报第16卷图5㊀对照组处理中蚯蚓4种消化酶活性之间的Pearson 相关性注:*表示P <0.05,**表示P <0.01㊂Fig.5㊀Pearson correlation of activities of 4digestive enzymes in earthworms in control groupsNote:*represents P <0.05;**represents P <0.01.表2㊀土壤中氟氯氰菊酯残留量与蚯蚓体内消化酶活性的量效关系Table 2㊀Dose -response relationship between cyfluthrin residue in soil and digestive enzyme activity in earthworm氟氯氰菊酯残留量与指标的回归方程Regression equations between cyfluthrinresidue and indicatorR 2α-葡萄糖苷酶α-Glu 酸性蛋白酶Acid protease中性蛋白酶Neutral protease碱性蛋白酶Alkaline protease3dy =ax +b0.5060.4440.2280.416y =ax 2+bx +c 0.5190.4510.2370.417y =a ln(x )+b 0.5730.6410.3280.5467d y =ax +b0.719*0.868**0.753*0.351y =ax 2+bx +c 0.892*0.874*0.7950.427y =a ln(x )+b 0.855*0.968**0.874*0.786*14d y =ax +b0.1920.0220.0030.794*y =ax 2+bx +c 0.6960.2630.7170.951*y =a ln(x )+b 0.2590.1660.0330.911*21d y =ax +b0.6190.863**0.1220.031y =ax 2+bx +c 0.7190.911*0.1510.053y =a ln(x )+b 0.5980.983***0.5760.00128d y =ax +b0.665*0.3330.0000.035y =ax 2+bx +c 0.6970.4420.3510.121y =a ln(x )+b0.3890.6120.1540.891*注:x 表示土壤中氟氯氰菊酯的实际残留浓度,y 表示消化酶活性;R 2表示可决系数;*表示P <0.05,**表示P <0.01,***表示P <0.001㊂Note:x is the concentration of cyfluthrin residue;y is the activity of digestive enzyme;R 2represents coefficient of determination;*represents P <0.05,㊀第2期李玲玲等:2种拟除虫菊酯类农药对赤子爱胜蚓消化酶的毒性效应267图6㊀联苯菊酯暴露下蚯蚓4种消化酶活性之间的Pearson相关性注:*表示P<0.05,**表示P<0.01㊂Fig.6㊀Pearson correlation of activities of4digestive enzymes in earthworms after exposure to bifenthrin in soilNote:*represents P<0.05,**represents P<0.01.图7㊀氟氯氰菊酯暴露下蚯蚓4种消化酶活性之间的Pearson相关性注:*表示P<0.05,**表示P<0.01㊂Fig.7㊀Pearson correlation of activities of4digestive enzymes in earthworms after exposure to cyfluthrin in soil268㊀生态毒理学报第16卷3㊀讨论(Discussion)蚯蚓消化酶(α-Glu和蛋白酶)与其摄食能力㊁生物增长相关,然而却很少被用作识别环境污染物的生物标志物㊂本研究分析了联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露对土壤模式生物赤子爱胜蚓4种消化酶的影响㊂结果显示,联苯菊酯和氟氯氰菊酯影响了赤子爱胜蚓消化酶的活性,调节了2类不同消化酶之间的协同作用以应对暴露胁迫㊂暴露在联苯菊酯和氟氯氰菊酯染毒土壤下,赤子爱胜蚓体内α-Glu活性的变化表明其体内的糖类水解在一定程度上受到拟除虫菊酯类农药的影响㊂然而关于α-Glu响应的具体分子机制依然未知,有待进一步研究㊂蛋白酶水解作用能够调解有机体的发育过程㊁细胞内稳态和组织修复[24]㊂然而仅有少量研究以蛋白酶活性为端点进行污染暴露实验,例如花园爱胜蚓(E.hortensis)白细胞溶解产物中的蛋白酶活性在暴露5d后随着多氯联苯(PCBs)(1~30μg㊃cm-2)浓度的增加而增加[25]㊂本研究中,3种蛋白酶活性在暴露早期,能够分别被联苯菊酯和氟氯氰菊酯显著诱导和抑制,表明它们能够被用作早期警示标志物以评估联苯菊酯和氟氯氰菊酯的毒性效应㊂研究发现赤子爱胜蚓内脏中的中性和碱性蛋白酶水解活性高于酸性蛋白酶(图3和图4),这一现象也出现在鲤鱼和丁鲷中[22]㊂同一个指标在联苯菊酯和氟氯氰菊酯暴露下出现不同的响应,可能与2种拟除虫菊酯类农药的结构差异有关㊂相比Ⅰ型联苯菊酯,Ⅱ型氟氯氰菊酯的醇基团α碳上存在一个氰基团[26]㊂在整个暴露期间,蚯蚓消化酶与联苯菊酯和氟氯氰菊酯之间的相关性随着时间发生变化,可能因为随着时间延长,2种拟除虫菊酯类农药被蚯蚓及土壤微生物代谢转化,形成一个拟除虫菊酯类农药母体与中间代谢产物复合污染的体系,蚯蚓生化指标的变化是母体和中间产物共同影响的一个结果㊂例如,联苯菊酯代谢过程中环丙基甲酸和2-甲基3-联苯基甲醇产生,这些代谢产物的毒性可能高于母体化合物[27]㊂在氟氯氰菊酯的代谢过程中会释放出化学不稳定性的氰醇,氰醇能够分解为氰化物和醛类,而这些化合物是自由基的来源物,可以对有机体造成损伤[28]㊂综上所述,亚致死剂量的联苯菊酯和氟氯氰菊酯能够引起赤子爱胜蚓的消化酶活性的紊乱,从而抑制作用大于联苯菊酯,蛋白酶活性能够在暴露最早期指示联苯菊酯和氟氯氰菊酯的毒性㊂在2种拟除虫菊酯类农药暴露下,蚯蚓体内4种消化酶之间存在着显著的相关关系㊂通讯作者简介:宋玉芳(1954 ),女,博士,研究员,主要研究方向为土壤生态毒理学㊂参考文献(References):[1]㊀Dinu D,Marinescu D,Munteanu M C,et al.Modulatoryeffects of deltamethrin on antioxidant defense mechanismsand lipid peroxidation in Carassius auratus gibelio liverand intestine[J].Archives of Environmental Contamina-tion and Toxicology,2010,58(3):757-764[2]㊀Meacham C A,Brodfuehrer P D,Watkins J A,et al.De-velopmentally-regulated sodium channel subunits are dif-ferentially sensitive toα-cyano containing pyrethroids[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2008,231(3):273-281[3]㊀Oliveira C,Almeida J,Guilhermino L,et al.Acute effectsof deltamethrin on swimming velocity and biomarkers ofthe common prawn Palaemon serratus[J].Aquatic Toxi-cology,2012,124-125:209-216[4]㊀Wang S L,Tang X F,Wang L,et al.Effects of sublethalconcentrations of bifenthrin on the two-spotted spidermite,Tetranychus urticae(Acari:Tetranychidae)[J].Sys-tematic and Applied Acarology,2014,19(4):481[5]㊀Sáenz M E,Marzio W D D,Alberdi J L.Assessment ofcyfluthrin commercial 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