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小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。
1. 实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2 恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue 染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等试剂配比：(1) DMEM 10:10:1DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) (2) DMEM 5:5:1DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S(3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS （DMEM/F12无血清培养基+生长因子）25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine（腐胺），5μg/m l胰岛素，20 nM hydrocortisone（氢化可的松），20 nMprogesterone（孕激素），1％P / S+生长因子（5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA 溶液0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSSDMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nMhydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+Laminar flow hood Dissecting magnifying glas s Water bath at37oC Humidified tissue culture incubator (37oC, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004) T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (S terilin) 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech)2.实验步骤2.1星形胶质细胞的混合培养取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO2 恒温细胞培养箱( 37度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法小鼠肝脏窦状内皮细胞是肝脏微环境中的一种重要细胞类型，能够分泌多种生物活性物质，对肝脏功能的维持和调控起着重要作用。
为了研究小鼠肝脏窦状内皮细胞的生理功能以及相关疾病的发生发展机制，研究人员提出并优化了一种新的肝脏窦状内皮细胞的分离及培养方法。
该方法主要包括以下几个步骤：1.小鼠肝脏收集：选择4-6周龄的健康小鼠，进行麻醉后，用消毒好的手术刀进行腹部切口，取出肝脏后放入含有PBS缓冲液的培养皿中。
2. 肝脏组织分离：将肝脏分成小块，用显微镊子和剪刀细致地分离组织。
将分离好的肝脏组织放入50 ml离心管中。
3. 细胞悬浮：将分离好的肝脏组织用离心管尖端碾碎，加入含有PBS缓冲液的培养皿中，并用5 ml移液器不断悬浮，使细胞充分分散。
4.细胞预培养：将悬浮的细胞转移到一个新的含有PBS缓冲液的培养皿中，在37℃的恒温培养箱中进行预培养，以去除不能黏附的细胞。
5.分离窦状内皮细胞：将预培养的细胞转移到含有相应酶切剂的培养液中，如胰酶或胰酶/利巴韦林混合液，用37℃恒温培养箱恒温消化。
消化时间根据实验需要进行调整，通常为30-60分钟。
6. 细胞收获：将消化后的细胞和消化液转移到含有培养基的离心管中，用离心机进行离心，将上清液抽出。
重悬细胞并加入适量培养基，细胞密度通常为2-4×10^5个/ml。
7.细胞培养：将收获的窦状内皮细胞转移到预先涂覆了基质（如胶原、明胶、陶瓷片等）的培养皿中，加入适量的培养基，并将培养皿放回恒温培养箱中进行培养。
培养基的选择和配方可以根据实验需要进行调整。
8. 细胞鉴定：通过免疫荧光染色或免疫组化方法，使用窦状内皮细胞特异性标记物（如CD31、VE-Cadherin等）对分离的细胞进行鉴定，确认其为窦状内皮细胞。
通过这种新的小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养方法，可以获得纯度较高的窦状内皮细胞，为后续研究窦状内皮细胞的生理功能和相关疾病的发生发展机制提供了可靠的实验材料。
肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分离培养及鉴定的试验方案【试验原理】在用循环灌注法去除肝胶原组织后,根据HSC内含富含脂滴,密度较轻,它与肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理,采用密度梯度离心方法(连续性和非连续性两种)使HSC存在于一高度提纯的区带中而得以分离。
【试验动物】雄性清洁级Sprague-Dawsey大鼠（购自浙江省实验动物中心,合格证号：）,体重400～500g,常规饲料喂养,正常饮水,在分离HSCs前2周每天Vitamin A以200IU/100g灌胃。
【试剂与仪器】主要试剂Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz均为美国Sigma公司产品,DNA酶I(Dnase I)、DMEM培养干粉(高糖型)为Gibco公司产品,鼠抗人Desmin抗体SP试剂盒为福州迈新生物工程公司产品,其它试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器设备蠕动恒流泵、超净工作台(2台)、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化碳培养箱、多功能动物手术台等。
【试验方法】1、肝星状细胞的分离制备1）肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食12～16h,自由饮水。
2）用1％戊巴比妥钠40mg/kg 腹腔内注射麻醉大鼠。
3）胸腹部皮肤消毒,移入超净工作台中。
沿腹部正中线剪开腹腔,分离下腔静脉及门静脉,在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口,迅速插入自制血管插管,结扎固定。
4）接通恒流蠕动泵,灌注预热37℃的D-Hank’s肝脏灌流液,剪开下腔静脉,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏逐渐饱满,由紫红色逐渐变成淡黄白色。
5）游离肝脏,保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。
将游离之肝脏置于平皿中,灌注预热37℃的含酶Hank’s液I(含0.05％的胶原酶、0.1),并将灌注系统进液端放入平皿中,使流出的酶液可进行循环灌流,可见肝脏变软无弹性,肝包膜下出现小液泡。
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)21-03376-053376 www.CRTER .org·研究原著·徐莹，女，1989年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，上海中药大学在读博士，主要从事慢性肝病的研究。
通讯作者：刘平，博士，教授，上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203；上海中医药大学，上海高校中医内科学 E -研究院，上海市 201203通讯作者：刘伟，博士，助理研究员，上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203中图分类号:R394.2 文献标识码:B稿件接受：2018-03-13Xu Ying, Doctorate candidate, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University ofTraditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, ChinaCorresponding author: Liu Ping, M.D., Professor, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China; E-Institute of Traditional Chinese Internal Medicine, Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai University of TraditionalChinese Medicine, Shanghai 201203, ChinaCorresponding author: Liu Wei, M.D., Assistant researcher, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional ChineseMedicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education),Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法徐 莹1，张定棋1，2，慕永平1，陈佳美1，王清兰2，平 键1，刘 伟1，刘 平1，2 (1上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203；2上海中医药大学，上海高校中医内科学 E -研究院，上海市 201203)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0903 ORCID: 0000-0003-2633-3295(徐莹)文章快速阅读：文题释义：肝星状细胞：又称贮脂细胞，是肝脏中的一种间质细胞，位于Disse 间隙，胞体主要呈卵圆形或不规则形，胞质内富含类维生素A 脂滴，正常肝脏中肝星状细胞的数目很少，与肝细胞数量之比为1∶20，其总体积占肝体积的1.4%。
改良小鼠肝星状细胞的分离、培养及性质鉴定俞富祥;苏龙丰;季世强;张胜初;余盼攀;张启瑜【期刊名称】《肝胆胰外科杂志》【年(卷),期】2010(22)6【摘要】目的改进BALB/c小鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量.方法采用胶原酶经下腔静脉手工逆灌注肝脏、optiprep密度梯度离心法分离小鼠肝星状细胞,含血清-DMEM培养星状细胞,台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力;desmin、α-SMA免疫细胞化学检测进行星状细胞性质鉴定.结果肝星状细胞的得率稳定在2×105个/鼠以上,纯度为93%～97%左右,肝星状细胞存活率为95%～97%.结论改良小鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代小鼠肝星状细胞的生物学研究.【总页数】3页(P457-459)【作者】俞富祥;苏龙丰;季世强;张胜初;余盼攀;张启瑜【作者单位】温州医学院第一附属医院,肝胆胰外科,浙江,温州,325000;温州医学院第一附属医院,肝胆胰外科,浙江,温州,325000;温州医学院第一附属医院,肝胆胰外科,浙江,温州,325000;温州医学院第一附属医院,肝胆胰外科,浙江,温州,325000;温州医学院第一附属医院,肝胆胰外科,浙江,温州,325000;温州医学院第一附属医院,肝胆胰外科,浙江,温州,325000【正文语种】中文【中图分类】R657.3【相关文献】1.改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定 [J], 翁山耕;冷希圣;魏玉华;彭吉润;郑恩涛;程继华;张佑彬;吕建锋;杜如昱2.改良大鼠肝星状细胞分离及性质鉴定 [J], 王文兵;戴立里;郑元义3.日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离、鉴定和培养 [J], 曹蕴;李玉云;夏超明;许静4.一种改良的小鼠肝窦内皮细胞的分离、纯化、培养及鉴定方法 [J], 刘彪;傅童生;唐丽;贺福初5.小鼠肝星状细胞的分离、培养及鉴定方法 [J], 张强;陈曦;苏畅;张正筠;杨军;韦瑶;周光文;李宏为因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠原代肝细胞分离方法引言：小鼠原代肝细胞分离是研究肝脏生理和病理过程中常用的实验手段。
本文将介绍一种常用的小鼠原代肝细胞分离方法，旨在为科研工作者提供参考和指导。
材料与仪器：- 小鼠- 75%乙醇- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）- 培养基- 消化液- 离心管- 离心机- 显微镜- 细胞计数板方法：1. 准备工作a. 确保实验室环境干净，无细菌污染。
b. 消毒所需的仪器和材料，如离心管、培养皿等。
c. 准备所需的培养基和消化液，并将其预先加热至37℃。
2. 小鼠准备a. 使用75%乙醇对小鼠进行消毒，并将小鼠放置在消毒好的工作台上。
b. 使用显微镜观察小鼠的外部特征，确保小鼠健康无异常。
3. 小鼠肝脏采集a. 将小鼠固定在手术台上，用消毒的剪刀剪开腹腔。
b. 小心地将腹腔内的肝脏暴露出来，并使用消毒的注射器注入适量的PBS冲洗肝脏表面，以去除血液。
4. 肝脏消化a. 将肝脏放入含有预先加热至37℃的消化液的培养皿中。
b. 使用剪刀或刀片将肝脏切碎成小块，确保充分暴露细胞表面。
c. 将培养皿放入37℃恒温培养箱中，进行消化反应。
消化时间根据实验需要而定，通常为30-60分钟。
5. 细胞分离a. 用吸管轻轻吸取消化液中的细胞，转移到新的离心管中。
b. 将离心管放入离心机中，以1000rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。
c. 倒掉上清液，保留细胞沉淀。
d. 加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，并进行细胞计数。
6. 细胞培养a. 将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒好的培养皿中。
b. 在37℃恒温培养箱中，以5% CO2的条件下培养细胞。
c. 定期观察细胞的形态和增长情况，并根据需要进行后续实验。
讨论：小鼠原代肝细胞分离是一项常见的实验技术，用于研究肝脏生理和病理过程。
本文介绍的方法是一种经典的分离方法，通过肝脏消化和离心沉淀的步骤，成功地获得了小鼠原代肝细胞。
该方法具有操作简单、高效可靠的特点，适用于多种实验需求。
小鼠原代肝星状细胞的分离、鉴定及生物学功能分析韩聚强;杜静华;徐小洁;刘文鹏;梁吉光;李佳睿;叶棋浓【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2017(028)005【摘要】目的:探索C57.BL/6J小鼠肝星状细胞(HSCs)分离、纯化的可行方案,并评价该法所得HSCs的生物学特性.方法:经肝门静脉,先用不合钙镁离子的D-Hanks液充分灌注肝脏,再以适宜浓度的链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶顺序灌注,随后Percoll非连续密度梯度离心分离、纯化HSCs,台盼蓝拒染法检测HSCs活性,光镜观察体外培养的HSCs的形态学变化,免疫细胞化学鉴定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白的表达,Western印迹检测α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达.结果:纯化后每只小鼠获得HSCs约5.5×105个,纯度及存活率均大于95％;免疫细胞化学技术证实培养的HSCs分别表达α-SMA和结蛋白;Western印迹显示原代HSCs 体外培养7d时,α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达量达到峰值.结论:建立的分离、纯化方案可获得高纯度、高活率、功能正常的小鼠原代HSCs,为进一步研究肝纤维化的发病机制提供了技术保障.%Objective:To investigate and evaluate the feasible methods of isolating and purifying hepatic stellate cells(HSCs) from C57.BL/6J mouse in vitro.Methods:Mouse's liver was infused with D-Hank fluids via portal vein in situ.Subsequently,HSCs were isolated by discontinuous Percoll gradient centrifugation after liver was digested with pronase E,Ⅳ type collge nase and DNase,the cell viability was determined by trypan blue exclusion test.The morphological character of HSCs was observed by microscope.Both α-SMA and desmin were identified byimmunocytochemistry staining.Both α-SMA and Ⅰ type collagen was detected by Western blot.Results:The yield amount of HSCs was about 5.5×105 per mouse's liver.Both viability and purity were more than 95％.Immunocytochemistry staining demonstrated that α-SMA and desmin were positive in HSCs cultured in vitro.Western blot assay showed that α-SMA and Ⅰ type collagen were expressed extremely at 7thday.Conclusion:The established protocol is so successful in isolating and culturing the primary mouse HSCs that provides a technical support for research of relevant liver fibrogenesis in the future.【总页数】5页(P600-603,708)【作者】韩聚强;杜静华;徐小洁;刘文鹏;梁吉光;李佳睿;叶棋浓【作者单位】陆军总医院肝病科,北京100700;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;河北医科大学第三医院中西医结合肝病科,河北石家庄050051;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;河北医科大学第三医院感染科,河北石家庄050051;吉林大学第一医院介入科,吉林长春130021;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;吉林大学第一医院介入科,吉林长春130021;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850【正文语种】中文【中图分类】Q24【相关文献】1.大鼠肝星状细胞的原代分离、培养与鉴定 [J], 张燕;任长东;舒玲2.大鼠肝星状细胞的原代分离、培养与鉴定 [J], 罗海峰;吴志勇;陈炜;邱江锋;张燕3.大鼠原代肝星状细胞分离、鉴定及培养方法的研究 [J], 张玉;周曦;易龙;马鑫;张乾勇;糜漫天4.提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法 [J], 徐莹;张定棋;慕永平;陈佳美;王清兰;平键;刘伟;刘平5.提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法 [J], 徐莹;张定棋;慕永平;陈佳美;王清兰;平键;刘伟;刘平;;;;;;;;;;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠HSCs 的分离1) 实验前准备：37℃水浴锅内预热D-HanK’s溶液、HBSS溶液(含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶)及含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶和20 μg/mL 的DNA 酶的HBSS 溶液；2) 小鼠准备：取体重约25~30 g 的雌性Colgalt2-/-小鼠与Colgalt2+/+小鼠，禁食12 h，自由饮水；3) 麻醉与固定：腹腔注射8‰的戊巴比妥钠麻醉小鼠，麻醉后固定在超净台内，75%乙醇消毒腹部；4) 依次切开小鼠皮肤、腹膜后暴露腹腔，将小鼠胃肠移至腹部左侧，充分暴露门静脉和下腔静脉。
整个过程均按照手术无菌原则执行；5) 自门静脉远端刺入静脉输液针，另一端连接50 mL 注射器，注射预热的D-HanK’s 液。
确定插入成功后，剪开下腔静脉。
以7-10 mL/min 的速度灌注D-HanK’s 液，灌注约30 mL。
观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’s液中无肉眼可见血液后停止灌注；6) 开始灌注预热的含IV 型胶原蛋白酶的HBSS 溶液，速度为3-5 mL/min，灌注10 min 左右。
直至肝脏变软、变脆，肝脏表面呈现裂隙状，压之凹陷不易恢复时结束灌注；7) 摘除胆囊后，剪断门管区韧带和镰状韧带，取下肝脏，放入无菌平皿中。
生理盐水冲洗，剔除肝包膜、血管及纤维结缔组织；8) 剪碎肝组织及震荡消化：将肝组织剪成小碎块，加入已配制好的HBSS液20 mL(含0.3 mg/mL的IV 型胶原酶和1 μg/mL的DNAase I)，37 ℃条件下震荡消化25 min；9) 用200 钼的滤网过滤，1500 g 离心7 min，弃上清；10) 20 mL 冰的不含FBS 的DMEM 培养基将细胞重悬，500 g 离心5 min。
弃去沉淀，即去除肝细胞；11) 离心上清液，1500 g，7 min，吸取沉淀（即肝非实质细胞）；12) 加入2 倍体积的18%Nycodenz离心液，混匀后，小心加入冷的不含FBS的DMEM (约2 mL)；13) 离心：2600 g，22 min。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010551733.X(22)申请日 2020.06.17(71)申请人 南昌大学地址 330000 江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号(72)发明人 柳全文 顾皓铖 李婧嫄 (51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法(57)摘要本发明涉及细胞分离领域，公开了一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法。
该方法包括以下步骤：准备12周以上的成年小鼠，灌流得到体内消化后的肝脏，经加双抗的DMEM多次清洗后，进行肝脏的捣碎，捣碎后的肝脏经胶原酶和链霉蛋白酶混合液，37℃水浴锅中消化10分钟后，过200目滤网，经离心，去上清，密度梯度离心后，用肝星状细胞培养基置于5％CO 2、95％湿度、37℃培养箱中培养，24小时后换液去除未贴壁细胞，随后每2天换液。
本发明的方法简单高效，能够较高得率的获得小鼠肝星状细胞，为研究肝纤维化获得了宝贵的实验材料，有利于充分了解肝星状细胞在肝脏纤维化过程中起的作用。
权利要求书3页 说明书6页 附图1页CN 111849861 A 2020.10.30C N 111849861A1.一种小鼠肝星状细胞分离、提取与培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将小鼠的表皮与皮下黏膜剪开，结扎小鼠的上腔静脉，从门静脉先后灌流EGTA溶液、链霉蛋白酶溶液及胶原酶溶液，用手术剪刀剪下消化完全的肝脏；(2)将步骤(1)中获取的肝脏在DMEM中漂洗，剥碎，放入链霉蛋白酶与胶原酶组成的混合液中体外37℃消化10分钟，过200目细胞塞收集滤液；(3)将步骤(2)中获得的滤液580g离心10分钟、弃上清后加入密度梯度离心液通过高速离心机1380g离心17分钟，弃上清加入GBSS/B溶液后重悬再次600g离心10分钟，将细胞沉淀接种于6孔板中，孔中加入2ml肝星状细胞培养基，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养；(4)细胞接种3h后，肝星状细胞开始贴壁，接种24h，大部分细胞都已贴壁，换液去除未贴壁死细胞，此后每两天进行换液。
