一种简单分离成年小鼠肝细胞的方法

小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法小鼠肝脏窦状内皮细胞是肝脏微环境中的一种重要细胞类型，能够分泌多种生物活性物质，对肝脏功能的维持和调控起着重要作用。

为了研究小鼠肝脏窦状内皮细胞的生理功能以及相关疾病的发生发展机制，研究人员提出并优化了一种新的肝脏窦状内皮细胞的分离及培养方法。

该方法主要包括以下几个步骤：1.小鼠肝脏收集：选择4-6周龄的健康小鼠，进行麻醉后，用消毒好的手术刀进行腹部切口，取出肝脏后放入含有PBS缓冲液的培养皿中。

2. 肝脏组织分离：将肝脏分成小块，用显微镊子和剪刀细致地分离组织。

将分离好的肝脏组织放入50 ml离心管中。

3. 细胞悬浮：将分离好的肝脏组织用离心管尖端碾碎，加入含有PBS缓冲液的培养皿中，并用5 ml移液器不断悬浮，使细胞充分分散。

4.细胞预培养：将悬浮的细胞转移到一个新的含有PBS缓冲液的培养皿中，在37℃的恒温培养箱中进行预培养，以去除不能黏附的细胞。

5.分离窦状内皮细胞：将预培养的细胞转移到含有相应酶切剂的培养液中，如胰酶或胰酶/利巴韦林混合液，用37℃恒温培养箱恒温消化。

消化时间根据实验需要进行调整，通常为30-60分钟。

6. 细胞收获：将消化后的细胞和消化液转移到含有培养基的离心管中，用离心机进行离心，将上清液抽出。

重悬细胞并加入适量培养基，细胞密度通常为2-4×10^5个/ml。

7.细胞培养：将收获的窦状内皮细胞转移到预先涂覆了基质（如胶原、明胶、陶瓷片等）的培养皿中，加入适量的培养基，并将培养皿放回恒温培养箱中进行培养。

培养基的选择和配方可以根据实验需要进行调整。

8. 细胞鉴定：通过免疫荧光染色或免疫组化方法，使用窦状内皮细胞特异性标记物（如CD31、VE-Cadherin等）对分离的细胞进行鉴定，确认其为窦状内皮细胞。

通过这种新的小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养方法，可以获得纯度较高的窦状内皮细胞，为后续研究窦状内皮细胞的生理功能和相关疾病的发生发展机制提供了可靠的实验材料。

一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法鵬臟臟。

永玲郑江第三军医大学第一附属医院中心实验室摘要：目的在传统肝细胞提取方法的棊础上，优化一种易操作、快速实用获取小鼠肝细胞的方法，为从事肝脏功能相关研宂人员提供改良的实验方法参考。

方法以肝脏分离液逆向灌注小鼠肝脏后，剪碎，肝脏酶消化后密度梯度离心分离肝细胞，转入培养基培养。

采用台盼蓝染色计算细胞活力，流式细胞检测技术计算纯度，倒置显微镜观察细胞形态。

结果获得较高纯度和活力的肝细胞，具备肝细胞的典型形态特征。

结论通过逆向灌注，降低/灌注的难度，同时获得较高纯度、较高活力的肝细胞，经多次实验证明该方法确实是一种易操作、高效适用的肝细胞提取方法。

关键词：C57BL/6J小鼠;肝细胞;逆向灌注;活力;纯度;作者简介：范仕郡（1983-）,男，助理研究员，研究方向:脓毒症的发病机制与拮抗措施研宄。

E-mail:574472439@qq. com作者简介：郑江（1961-）,男，研究员，研究方向:脓毒症的发病机制与拮抗措施研究。

E-mail:收稿日期：2017-03-20基金：国家自然科学基金项FI （编号:81372089）A simplified method for isolation and culture of primary mouse hepatocytesFAN Shi-jun LIU Xin YANG Dong ZHU Yuan-feng LU Yong-ling ZHENG JiangMedical Research Center, First Affiliated Hospital， Third Military Medical University; Abstract：Objective To simplify and optimize the method for isolation and culture of primary mouse hepatocytes on the basis of conventional extraction method, and to provide a reference for related research. Methods Mouse liver was reversely perfused with the isolation solution ( i. e., through the vena cava inferior in, and portal vein out)，cut into small pieces and digested with enzymes. Then the hepatocytes were isolated by density gradient centrifugation and transferred into culture medium. The cell viability was detected by trypan blue staining. The purity of the hepatocytes was analyzed by flow cytometry and the cell morphology was observed with an inverted microscope. Results The hepatocytes obtained by this improved method showed high viability and purity, with typical characteristics of cell morphology. Conclusions The liver perfusion is facilitated by reversed perfusion, and the isolated hepatocytes are with high viability and purity confirmed by many times of experiments. This optimized procedure is an easy and efficient method for isolation of primary mouse hepatocytes.Keyword：C57BL/6J mice; Hepatocytes; Reversed perfusion; Viability; Purity; Received： 2017-03-20肝脏是人体最大的实质器官和重要的排毒器官。

小鼠原代肝细胞分离方法引言：小鼠原代肝细胞分离是研究肝脏生理和病理过程中常用的实验手段。

本文将介绍一种常用的小鼠原代肝细胞分离方法，旨在为科研工作者提供参考和指导。

材料与仪器：- 小鼠- 75%乙醇- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）- 培养基- 消化液- 离心管- 离心机- 显微镜- 细胞计数板方法：1. 准备工作a. 确保实验室环境干净，无细菌污染。

b. 消毒所需的仪器和材料，如离心管、培养皿等。

c. 准备所需的培养基和消化液，并将其预先加热至37℃。

2. 小鼠准备a. 使用75%乙醇对小鼠进行消毒，并将小鼠放置在消毒好的工作台上。

b. 使用显微镜观察小鼠的外部特征，确保小鼠健康无异常。

3. 小鼠肝脏采集a. 将小鼠固定在手术台上，用消毒的剪刀剪开腹腔。

b. 小心地将腹腔内的肝脏暴露出来，并使用消毒的注射器注入适量的PBS冲洗肝脏表面，以去除血液。

4. 肝脏消化a. 将肝脏放入含有预先加热至37℃的消化液的培养皿中。

b. 使用剪刀或刀片将肝脏切碎成小块，确保充分暴露细胞表面。

c. 将培养皿放入37℃恒温培养箱中，进行消化反应。

消化时间根据实验需要而定，通常为30-60分钟。

5. 细胞分离a. 用吸管轻轻吸取消化液中的细胞，转移到新的离心管中。

b. 将离心管放入离心机中，以1000rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。

c. 倒掉上清液，保留细胞沉淀。

d. 加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，并进行细胞计数。

6. 细胞培养a. 将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒好的培养皿中。

b. 在37℃恒温培养箱中，以5% CO2的条件下培养细胞。

c. 定期观察细胞的形态和增长情况，并根据需要进行后续实验。

讨论：小鼠原代肝细胞分离是一项常见的实验技术，用于研究肝脏生理和病理过程。

本文介绍的方法是一种经典的分离方法，通过肝脏消化和离心沉淀的步骤，成功地获得了小鼠原代肝细胞。

该方法具有操作简单、高效可靠的特点，适用于多种实验需求。

第1篇一、实验目的1. 熟悉小鼠肝脏解剖方法。

2. 掌握小鼠肝脏提取和保存方法。

3. 学习组织样品的制备和储存技术。

二、实验原理肝脏是人体重要的代谢器官，具有合成、储存、解毒等多种功能。

本实验通过解剖小鼠，提取肝脏组织，旨在为后续的实验研究提供材料。

三、实验材料与仪器1. 实验动物：健康成年小鼠一只。

2. 仪器：解剖剪、解剖针、手术刀、剪刀、镊子、培养皿、酒精棉球、生理盐水、福尔马林固定液、冰盒、解剖显微镜等。

四、实验步骤1. 实验动物处死：用酒精棉球擦拭小鼠，使其昏迷，然后迅速用剪刀剪断小鼠颈部，使小鼠死亡。

2. 解剖：将小鼠放入解剖盘中，用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹腔。

3. 提取肝脏：用解剖剪剪开肝脏周围的结缔组织，用镊子将肝脏轻轻夹出，放入培养皿中。

4. 清洗：用生理盐水冲洗肝脏表面，去除杂质。

5. 固定：将肝脏放入装有福尔马林固定液的培养皿中，浸泡固定。

6. 保存：将固定好的肝脏取出，放入装有酒精的容器中，密封保存。

五、实验结果与分析1. 成功解剖小鼠并提取肝脏组织。

2. 肝脏表面有明显的红褐色，质地柔软，易于夹取。

3. 肝脏表面无明显杂质，清洗过程中保持肝脏组织完整。

六、实验讨论1. 实验过程中，解剖操作要轻柔，避免损伤肝脏组织。

2. 肝脏固定过程中，福尔马林固定液浓度不宜过高，以免影响后续实验结果。

3. 实验动物处死过程中，要确保小鼠死亡，避免实验过程中出现意外。

七、实验结论本实验成功解剖小鼠并提取肝脏组织，为后续实验研究提供了可靠的组织样品。

在实验过程中，掌握了组织样品的制备和储存技术，为今后相关实验奠定了基础。

八、实验改进1. 在解剖过程中，可使用解剖显微镜观察肝脏结构，提高解剖效率。

2. 在肝脏固定过程中，可选用其他固定液，如4%多聚甲醛，以提高固定效果。

3. 在实验动物选择上，可根据实验需求，选用不同品种、年龄的小鼠。

第2篇一、实验目的1. 学习小鼠肝脏的解剖方法。

2. 掌握肝脏细胞的提取方法。

小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程小鼠肝脏是重要的免疫细胞来源地之一，其免疫细胞种类繁多，包括各类淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。

因此，高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞对于免疫学研究具有重要意义。

下面将介绍一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程。

一、试验动物的选取首先需要选择健康的小鼠作为实验动物。

通常可以选择8-12周龄、体重20-25g的小鼠进行实验。

此外，实验前需要确保小鼠处于良好的生理状态，无任何疾病或感染。

二、材料准备1.小鼠静脉采血脉管采血针及离心管2.无菌手术器械3.生理盐水4.乙醚5. 70%乙醇6.无菌培养皿和离心管三、操作步骤1.术前准备将实验所需材料进行无菌处理，保证操作环境无菌。

2.麻醉利用乙醚对小鼠进行麻醉，待小鼠完全麻醉后，进行下一步操作。

3.打开腹腔将小鼠放在无菌操作台上，采用无菌手术器械进行皮肤消毒和切开小鼠腹腔。

4.采集肝脏在麻醉状态下，将小鼠的肝脏从腹腔中取出放入无菌盛皿中。

5.分离肝脏细胞将取出的小鼠肝脏放入含有生理盐水的离心管中，用离心机进行离心，将肝脏中的细胞分离出来。

6.细胞培养取出离心管中的肝脏细胞，放入无菌培养皿中，加入适量的培养基，进行培养。

7.细胞鉴定通过显微镜检查培养后的细胞，进行鉴定和分析。

通过以上步骤，就可以高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞。

这种方法不仅简单易行，而且获取到的免疫细胞种类繁多，可用于免疫学研究中的各种实验。

在操作过程中，需要严格遵守无菌操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。

同时，也需要尽量减少对小鼠的伤害和痛苦，符合动物实验伦理要求。

希望这种方法能对相关研究工作提供帮助，推动免疫学领域的进步。

实验一机械法分离培养动物细胞及计数一.实验目的1.掌握机械法分离培养动物细胞的原理及方法2.掌握细胞计数的方法二.实验原理在机体中，器官通常由几种组织构成，组织又由细胞通过紧密连接锚定连接、通讯连接构成组织。

采用机械法破坏细胞间的连接，能获得单个细胞。

本实验采用剪碎小白鼠肝组织的方法获取单个肝细胞，该方法简单易行。

三.实验材料1.动物：小白鼠（成年）2.试剂：PBS缓冲液，RPMI-1640培养液3.器材：手术器械、试管、滤网、离心管、离心机、显微镜等；四.实验方法1.无菌获取肝组织取成年小白鼠一只，断颈处死，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精洗碘。

剪开腹壁，暴露肝脏组织，换手术器材，剪取0.3mm3肝脏组织块，置于培养皿中。

2.获取细胞剔除脂肪组织，加PBS缓冲液1ml，反复冲洗2-3次，剪碎组织块至1mm3，加RPMI-1640培养液，滤网过滤至离心管。

平衡、离心（1000rpm,5min），弃上清，加培养液1ml，吹打均匀，成细胞悬液。

3.细胞计数取细胞计数板一个，盖上盖玻片，去细胞悬液，沿盖玻片便于滴1滴，显微镜下计细胞数，原则：计上不计下，计左不计右4.细胞培养加细胞培养液，稀释至1X105个/ml，移入培养皿，37℃，CO25%培养箱中培养四.实验结果实验二酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞一.实验目的掌握消化分离培养小鼠胎儿成纤维细胞的基本方法二.实验原理胰蛋白酶是一种消化酶，它通过作用于精氨酸或赖氨酸之剑的肽键，能破坏细胞间的连接，进而从组织块中分离获得单个细胞；细胞之间是通过CAM相连，而很多粘性分子只有在+2价金属离子，如Ca2+,Mg2+的存在下，才能行使这种功能，在胰蛋白酶中加EDTA的作用是熬合这些二价例子，使细胞被消成单细胞状态；本实验就是采用胰蛋白酶和EDTA消化小鼠胎儿肌肉细胞获得单个细胞。

三.实验器材1.试剂：10%犊牛血清（NBS）的1640培养液，0.25%胰蛋白酶，0.04%EDTA，PBS2.器械：离心机，滴管，普通天平，手术器械，血球计数板，离心管等3.材料：怀孕13-17天母鼠四.实验步骤1.取材：断颈处死怀孕小鼠，腹部向上置于解剖盘中，碘酒消毒1-2次，75%酒精脱碘，剪开腹壁，更换手术器械，取胎儿置培养皿中2.剔除和清洗：从子宫中挤出胎儿，剪去胎儿头、尾、四肢、内脏和脊柱后，反复用PBS冲洗3-4次3.剪碎：将冲洗干净后的胎儿组织块置另一培养皿中，剪碎至1mm3（剪15-20min）4.消化：加入4ml0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化5-7min5.终止：加入4ml含10%NBS的1640培养液终止消化6.收集细胞：离心用100目滤纱将细胞悬液过滤至离心管中，平衡离心（1000rpm,5min）7.制备细胞悬液：弃上清，加1ml1640培养液，吹打成细胞悬液8.细胞形态观察：取载玻片一张，滴细胞悬液一滴，盖上盖玻片，显微镜下观察9.细胞计数：按上一实验介绍方法计数10.培养细胞：将稀释至1X105个/ml细胞悬液加入培养皿中，置于5%CO2，37℃，75%湿度培养箱中培养实验三牛镜子细胞冷冻与活率检验一.实验目的1.掌握细胞冷冻解冻原理及方法2.掌握细胞活率检验原理及方法二.实验原理细胞培养液中加冷冻保护剂，并通过一定的冷冻程序冷冻细胞，一方面使细胞内形成的结晶体积较少，减少对细胞的机械性损坏；另一方面缓解细胞内因结晶引起的局部高渗对细胞的伤害。

一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。

二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。

三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。

2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。

3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。

四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。