【快速石蜡包埋组织切片的制备】石蜡组织切片

石蜡切片制作流程以石蜡切片制作流程为标题，写一篇文章。

石蜡切片制作是一项常见的实验技术，在生物学、医学和材料科学等领域广泛应用。

石蜡切片可以用于显微镜下的观察和分析，能够提供关于细胞和组织结构的详细信息。

下面将介绍一下石蜡切片的制作流程。

1. 组织固定：首先，需要从感兴趣的样本中取得组织样本，并将其进行固定。

固定是为了保持组织的形态结构和化学成分，常用的固定剂有福尔马林、乙醛等。

固定过程中，需要确保样本完全浸泡在固定液中，通常需要数小时至数天的时间，以确保组织被充分固定。

2. 脱水：固定后的组织样本需要进行脱水处理，以去除其中的水分。

脱水是将样本中的水分逐渐替代为有机溶剂，常用的有乙醇、丙酮等。

通常采用递增浓度的有机溶剂，从低浓度逐渐提高到高浓度。

每个浓度的脱水液中，样本需要浸泡一定的时间，以确保脱水彻底。

3. 渗透：脱水后的组织样本需要进行渗透处理，以使其与石蜡更好地结合。

渗透剂通常为石蜡溶液，可以将样本浸泡在石蜡溶液中，以使其逐渐渗透进入组织内部。

渗透过程中，需要注意控制温度和时间，以确保渗透均匀。

4. 包埋：渗透后的组织样本需要进行包埋处理，即将其嵌入到石蜡中。

首先，将组织样本放置在石蜡模具中，并加入适量的石蜡。

然后，将模具放入石蜡包埋机中，利用加热和真空等处理，使石蜡与组织样本充分结合。

包埋过程中需要严格控制温度和时间，以确保石蜡固化完全。

5. 切片：包埋后的组织样本需要进行切片处理，以获取薄片供观察。

首先，使用切片机将石蜡块切割成薄片。

然后，将薄片置于载玻片上，并加热使其与载玻片结合。

最后，使用刮片等工具将石蜡薄片修整成所需的形状和大小。

6. 然后，对切片进行染色处理，以增强对组织结构的观察。

常用的染色方法有血液学染色、免疫组化染色等。

染色后，可以使用显微镜观察和分析切片中的细胞和组织结构。

总结起来，石蜡切片制作流程包括组织固定、脱水、渗透、包埋、切片和染色等步骤。

每个步骤都需要严格控制条件和时间，以确保制作出高质量的石蜡切片。

组织制片技术原理与流程及切片机的使用组织制片的特点组织制片是组织学、胚胎学、病理学、生物学等学科观察和研究组织、细胞的正常形态和病理变化的常用方法。

其基本原理是用固定剂固定组织、细胞以及各种亚细胞器，保持组织的微细结构，制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差，在显微镜下观察组织、细胞的形态结构，或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分，并可进行形态和化学成分的定量分析。

随着细胞和分子生物学技术的发展，组织制片也为原位显示细胞内基因表达提供了基础。

一石蜡包埋切片制作石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂，故固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织中的水，后用二甲苯等透明剂置换出乙醇，此过程即脱水、透明。

再用石蜡渗入组织块，冷凝后变硬，即浸蜡、包埋，就可在切片机上切片了。

1. 固定细胞、组织离体后要迅速用相应的固定剂固定，使蛋白质沉淀、变性、凝固，保持组织原有的形态结构和抗原性。

一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或Carnoy于4C并向固定过夜。

2. 脱水与透明固定后的组织须由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，一般为50%、70%、85%、95%、和100%（ 3 次）3. 渗蜡与包埋渗蜡是石蜡置换组织块中透明剂的过程，一般用熔点为52-60 C的石蜡。

透明后的组织块先于1/1体积的二甲苯与石蜡中37C渗透过夜，后温度调至58C换入纯石蜡继续渗透，一般每间隔3h 换一次纯石蜡，直到无二甲苯气味即可进行包埋。

4. 切片与展片先用刀片修去组织块周围多余的石蜡，一般保留2mm 左右的石蜡，修整成梯形的组织块，以便于展片时蜡带的分离。

先加热刀片，后把修好的组织块快速粘到方形的小木块上，冷凝后即可进行切片。

一般组织切片的厚度为6-12um，切片速度以40-50次/min为宜，用毛笔托起蜡带，分割后依次放到洁净的载玻片上，蜡带的光滑面朝下放，后滴上适量的蒸馏水放至展片台上于37-40 C烤片过夜。

常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备㈠组织块依序进行：①水洗，②脱水，③透明，④浸蜡，⑤包埋和⑥切片。

㈡组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。

㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间）1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。

2．脱水（常温下）（1）乙醇－甲醛（AF）液固定60~120min（2）80%乙醇60~120min（3）95%乙醇Ⅰ 60~120min（4）95%乙醇Ⅱ 60~120min（5）无水乙醇Ⅰ 60~120min（6）无水乙醇Ⅱ 60~120min（7）无水乙醇Ⅲ 60min［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。

②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10 倍以上。

③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。

④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml 乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。

⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。

⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。

⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。

3．透明（1）二甲苯Ⅰ 20min（2）二甲苯Ⅱ 20min（3）二甲苯Ⅲ 20min［注意事项］①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。

②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。

③二甲苯应及时过滤、更换。

④组织经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。

4．浸蜡（1）石蜡Ⅰ（45~50℃）60min（2）石蜡Ⅱ（56~58℃）60min（3）石蜡Ⅲ（56~58℃）60min［注意事项］①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ℃）进行，不得用明火加温。

石蜡切片的主要制备程序
石蜡切片的主要制备程序可以概括为以下几个步骤：
1. 准备样品：选择需要切片的样品，如组织样本、细胞样品等，并采取相应的固定、处理和染色等预处理步骤，以保证样品的稳定性、可观察性和对比度。

2. 材料准备：准备好所需的石蜡、切片盒、切片刀、载玻片等材料，并进行清洁和消毒处理，以避免污染和交叉感染。

3. 石蜡浸透：将处理好的样品转移到石蜡中进行浸透。

首先将样品置于温度逐渐升高的浸透剂（如正己烷）中，以去除组织内水分和其他溶质，然后置于石蜡中进行浸透。

4. 切片制备：将石蜡浸透的样品固定于切片盒中，将石蜡块剪碎成适当大小，并放置在切片刀的刀脊上。

调整切片机参数（如温度、角度、速度等），并逐个切割出薄片。

5. 切片贴片：将切好的薄片浮于温水中或使用其他方法，如电离子器、热平台等，以使切片展平并附着于载玻片上。

6. 干燥固定：将切片连同载玻片一起进行干燥固定处理，以去除水分并保持切片的形态稳定。

7. 切片染色：根据实验需求，对切片进行适当的染色处理（如组织学染色、免疫组化染色等），以增强样品的可视化效果和区分感兴趣的结构。

8. 封片封装：将切片封装至封片盖玻片上，使用透明化导电胶或其他封片剂固定切片，并尽量排除气泡、保证封片质量。

9. 切片质控：对制备好的切片进行质量控制，使用显微镜观察和评估切片的清晰度、结构完整性、染色效果等。

最后，制备完成的石蜡切片可以用于显微镜观察、组织形态分析、病理学研究等应用。

需要注意的是，在整个制备过程中，应遵循标准实验操作规程、注意安全，以及依据实验要求进行相应的优化和调整。

组织石蜡包埋和切片技术组织石蜡包埋和切片技术包埋剂embedding agent在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。

所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。

一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂。

石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。

此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。

除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。

该法多采用旋转式切片机进行切片。

石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。

采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。

为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。

分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。

分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。

（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。

常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。

将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。

用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。

F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。

卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。

因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。

石蜡包埋组织样品制备方法组织采集后，经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片，方可进行HE染色（或其它化学染料染色）及免疫抗体标记。

以下操作依据组织大小及致密程度而定1、组织的采集、固定和保存：可依据实验目的及组织的特点而考虑采用不同的固定和保存方法。

此处只介绍实验室常用方法。

采取组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10min至1小时，于30%、50%乙醇中各10 min至1小时，4︒C保存于70%乙醇中。

2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54︒C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10μm，贴于处理过的干净载玻片上，34︒C烤片过夜，之后收集于载片盒中，4︒C密封保存。

石蜡包埋：保存于4︒C 70%乙醇中的组织样品↓80%乙醇15 min↓95%乙醇15 min↓100%乙醇15min ⨯ 2↓1/2乙醇1/2二甲苯15 min↓二甲苯透明5-10 min↓1/2二甲苯1/2石蜡30 min↓石蜡（1） 1.5hr↓石蜡（2） 1.5-2.5hr↓石蜡（3）包埋↓4︒C保存3、石蜡组织切片的免疫标记：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，即可进行免疫反应，操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。

石蜡组织切片脱蜡、复水步骤：密封保存于4︒C的组织切片↓二甲苯(1) 10 min↓二甲苯(2) 10 min↓二甲苯(3) 10 min↓1/2二甲苯1/2乙醇15 min↓100%乙醇 5 min↓95%乙醇 5 min↓80%乙醇 5 min↓70%乙醇5 min↓50%乙醇 5 min↓30%乙醇 5 min↓d2H2O 5 min4、石蜡组织切片的HE染色：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，于苏木精中室温染色5-20 min，迅速用水冲洗切片，至组织切片变蓝，镜检。

用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟，也可用50ml H2O中加一滴氨水分色，效果亦好（如染色程度恰好，也可省略分色步骤）。

一、实验目的1. 掌握石蜡包埋技术的基本原理和操作步骤。

2. 熟悉石蜡包埋在组织切片制作过程中的重要作用。

3. 了解石蜡包埋技术在病理诊断、科研等领域的应用。

二、实验原理石蜡包埋技术是一种常用的组织切片制备方法，其基本原理是将组织固定、脱水、透明、浸蜡后，将其包埋在石蜡中，形成硬化的组织块，便于后续的切片和染色等操作。

石蜡具有较好的透明度和可塑性，且与组织切片易于分离，有利于显微镜观察。

三、实验材料1. 新鲜组织样本：如肿瘤组织、正常组织等。

2. 固定液：4%多聚甲醛溶液。

3. 脱水剂：75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II、醇苯、二甲苯I、二甲苯II、蜡I、蜡II、蜡III。

4. 包埋剂：石蜡。

5. 切片机：石蜡切片机。

6. 其他：手术刀、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、烘箱、显微镜等。

四、实验步骤1. 组织固定：将新鲜组织样本放入4%多聚甲醛溶液中固定24小时以上。

2. 取材：将固定好的组织从固定液中取出，用手术刀将目的部位组织修平整，并切取适当大小的组织块。

3. 脱水：将组织块依次放入75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中，每个酒精浓度处理1小时。

4. 透明：将组织块放入醇苯中处理5-10分钟，再放入二甲苯I中处理5-10分钟，最后放入二甲苯II中处理5-10分钟。

5. 浸蜡：将组织块放入石蜡I中处理1小时，再放入石蜡II中处理1小时，最后放入石蜡III中处理1小时。

6. 包埋：将浸好蜡的组织块放入包埋模具中，待蜡凝固后取出，修整蜡块。

7. 切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上，切片厚度约为4微米。

8. 摊片：将切片漂浮于摊片机40℃温水上，将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。

9. 脱蜡：将烤干的切片依次放入二甲苯30分钟、无水乙醇10分钟、95%酒精5分钟、90%酒精5分钟、80%酒精中处理。

10. 染色：将脱蜡后的切片进行HE染色或其他染色。

快速石蜡包埋组织切片的制备——煮沸固定切片法一、固定切取大小适宜（厚度<2mm）的组织块，尽快置入装有5~8ml 4%中性甲醛的试管中煮沸1min，然后移入冷水中。

二、脱水（1）将已经煮沸固定的组织快取出，用刀片将其厚度修切至<1.5mm,随即置入盛有5~8ml丙酮的试管中，煮沸2min，然后将丙酮倾弃。

（2）再向该试管中重新加入5~8ml丙酮并煮沸2min。

如此重复3~4次。

三、浸蜡将已经丙酮脱水的组织块由试管中取出，用吸水纸去除其表面液体，随即置入75~80℃熔化的石蜡中，待组织块下沉、不再出现气泡时（约需30S），即可包埋。

四、包埋、切片和染色（1）用热镊子将预制的蜡块表面熔化，埋入已经浸蜡的组织块。

（2）待埋入组织块的蜡块表面凝固后，即用载玻片轻压蜡块表面片刻，使蜡块表面平整。

（3）将蜡块置入冰水中，使其变硬。

（4）迅速切片，裱片后用吸水纸去除载玻片上的水分。

（5）将载玻片用火焰烘干（勿距火焰太近）。

（6）迅速进行HE染色。

五、注意事项（1）为了尽量缩短制片时间，必须预先做好有关准备工作，备齐取材用具、试管、固定液、丙酮、酒精灯、火柴（或其他引火器）、包埋用蜡块、载玻片和染色试剂等，放在固定部位待用。

（2）全部制片过程一般在20~25min内完成。

（3）制片后剩余组织块应做石蜡包埋切片染色，进一步诊断。

（4）含脂肪较多的组织，须经多次丙酮处理。

（5）含脂肪较多的组织，须经多次丙酮处理。

（6）丙酮、乙醇、二甲苯等为易燃物，进行上述各项流程时，2m距离内不得存在明火。

加温脱水和浸蜡过程必须应用隔水温箱，不得使用干烤箱操作。

石蜡包埋组织切片制作过程石蜡包埋组织切片制作是组织学研究中常用的一种技术，它可以将组织样本固定、包埋、切片、染色等一系列步骤完成，以便于观察和分析组织结构和功能。

下面将详细介绍石蜡包埋组织切片制作的过程。

1. 组织固定需要将待研究的组织样本进行固定，以保持其形态和结构。

常用的固定剂有福尔马林、乙醛、甲醛等。

固定时间和温度根据不同的组织类型和固定剂而异，一般需要固定4-24小时。

2. 组织脱水固定后的组织需要进行脱水处理，以去除其中的水分，使其能够与石蜡相容。

脱水一般采用乙醇逐渐升级浓度的方法，如70%、80%、95%、100%乙醇，每个浓度的时间一般为1-2小时。

3. 组织清洁脱水后的组织需要进行清洁处理，以去除其中的脂肪和其他杂质。

清洁一般采用苯、甲苯、氯仿等有机溶剂，每个溶剂的时间一般为1-2小时。

4. 组织浸渍清洁后的组织需要进行浸渍处理，以使其与石蜡相容。

浸渍一般采用苯、甲苯、氯仿等有机溶剂，每个溶剂的时间一般为1-2小时。

5. 组织包埋浸渍后的组织需要进行包埋处理，以使其能够被切片机切割。

包埋一般采用石蜡，将组织样本浸泡在石蜡中，然后在石蜡中进行固化。

固化时间和温度根据不同的组织类型和石蜡而异，一般需要固化4-24小时。

6. 组织切片包埋后的组织需要进行切片处理，以便于观察和分析组织结构和功能。

切片一般采用微型切片机，将石蜡包埋的组织样本切成薄片，厚度一般为4-6微米。

7. 组织染色切片后的组织需要进行染色处理，以便于观察和分析组织结构和功能。

常用的染色剂有血液学染色剂、组织学染色剂等。

染色时间和方法根据不同的染色剂而异，一般需要染色5-30分钟。

石蜡包埋组织切片制作过程是一个复杂的过程，需要进行多个步骤的处理，以保证组织样本的完整性和可观察性。

这种技术在组织学研究中具有重要的应用价值，可以为疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。