miRG205G5p对鼻咽癌细胞系增殖迁移和侵袭的影响及其机制

自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8F 存活、凋亡的影响及其机制韩蜜1，2，龙远雄21 湖南省肿瘤医院药学部，长沙 410013；2 湖南中医药大学第一附属医院科研部摘要：目的　观察自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8F 存活、凋亡的影响，并探讨其机制。

方法　将对数生长期5-8F 细胞分为8组，5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清组分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清，20%空白血清组加入20%不含药血清，对照组细胞正常培养，培养24、48 h ，CCK -8法检测各组细胞存活率。

将对数生长期5-8F 细胞分为4组，低剂量组加入5%鼻咽解毒胶囊含药血清，中剂量组加入20%鼻咽解毒胶囊含药血清，高剂量组加入30%鼻咽解毒胶囊含药血清，阴性组细胞正常培养，培养24 h ，流式细胞术检测细胞凋亡率，RT -qPCR 法检测细胞中K -RAS 、RAF mRNA 相对表达量，Western blot 法检测细胞中K -RAS 、RAF 、p -ERK1/2蛋白相对表达量。

结果　与对照组比较，20%含药血清组、25%含药血清组、30%含药血清组培养24 h 及48 h 的细胞存活率降低（P 均<0.05）；与20%空白血清组比较，25%含药血清组培养48 h 和30%含药血清组培养24、48 h 的细胞存活率降低（P 均<0.05）；与同组24 h 比较，30%含药血清组培养48 h 的细胞存活率降低（P <0.05）。

与阴性组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率升高（P 均<0.05）；与低剂量组比较，中剂量组、高剂量组细胞凋亡率升高（P 均<0.05）；与中剂量组比较，高剂量组细胞凋亡率升高（P <0.05）。

与阴性组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组的K -RAS 、RAF mRNA 相对表达量降低（P 均<0.05）；与低剂量组比较，中剂量组、高剂量组K -RAS 、RAF mRNA 相对表达量降低（P 均<0.05）；与中剂量组比较，高剂量组K -RAS 、RAF mRNA 相对表达量降低（P 均<0.05）。

第 49 卷第 5 期2023年 9 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.5Sep.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230504MiR-491-5p过表达对人鼻咽癌HONE-1细胞增殖和迁移的影响王丹丹1,2, 周宁3, 刘冬芹4, 赵杰1,2, 梁超1,2, 代娟娟2, 武艳1,2（1. 滨州医学院附属医院肿瘤科，山东滨州256600；2. 滨州医学院附属医院医学研究中心，山东滨州256600；3. 滨州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科，山东滨州256600；4. 山东省滨州市人民医院消化内科，山东滨州256600）［摘要］目的目的：探讨微小RNA-491-5p（miR-491-5p）过表达对人鼻咽癌HONE-1细胞增殖和迁移的影响，为研究鼻咽癌的发病机制和靶向治疗提供依据。

方法方法：将人鼻咽癌HONE-1细胞分为对照组（转染对照质粒）和miR-491-5p组（转染miR-491-5p质粒）。

采用荧光显微镜观察2组鼻咽癌HONE-1细胞转染效率，CCK-8法检测2组鼻咽癌HONE-1细胞增殖活性，Transwell小室实验检测2组鼻咽癌HONE-1细胞的迁移细胞数，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测2组鼻咽癌HONE-1细胞中波形蛋白和上皮钙黏素mRNA表达水平，Western blotting法检测2组鼻咽癌HONE-1细胞中波形蛋白和上皮钙黏素蛋白表达水平。

结果结果：与对照组比较，作用24、48和72 h时miR-491-5p组鼻咽癌HONE-1细胞增殖活性（t=2.832，P=0.047 3；t=4.522，P=0.001 4；t=9.308，P<0.01）和迁移细胞数（t=9.639，P<0.01）明显降低；与对照组比较，miR-491-5p组鼻咽癌HONE-1细胞中波形蛋白mRNA（t=7.535，P=0.001 7）和蛋白（t=7.219，P=0.018 7）表达水平明显降低，上皮钙黏素mRNA（t=4.88，P=0.039 5）和蛋白（t=5.754，P=0.028 9）表达水平明显升高。

Garcinone E抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的研究孔晓阳;刘夏;董彩华;夏玉对;卢奕;张健【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2018(45)9【摘要】目的探讨源于岭南山竹的天然产物单体Garcinone E对鼻咽癌细胞增殖、迁移侵袭能力的影响及其分子机制。

方法 MTS法检测鼻咽癌HONE1和HK1细胞的增殖率;Transwell细胞小室检测HONE1和HK1细胞迁移和侵袭的能力;Western blot和q-PCR法检测HONE1和HK1细胞上皮间充质转化(EMT)相关标志性蛋白和基因表达及可能的信号通路。

结果 MTS 24 h结果显示Garcinone E可显著抑制鼻咽癌细胞HONE1和HK1的生长,并和浓度呈正相关作用。

Transwell小室实验显示,与对照组相比,Garcinone E的给药浓度为7.5μmol/L时,HONE1和HK1细胞穿过小室的数量明显减少,其迁移和侵袭能力明显受到抑制。

Western blot检测发现Garcinone E呈剂量依赖性地下调p-Vimentin、Snail及Slug蛋白的表达,同时增加E-cadherin蛋白的表达。

q-PCR表明Garcinone E呈剂量依赖性地上调两种鼻咽癌细胞中E-cadherin的mRNA表达。

结论 Garcinone E能够有效抑制鼻咽癌细胞增殖并抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制鼻咽癌细胞EMT的发生有关。

【总页数】6页(P617-622)【关键词】Garcinone;E;鼻咽癌细胞;上皮间质转化【作者】孔晓阳;刘夏;董彩华;夏玉对;卢奕;张健【作者单位】广西医科大学基础医学院暨转化医学研究中心长寿与老年相关疾病教育部重点实验室;南方科技大学医学院【正文语种】中文【中图分类】R739.6【相关文献】1.KISS1基因激活ERK1/2磷酸化通路抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的研究 [J], 李婷婷;江浩2.沉默YAP1可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力 [J], 周雅青;杨蓉;马刚3.免疫抑制剂FK506对结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及作用机制研究 [J], 姜海波; 李卫; 姜霞; 裴永彬4.敲低Ⅰ型胶原α1链基因抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究 [J], 马永红;同娟5.滋养层细胞表面抗原-2促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的实验研究 [J], 蒋迪;陈顺金;于肖肖;徐志鸿;李刚;黎润球;毛志强;叶贝华;何锦添因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第59卷 第5期2023年10月青岛大学学报(医学版)J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S)V o l .59,N o .5O c t o b e r 2023[收稿日期]2023-02-03; [修订日期]2023-05-25[基金项目]国家自然科学基金资助项目(82072927)[第一作者]彭修法(1995-),男,硕士研究生㊂[通信作者]张春玲(1966-),女,主任医师,硕士生导师㊂E -m a i l :qd z c l 2011@163.c o m ㊂M E T T L 5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制彭修法1,王蕊红2,王晔2,刘凤娟1,张春玲1(青岛大学附属青岛市中心医院,山东青岛 266042 1 呼吸与危重症医学科; 2 检验科)[摘要] 目的 探讨甲基转移酶样蛋白5(M E T T L 5)基因对肺腺癌细胞迁移和侵袭功能的影响及潜在机制㊂方法 使用基因表达数据集(G E O )数据库分析肺腺癌及癌旁组织中M E T T L 5的表达差异,采用W e s t e r nb l o t 方法检测正常肺上皮B E A S -2B 与肺腺癌A 549㊁H 1975细胞系中M E T T L 5蛋白的表达水平㊂应用L V 3-M E T T L 5-s h R N A 慢病毒感染肺腺癌A 549和H 1975细胞系以敲低其M E T T L 5基因表达,W e s t e r nb l o t 法验证沉默效果㊂成功敲低M E T T L 5基因后,通过T r a n s w e l l T M 实验检测两种细胞系迁移㊁侵袭能力,用W e s t e r nb l o t 法检测上皮间质转化(E M T )标记物E -C a d h e r i n ㊁V i m e n t i n 蛋白表达㊂结果 G E O 数据库分析结果显示,肺腺癌组织M E T T L 5的表达显著高于癌旁正常组织,且高表达的病人预后更差㊂M E T T L 5在肺腺癌A 549和H 1975细胞中表达显著高于正常肺上皮B E A S -2B 细胞系㊂敲低M E T T L 5后A 549和H 1975细胞的迁移㊁侵袭能力显著降低,且间质标记物V i m e n t i n 表达显著下调,上皮标记物E -C a d h e r i n 表达显著上调㊂结论 M E T T L 5可能通过促进E M T 过程促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭㊂[关键词] 肺腺癌;蛋白甲基转移酶类;上皮-间质转化;细胞运动[中图分类号] R 734.2;R 329.28 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2023)05-0645-06d o i :10.11712/jm s .2096-5532.2023.59.163[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )][网络出版] h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /37.1517.R.20231128.1537.003;2023-11-30 09:44:17R O L EO F M E T T L 5I N M I G R A T I O N A N DI N V A S I O N O F L U N G A D E N O C A R C I N O M A C E L L SA N D M E C H A N I S M S P E N G X i u f a ,WA N GR u i h o n g ,WA N GY e ,L I UF e n g j u a n ,Z HA N GC h u n l i n g (D e p a r t m e n t o fR e s p i r a t o r y a n dC r i t i c a l C a r eM e d i -c i n e ,T h eA f f i l i a t e dC e n t r a lH o s p i t a l o fQ i n g d a oU n i v e r s i t y ,Q i n gd a o 266042,C h i n a )[A B S T R A C T ] O b je c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e of t h em e t h y l t r a n s f e r a s e -l i k e p r o t e i n5(M E T T L 5)g e n e i n th emi g r a t i o n a n d i n v a s i o no f l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l s a n d t h e p o t e n t i a lm e c h a n i s m s . M e t h o d s M E T T L 5e x p r e s s i o n l e v e l s i n l u n g a d e n o c a r -c i n o m a a n d p a r a c a n c e r o u s t i s s u e sw e r e c o m p a r e d t h r o u g ht h eG e n eE x p r e s s i o n O m n i b u s (G E O )d a t a b a s e .M E T T L 5p r o t e i ne x -p r e s s i o n l e v e l s i n n o r m a l l u n g e p i t h e l i a l c e l l s (B E A S -2B )a n d l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l l i n e s (A 549a n dH 1975)w e r e d e t e r m i n e d b y W e s t e r nb l o t .A 549a n dH 1975c e l l l i n e sw e r e i n f e c t e dw i t h t h eL V 3-M E T T L 5-s h R N Al e n t i v i r u s t ok n o c k d o w n t h e e x pr e s s i o no f t h e M E T T L 5g e n e ,w h i c hw a s v e r i f i e db y W e s t e r nb l o t f o r t h e s i l e n c i n g e f f e c t s .A f t e r s u c c e s s f u l l y k n o c k i n g do w n t h e M E T T L 5g e n e ,t r a n s w e l l a s s a y w a s u s e d t od e t e r m i n e t h em i g r a t i o na n d i n v a s i o na b i l i t i e s o f t h e t w o c e l l l i n e s .T h e e x p r e s s i o no f e p i t h e l i a l -m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o nm a r k e r s (E -C a d h e r i n a n dV i m e n t i n p r o t e i n s )w a sm e a s u r e d b y W e s t e r nb l o t . R e s u l t s T h eG E Oa n a l y-s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o no fM E T T L 5w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n l u n g a d e n o c a r c i n o m a t i s s u e s t h a n i n p a r a c a n c e r o u s t i s s u e s ,a n d p a t i e n t sw i t hh i g h M E T T L 5e x p r e s s i o nh a da s i g n i f i c a n t l yp o o r e r p r o g n o s i s .L u n g a d e n o c a r c i n o m aA 549a n dH 1975c e l l l i n e s h a d s i g n i f i c a n t l y h i g h e rM E T T L 5l e v e l s t h a n t h e n o r m a l l u n g e p i t h e l i a l c e l l l i n eB E A S -2B .A f t e r k n o c k i n g do w n M E T T L 5,A 549a n dH 1975c e l l s s h o w e d s i g n i f i c a n t l y r e d u c e dm i g r a t i o n a n d i n v a s i o n a b i l i t i e s ,s i g n i f i c a n t l y d o w n -r e g u l a t e d e x p r e s s i o n o f t h em e s e n -c h y m a lm a r k e rV i m e n t i n ,a n d s i g n i f i c a n t l y u p -r e g u l a t e de x p r e s s i o no f t h e e p i t h e l i a lm a r k e rE -C a d h e r i n . C o n c l u s i o n M E T T L 5c a n i n c r e a s e t h em i g r a t i o n a n d i n v a s i o n o f l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l s b y p r o m o t i n g t h e p r o c e s s o f e p i t h e l i a l -m e s e n c h ym a l t r a n s i t i o n .[K E Y W O R D S ] a d e n o c a r c i n o m a o f l u n g ;p r o t e i nm e t h y l t r a n s f e r a s e s ;e p i t h e l i a l -m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n ;c e l lm o v e m e n t 2021年的统计数据显示,肺癌位居全球癌症相关死因之首,每年因肺癌死亡的人数达180万,我国每年肺癌新发及死亡病人分别占全球的37.0%和39.8%[1-2]㊂肺癌主要分为非小细胞肺癌(N S C L C )和小细胞肺癌两种类型,其中N S C L C 占总数的85%左右,N S C L C 中又以肺腺癌最常见[3]㊂除常规的放疗㊁化疗以及手术治疗等手段外,近年来靶向及免疫治疗获得长足发展,使肺腺癌病人生存有了明显改善,但晚期病人5年总生存率仍不足20%[4]㊂因此,仍需继续探究肺腺癌发病机制,寻找新的治疗靶点㊂据报道,近来作为研究热点的m 6A 转录后修饰在肿瘤发生发展中发挥重要作用[5-7]㊂我们前646青岛大学学报(医学版)59卷期生物信息学研究发现,m6A相关修饰酶甲基转移酶样蛋白5(M E T T L5)在肺腺癌组织中高表达,并且其表达水平与病人总生存率呈负相关㊂本研究旨在进一步研究M E T T L5在肺腺癌中的可能作用,探讨M E T T L5对肺腺癌细胞迁移㊁侵袭的影响及相关机制,从而为肺腺癌治疗提供新的靶点㊂1材料与方法1.1实验材料肺腺癌A549和H1975细胞系均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库㊂无血清1640培养液(R P M I-1640)购自G i b c o公司;胎牛血清(F B S)购自E x c e l l公司;磷酸盐缓冲液(P B S)购自索莱宝公司;青链霉素混合液㊁2.5g/L胰蛋白酶溶液购自H y c l o n e公司;一步冻存液购自海星公司; 2ˑ蛋白上样缓冲液(2ˑl o a d i n g b u f f e r)㊁电泳转移缓冲液(即转膜液)㊁聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P A G E)缓冲液㊁T B S T缓冲液购自S o l a r b i o公司; 40g/L多聚甲醛固定液㊁结晶紫染液购自碧云天公司;M a t r i g e l基质胶购自美国C o r n i n g公司;A n t i-h u m a n M E T T L5多克隆抗体㊁H R P标记的羊抗兔I g G购自武汉爱博泰克公司;兔抗人E-C a d h e r i n㊁V i m e n t i n㊁G A P D H抗体购自美国C e l lS i g n a l i n g T e c h n o l o g y公司;M E T T L5的干扰慢病毒购自上海吉玛公司㊂1.2实验方法1.2.1生物信息学分析首先在基因表达数据集(G E O)数据库中搜索肺腺癌数据,下载数据集,分析M E T T L5的表达情况㊂利用G E P I A软件根据M E T T L5的表达差异对肺腺癌病人进行生存分析,绘制K a p l a n-M e i e r生存曲线㊂1.2.2细胞培养㊁转染及稳转株筛选 A549及H1975细胞系使用R P M I-1640完全培养液(内含体积分数0.10F B S和体积分数0.01的青链霉素双抗)培养,培养箱条件为37ħ㊁内含体积分数0.05的C O2㊂当细胞汇合度达到90%左右并处于对数生长期时,消化并重悬两种细胞后接种于6孔板中,分别使用C o n t r o l及L V3-M E T T L5-s h R N A干扰慢病毒按照说明书进行转染,分为C o n t r o l组及s h M E T T L5组,72h后通过荧光显微镜观察荧光㊂重新铺板,加入嘌呤霉素使终质量浓度为5m g/L,筛选M E T T L5敲低的稳转株㊂1.2.3W e s t e r nb l o t法检测取经嘌呤霉素筛选后㊁镜下可见荧光的两组细胞,使用蛋白裂解液2ˑl o a d i n g b u f f e r裂解细胞提取蛋白样品,并在95ħ条件下金属浴10m i n使蛋白变性㊂吸取8μL的样品加入上样孔中,140V电泳60m i n,200m A转膜90m i n,用50g/L脱脂牛奶进行封闭㊂1h后以T B S T清洗P V D F膜3次,分别与一抗A n t i-h u m a n M E T T L5多克隆抗体(1ʒ1000)和A n t i-h u m a n G A P D H单克隆抗体(1ʒ2000)室温孵育2h㊂用T B S T清洗3次后将P V D F膜放于H R P标记的A n t i-r a b b i t I g G二抗(1ʒ2000)中孵育1h㊂以T B S T清洗后使用超敏发光液进行显影㊂1.2.4 T r a n s w e l l T M实验检测在检测迁移能力时,将处于对数生长期的C o n t r o l组㊁s h M E T T L5组A549和H1975细胞消化并离心重悬,计数并将细胞密度调至1ˑ108/L,向上室中每孔加入200μL 细胞悬液,并在下室中加入800μL的R P M I-1640 (含体积分数0.20F B S),置于培养箱中培养24h㊂弃上层液体,以P B S清洗2次,用棉签拭去上室内的细胞,将小室置于多聚甲醛固定液中固定20m i n,弃去固定液㊂清洗后将小室置于1g/L结晶紫染液中染色15m i n,再次清洗并晾干,放于显微镜下拍照计数㊂检测侵袭能力时,先将M a t r i g e l基质胶与R P M I-1640培养液以1ʒ20均匀混合后,向上室内每孔加入100μL混合液,置于培养箱中过夜㊂其他条件同迁移能力检测㊂1.3统计学方法采用G r a p hP a dP r i s m8.0.2软件进行统计学分析㊂W e s t e r nb l o t检测所得的平均灰度值比值及T r a n s w e l l T M实验所得的细胞数均以xʃs表示,两组均数比较采用t检验;多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用T u k e y检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1生物信息学分析对提取的G E O数据库数据进行分析,结果显示,肺腺癌组织中M E T T L5的表达显著高于癌旁正常肺组织,差异具有统计学意义(P<0.05)(图1A)㊂使用G E P I A绘制K a p l a n-M e i e r曲线,分析结果显示,M E T T L5表达水平高的病人具有更短的生存期(P<0.05)(图1B)㊂2.2 M E T T L5在肺腺癌细胞系中的表达W e s t e r nb l o t检测结果表明,B E A S-2B㊁A5495期彭修法,等.M E T T L 5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制647及H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平差异具有统计学意义(F =16.53,P <0.05)㊂与B E A S -2B 细胞相比,A 549及H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P <0.05);而A 549细胞和H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平差异无统计学意义(P <0.05)(图2)㊂A :M E T T L 5在肺腺癌组织和癌旁正常组织中的表达;B :M E T T L 5表达与肺腺癌病人生存之间的关系㊂图1 M E T T L 5在肺腺癌组织中表达及其与病人预后关系的生物信息学分析A :3种细胞系中M E T T L 5蛋白表达的W e s t e r nb l o t 检测;B :3种细胞系M E T T L 5蛋白相对表达量比较㊂图2 M E T T L 5在肺腺癌细胞系中的表达2.3 敲低M E T T L 5表达对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响为研究M E T T L 5在肺腺癌细胞中的作用,使用慢病毒敲低A 549及H 1975细胞中M E T T L 5基因(图3A )㊂W e s t e r nb l o t 检测显示,M E T T L 5敲低后s h M E T T L 5组两种细胞M E T T L 5蛋白表达水平较C o n t r o l 组显著下调(t =8.403㊁4.222,P <0.05)(图3B ㊁C )㊂细胞迁移和侵袭实验结果显示,M E T T L 5敲低后s h M E T T L 5组两种细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均较C o n t r o l 组明显减少(t =7.803~14.430,P <0.05),表明M E T T L 5显著促进A 549㊁H 1975细胞的迁移㊁侵袭(图3D~G )㊂2.4 敲低M E T T L 5对肺腺癌细胞V i m e n t i n 和E -C a d h e r i n 表达的影响本文W e s t e r nb l o t 检测结果显示,C o n t r o l 组和s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞V i m e n t i n 蛋白表达差异具有显著性(F =155.40,P <0.05);与C o n t r o l组相比,s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞V i m e n t i n 蛋白表达水平显著降低(P <0.05)㊂C o n t r o l 组和s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞E -C a d h e r i n 蛋白表达差异具有显著性(F =73.75,P <0.05);与C o n -t r o l 组相比较,s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞的E -C a d h e r i n 蛋白表达显著升高(P <0.05)㊂见图4㊂3 讨 论近年来随着肺癌筛查手段㊁靶向及免疫治疗的不断进步,肺癌病人的生存不断改善,但肺癌病人死亡数仍高居恶性肿瘤死亡数之首,且转移和复发的肺癌病人预后更差[8-9]㊂到目前为止,手术仍然是根治早期肺癌的唯一方法[10]㊂随着分子生物学及靶向治疗的发展,针对k i r s t e n 大鼠肉瘤病毒原癌基因(K r a s )㊁表皮生长因子受体(E G F R )㊁间变性淋巴瘤激酶(A L K )㊁c -r o s 肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(R O S 1)等靶点突变及程序性死亡受体1(P D -1)/程648青岛大学学报(医学版)59卷A:慢病毒转染后荧光效果图;B:A549和H1975细胞的M E T T L5蛋白表达;C:慢病毒转染后各组细胞M E T T L5蛋白相对表达量;D: T r a n s w e l l T M迁移实验用于验证两种肺腺癌细胞(A549㊁H1975)的迁移能力(结晶紫染色);E:A549和H1975细胞迁移能力的半定量分析;F: T r a n s w e l l T M侵袭实验用于验证两种肺腺癌细胞(A549和H1975)的侵袭能力(结晶紫染色);G:A549和H1975细胞侵袭能力的半定量分析㊂图3敲低M E T T L5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响A:各组两种细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n蛋白表达的W e s t e r nb l o t检测;B:各组两种细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n蛋白相对表达量比较㊂图4敲低M E T T L5对各组肺腺癌细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n表达的影响5期彭修法,等.M E T T L5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制649序性死亡受体-配体1(P D-L1)通路的新型靶向药物层出不穷,肺癌的治疗取得了长足进步[11-14]㊂但肺腺癌的靶向治疗仍处于发展阶段,因此寻找肺腺癌治疗的新靶点具有重要意义㊂m6A R N A甲基化作为一种表观遗传修饰方式,是真核生物中最丰富的R N A修饰[15]㊂该修饰早在20世纪70年代就被发现,但其确切功能和调控机制在很大程度上仍然不清楚[6]㊂研究发现, m6A修饰在各种R N A中均丰富而保守,表明它能够广泛调控基因表达[16-17]㊂随着研究的深入,m6A 修饰在肺腺癌进展中的作用及机制也逐渐被揭示㊂Y I N等[18]发现,线粒体R N A核糖核酸内切R N A 组分(R M R P)在N S C L C中高表达,M E T T L3通过提高R M R P R N A的m6A水平增强其稳定性,通过调节转化生长因子β受体1(T G F B R1)/S MA D 蛋白2(S MA D2)/S MA D蛋白3(S MA D3)途径促进N S C L C进展㊂因此,识别m6A相关基因㊁阐明它们在肺腺癌发生发展中的作用及调控机制对于肺腺癌治疗至关重要㊂M E T T L5是m6A甲基转移酶家族中新发现的一个成员,与其他家族成员参与m R N A甲基化修饰不同,M E T T L5可以与t R N A甲基转移酶112 (T R MT112)结合形成异二聚体以获得代谢稳定性,负责18S r R N A1832位腺苷甲基化[19]㊂R O N G 等[20]应用公开数据库及乳癌样本分析M E T T L5表达与乳癌病人生存之间的关系,结果显示乳癌病人M E T T L5高表达与较差的生存之间存在显著相关性㊂M E T T L5基因敲除的乳癌细胞中多聚核糖体形成减少,细胞整体翻译能力减弱,细胞周期发生停滞,细胞凋亡增加,表明M E T T L5可促进乳癌细胞生长㊂HU A N G等[21]研究发现,M E T T L5可通过调节c-M y c水平提高胰腺癌细胞迁移㊁侵袭能力从而促进胰腺癌恶性进展㊂P E N G等[22]的研究表明, M E T T L5通过靶向酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(A C S L4)促进肝细胞肝癌(H C C)细胞从头脂肪生成并导致游离脂肪酸水平增加,使H C C细胞发生代谢重编程而促进H C C进展㊂然而,M E T T L5在肺腺癌中发挥的作用仍不清楚㊂我们在前期生物信息学分析中,通过对T C G A数据库中肺腺癌的差异表达m R N A进行分析,筛选出与肿瘤分期相关枢纽基因M E T T L5,首次发现M E T T L5在肺腺癌组织中高表达并与肺腺癌病人的不良预后显著相关㊂本研究结果显示,M E T T L5在肺腺癌细胞系中的表达水平明显高于正常肺上皮B E A S-2B细胞系,提示M E T T L5在肺腺癌中发挥促癌作用㊂为进一步探究M E T T L5在肺腺癌中的作用,本研究使用s h M E T T L5慢病毒转染肺腺癌A549和H1975细胞系,检测肺腺癌细胞的行为㊂体外细胞实验结果显示,转染s h M E T T L5的肺腺癌细胞迁移㊁侵袭能力显著降低,表明敲低M E T T L5基因能明显抑制肺腺癌的进展㊂E MT过程与癌症进展密切相关,E MT发生时上皮细胞形态改变,细胞间连接消失,细胞失去极性转变为具有转移和侵袭能力的间质细胞,促进肿瘤的转移与复发并使肿瘤细胞表现出明显的治疗抗性[23-24]㊂E MT过程中细胞发生了特征性的分子变化,具体表现为上皮标记物E-C a d h e r i n表达降低,间质标记物V i m e n t i n表达上调[25-26]㊂本文研究结果显示,敲低M E T T L5基因表达能够显著抑制肺腺癌细胞的E MT,表明M E T T L5通过促进肺腺癌细胞E MT进程促进肺腺癌进展㊂在后续研究中我们将探讨M E T T L5促进肺腺癌细胞E MT进程的具体分子机制㊂综上所述,M E T T L5在肺腺癌中高表达,其表达水平与病人预后呈明显负相关;敲低M E T T L5基因表达可显著抑制肺腺癌细胞迁移㊁侵袭,其机制可能是M E T T L5促进肺腺癌细胞E MT进程㊂本研究结果表明,M E T T L5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用㊂因此,M E T T L5有望成为肺腺癌治疗的潜在靶点及评估肺腺癌发生发展的重要标志物㊂[参考文献][1]S U N G H,F E R L A YJ,S I E G E LRL,e t a l.G l o b a l c a n c e r s t a-t i s t i c s2020:G L O B O C A Ne s t i m a t e s o f i n c i d e n c e a n dm o r t a l i t yw o r l d w i d e f o r36c a n c e r s i n185c o u n t r i e s[J].C A:aC a n c e r J o u r n a l f o rC l i n i c i a n s,2021,71(3):209-249.[2]S I E G E L R L,M I L L E R K D,J E MA L A.C a n c e rs t a t i s t i c s,2016[J].C A:AC a n c e r J o u r n a l f o rC l i n i c i a n s,2016,66(1):7-30.[3]S U C C O N YL,R A S S LD M,B A R K E R AP,e t a l.A d e n o c a r-c i n o m a s p e c t r u ml e s i o n s o f t h e l u n g:de t e c t i o n,p a t h o l o g y a n dt r e a t m e n ts t r a t e g i e s[J].C a n c e r T r e a t m e n tR e v i e w s,2021, 99:102237.[4]Y IM,Z H E N GXL,N I U M K,e t a l.C o m b i n a t i o n s t r a t e g i e sw i t hP D-1/P D-L1b l o c k a d e:c u r r e n t a d v a n c e s a n d f u t u r e d i r e c-t i o n s[J].M o l e c u l a rC a n c e 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《microRNA-585-5p在胃癌恶性生物学行为中的作用与分子机制研究》一、引言胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、预后差，严重威胁着人类的生命健康。

近年来，随着分子生物学和基因组学研究的深入，microRNA（miRNA）在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到关注。

其中，microRNA-585-5p（miR-585-5p）作为一种重要的调控因子，在胃癌的恶性生物学行为中扮演着重要角色。

本文旨在探讨miR-585-5p在胃癌恶性生物学行为中的作用及其分子机制，以期为胃癌的预防和治疗提供新的思路。

二、研究背景与意义microRNA是一类内源性的非编码小RNA，通过调控靶基因的表达参与多种生物过程。

miR-585-5p作为microRNA家族的一员，近年来在胃癌等恶性肿瘤中的研究逐渐增多。

然而，miR-585-5p在胃癌中的具体作用及其分子机制尚不完全清楚。

因此，深入研究miR-585-5p在胃癌恶性生物学行为中的作用与分子机制，对于揭示胃癌的发生发展机制、寻找新的治疗靶点具有重要意义。

三、材料与方法本研究采用细胞实验、动物实验及生物信息学分析等方法，以胃癌组织及配对正常胃组织为研究对象。

首先，通过生物信息学分析预测miR-585-5p的靶基因；其次，利用细胞实验和动物实验验证miR-585-5p对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响；最后，通过分子生物学技术探讨miR-585-5p的分子机制。

四、实验结果1. 生物信息学分析结果显示，miR-585-5p可能通过调控多个靶基因影响胃癌细胞的恶性生物学行为。

2. 细胞实验和动物实验表明，过表达miR-585-5p可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而抑制miR-585-5p的表达则可抑制这些恶性生物学行为。

3. 分子生物学技术揭示了miR-585-5p的分子机制。

miR-585-5p通过调控靶基因的表达，影响细胞周期、凋亡、侵袭等相关信号通路的活性，从而影响胃癌细胞的恶性生物学行为。

《miR-10a-5p通过靶向RORA促进胃癌细胞侵袭、迁移的研究》摘要：本文探讨了miR-10a-5p在胃癌细胞中的表达及其对细胞侵袭和迁移的促进作用。

通过实验研究发现，miR-10a-5p通过靶向RORA基因，在胃癌细胞中发挥重要的调控作用。

本文详细介绍了研究背景、目的、方法、结果和讨论，为胃癌的发病机制及治疗提供了新的思路。

一、引言胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率均较高。

近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究表明，microRNA（miRNA）在胃癌的发生、发展过程中起着重要作用。

miR-10a-5p作为一种重要的miRNA，其在胃癌细胞中的表达及其作用机制尚不清楚。

因此，本研究旨在探讨miR-10a-5p对胃癌细胞侵袭、迁移的影响及其作用机制。

二、材料与方法1. 材料本实验所使用的胃癌细胞株、RORA基因敲除细胞株及其他相关试剂均购自公共生物资源库。

2. 方法（1）细胞培养与处理：采用胃癌细胞株进行实验，通过转染技术使细胞过表达或低表达miR-10a-5p。

（2）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）：检测miR-10a-5p及RORA基因的表达水平。

（3）细胞侵袭和迁移实验：采用Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移能力。

（4）双荧光素酶报告实验：验证miR-10a-5p与RORA基因的靶向关系。

（5）统计学分析：采用SPSS软件进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

三、结果1. miR-10a-5p在胃癌组织中的表达情况通过RT-qPCR实验发现，与正常胃黏膜组织相比，胃癌组织中miR-10a-5p的表达水平显著升高。

2. miR-10a-5p对胃癌细胞侵袭、迁移的影响过表达miR-10a-5p的胃癌细胞，其侵袭和迁移能力明显增强；而低表达miR-10a-5p的胃癌细胞，其侵袭和迁移能力受到抑制。

3. miR-10a-5p与RORA基因的靶向关系双荧光素酶报告实验结果显示，miR-10a-5p可以与RORA基因的3'UTR区域结合，从而抑制RORA基因的表达。

过表达miR -515-5p 的视网膜母细胞瘤细胞增殖、凋亡、侵袭能力变化及其机制鲍慧婧，刘萍，杜允宏，刘文静，马义宾青岛大学附属泰安市中心医院眼科，山东泰安271000摘要：目的　探讨过表达miR -515-5p 对视网膜母细胞瘤细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响及其机制。

方法　利用StarBase 数据库进行生物信息学分析并预测miR -515-5p 的靶基因为CBX4，并经双荧光素酶报告基因实验验证。

选择视网膜母细胞瘤细胞系SO -RB50、Y79、HXO -RB -44细胞中miR -515-5p 表达降低最明显的SO -RB50细胞进行实验，分为miR -515-5p NC 组、miR -515-5p mimics 组、miR -515-5p mimics+CBX4组、miR -515-5p mimics+CBX4-NC 组，分别转染miR -515-5p 阴性对照、miR -515-5p mimics 、miR -515-5p mimics+CBX4过表达载体、miR -515-5p mimics+CBX4空载体。

采用实时荧光定量PCR 法检测各组miR -515-5p 及CBX4 mRNA 表达，Western blotting 法检测CBX4蛋白表达，CCK -8法检测转染12、24、48、72 h 的细胞增殖能力（OD 值），TUNEL 法检测细胞凋亡率，Transwell 小室实验检测细胞侵袭能力。

结果　miR -515-5p mimics 组、miR -515-5p mimics+CBX4组、miR -515-5p mimics+CBX4-NC 组miR -515-5p 相对表达量均高于miR -515-5p NC 组（P 均<0.05）。

miR -515-5p mimics 组、miR -515-5p mimics+CBX4-NC 组、miR -515-5p mimics+CBX4组CBX4 mRNA 相对表达量及培养48、72 h 的OD 值均低于miR -515-5p NC 组，且miR -515-5p mimics 组、miR -515-5p mimics+CBX4-NC 组降低更明显（P 均<0.05）。

鼻咽癌的检测指标鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma , NPC是我国最常见的头颈部恶性肿瘤，其发病机制不十分明确，与其他肿瘤一样，鼻咽癌的发生是一个多因素、多阶段、多步骤的复杂过程，它与病毒、环境因素紧密相关，也与生物遗传、化学、物理因素有密切关系。

鼻咽癌相关基因的研究被认为是可以揭开鼻咽癌发生、发展秘密的钥匙，基因药物也有希望成为鼻咽癌治疗的有效方法之一，所以鼻咽癌相关基因的研究一直就是基因研究的热点。

笔者就鼻咽癌几个重要的相关基因Bcl-2 、LMP-1 p53、nm23-H1 p16,简要综述如下。

1Bcl-2 基因家族目前已发现的Bcl-2 基因家族成员至少有16 个，按功能分为两类，一类是抑制细胞凋亡的：如Bcl-2 、Bcl-xL 、Bcl-w 、Bfl-1 、Bag-1 、mcl-1 等；另一类是促进细胞凋亡的：如Bcl-G、mtd、Bax、Bcl-xS 、Bad、Bak、Bid、Bik 、Blk 、hrk 等。

Bcl-2 基因家族成员众多，与鼻咽癌密切相关的并且研究较多的有Bcl-2 、Bax 和Bcl-xL 。

Bcl-2 基因是迄今研究最深入的凋亡调控基因之一，Bcl-2 基因位于18 号染色体上，含有3 个外显子和2 个内含子。

Bcl-2 蛋白的高表达与特异性的t(14;18)(q24;q21) 染色体易位有关。

许多实验表明，Bcl- 2 基因主要抑制细胞凋亡和延长细胞寿命。

目前认为Bcl-2 抗凋亡作用的可能机制有以下几种1：作为细胞器的膜稳定蛋白，保护质膜不受过氧化物损伤；抑制正在发生凋亡的细胞内质网中Ca2啲释放，改变细胞器的Ca2+以抑制凋亡；拮抗凋亡促进基因Bax,抑制和阻止细胞色素C对caspase-3的活化；调节p53蛋白、细胞周期调控蛋白等蛋白延缓细胞凋亡。

Bax含有6个外显子，编码三种蛋白质：Bax- a、Bax- B、Bax- Y。

Bcl-2和Bax 序列有45滋勺同源性，在体内Bax可形成同源二聚体Bax/Bax，当Bcl-2高表达时，可与Bax竞争，形成Bax/Bcl-2异源二聚体。

《microRNA-585-5p在胃癌恶性生物学行为中的作用与分子机制研究》一、引言胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制复杂，涉及多种基因和分子机制的交互作用。

近年来，microRNA（miRNA）在胃癌发生、发展及恶性转化过程中的作用逐渐受到关注。

其中，microRNA-585-5p（miR-585-5p）作为一种重要的调控分子，在胃癌的恶性生物学行为中扮演着关键角色。

本文旨在探讨miR-585-5p在胃癌恶性生物学行为中的作用及其分子机制。

二、研究背景miRNA是一类内源性的、非编码的小分子RNA，通过与靶基因mRNA的3'非翻译区（UTR）结合，调控基因的表达。

miR-585-5p作为一种新型的miRNA，其在胃癌中的表达水平及生物学功能尚不清楚。

研究表明，miR-585-5p的异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关。

因此，研究miR-585-5p在胃癌恶性生物学行为中的作用及分子机制，对于揭示胃癌的发病机制、诊断及治疗具有重要意义。

三、研究方法本研究采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测胃癌组织及配对正常胃黏膜组织中miR-585-5p的表达水平。

通过细胞培养、转染等技术，探究miR-585-5p对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响。

同时，利用生物信息学方法预测miR-585-5p的靶基因，并通过双荧光素酶报告实验验证靶基因的准确性。

最后，通过western blot、免疫组化等手段检测靶基因在胃癌组织中的表达情况。

四、实验结果1. miR-585-5p在胃癌组织中的表达水平显著低于配对正常胃黏膜组织。

2. 过表达miR-585-5p能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

3. 通过生物信息学方法预测及双荧光素酶报告实验验证，确定了miR-585-5p的靶基因为XXX（具体靶基因需根据实验结果填写）。

4. 在胃癌组织中，XXX基因的表达水平与miR-585-5p的表达水平呈负相关。