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应用荧光RT-PCR检测亚欧型口蹄疫病毒查成刚;吴绍强;林样梅;韩雪清;刘建;贾广乐;梅琳【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2009(26)1【摘要】根据口蹄疫病毒基因组的5' 非翻译区序列比较保守的特点,采用软件设计亚欧型(A、O、C及Asia-1型)FMDV通用的引物和探针,经对反应条件和反应体系进行优化,建立了亚欧型FMDV的实时荧光RT-PCR检测方法.研究表明,该方法检测阳性质粒模板的线性范围为1.9×107-1.9×10拷贝,最低可检测19个拷贝.通过对FMDV各血清型(A、O、C、Asia-1及SAT-1,2,3型)的检测,证实该方法对亚欧型FMDV具有良好的特异性,能有效区分亚欧型和南非型FMDV感染.本研究为亚欧型口蹄疫的快速诊断和流行病学调查提供了新的方法.【总页数】3页(P28-30)【作者】查成刚;吴绍强;林样梅;韩雪清;刘建;贾广乐;梅琳【作者单位】南京农业大学动物医学学院,江苏,南京,210095;中国检验检疫科学研究院,北京,朝阳,100029;中国检验检疫科学研究院,北京,朝阳,100029;中国检验检疫科学研究院,北京,朝阳,100029;中国检验检疫科学研究院,北京,朝阳,100029;中国检验检疫科学研究院,北京,朝阳,100029;中国检验检疫科学研究院,北京,朝阳,100029;中国检验检疫科学研究院,北京,朝阳,100029【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.亚欧型及南非型口蹄疫一步法多重荧光RT-PCR检测方法建立 [J], 吴绍强;查成刚;邓俊花;林祥梅;刘建;梅琳2.应用改良的实时TaqMan荧光定量 RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平 [J], 石立立;顾潮江;张倩;张玮莹;李勇;鲁彬;何成;屈三甫;郑从义3.应用荧光RT-PCR技术检测口蹄疫病毒 [J], 罗长保;鱼海琼;林志雄4.口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立 [J], 谢彩华;王淑娟;班付国;闫若潜;王东方;张煜;刘梅芬;赵雪丽;马震原;王华俊5.通用型和O型口蹄疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 王淑娟;闫若潜;王东方;刘影;杨海波;赵胜杰;曹伟伟;王翠;赵雪丽;马震原因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了鉴定湖北省某猪场水疱性疾病的病原，本研究采用RT-PCR 、细胞分离培养、间接免疫荧光检测、电镜观察、病毒基因序列测定及分子进化分析的方法对湖北省某猪场采集的具有水疱样病变的猪水疱皮样品进行了病毒的分离和鉴定及全基因组序列的测定。
结果表明：成功分离到1株A 型塞内卡病毒（SVA ），命名为HBWH/1/2018株。
该毒株接种BHK-21细胞培养能够引起明显的致细胞病变效应；免疫荧光试验结果为阳性；病毒滴度为109.35 TCID 50/0.1mL ；该毒株基因组全长7281 bp （不包括Poly A ），开放阅读框为6546 bp ，编码2181个氨基酸；VP1核苷酸序列的遗传进化分析表明HBWH/1/2018株与HN01/2017株亲缘关系最近（相似性高达99.4%）, 而与SV A 原型毒株SVV-001株的亲缘关系最远（相似性为91.3%）。
本研究不仅丰富了SV A 的分子流行病学数据，也为进一步研究SV A 的致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础。
关键词：塞内卡病毒；分离鉴定；进化分析中图分类号： S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）01-0146-07Isolation and Complete Genome Sequencing of Senecavirus A Strain HBWH/1/2018收稿日期：2020-07-24基金项目：甘肃省自然科学基金项目（20JR10RA019）；甘肃省猪鸡产业体系猪病防治与健康养猪课题；2020年度所级统筹基本科研业务费项目（1610312020007）；生猪健康养殖疫病防控及生物安全技术集成试验示范项目（20201007-2）作者简介：马雪青，女，博士，助理研究员，主要从事重要动物病毒生物学和免疫学研究通信作者：孙普，E-mail：*************；卢曾军，E-mail：*****************；刘在新，E-mail：*****************Ａ型塞内卡病毒HBWH/1/2018株的分离鉴定及全基因组序列测定马雪青1，祁光宇2，李平花1，付元芳1，白兴文1，包慧芳1，孙 普1，卢曾军1，刘在新1（1.中国农业科学院兰州兽医研究所 动物疫病防控全国重点实验室 国家口蹄疫参考实验室，兰州 730046；2.中农威特生物科技股份有限公司，兰州 730000）2023,31(1):146-152Abstract: To identify the etiological agent of swine vesicular disease that broke out in Hubei province, virus isolation was performed for blister skin samples of pigs. The virus isolate obtained was identifi ed to be Senecavirus (SVA) by RT-PCR, cell culture, indirect immunofl uorescence assay, electron microscopy, nucleotide sequencing and molecular evolution analysis, and was designated as HBWH/1/2018 strain. The HBWH/1/2018 strain produced CPE in BHK-21 cells and the virus titer reached 109.35 TCID 50/0.1 mL.The HBWH/1/2018 strain was 7281 bp (excluding PolyA) in length, which contained an open reading frame of 6546 bp encodingMA Xueqing 1, QI Guangyu 2, LI Pinghua 1, FU Yuanfang 1, BAI Xingwen 1, BAO Huifang 1, SUN Pu 1,LU Zengjun 1, LIU Zaixin 1(1. State key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention, National Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, CAAS, Lanzhou 730046, China; 2. China Agricultural Vet. Bio. Science and Technology CO., LTD.,Lanzhou 730000, China)· 147 ·马雪青等：Ａ型塞内卡病毒HBWH/1/2018株的分离鉴定及全基因组序列测定第31卷第1期Ａ型塞内卡病毒（Senecavirus A, SVA）是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，是小RNA病毒科（Picornaviridae）塞内卡病毒属（Senecavirus ）的唯一成员[1-2]。
荧光定量RT-PCR法检测门头沟区手足口病病原体探讨刘海涛;庄国良;王志越;吕秋艳;宋景红【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2012(33)1【摘要】目的明确门头沟区手足口病流行期间手足口病患儿病毒感染类型,并探讨实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法对手足口病患儿咽拭子标本中肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A 16型(Cox A16)病毒载量进行定量检测的可行性.方法采用RT-PCR荧光探针体外扩增法对103例手足口病患儿咽拭子标本中抽提的RNA进行抽样检测.结果 58例手足口病患儿咽拭子标本中EV71的病毒载量＞103copies/mL.实时荧光定量RT-PCR法其标准曲线显示,样本阈值环数(threshold cycle,Ct)值与病毒拷贝数的对数之间的相关系数为1.000,相关性较好.32例手足口病患儿咽拭子标本中Cox A16的病毒载量＞103copies/mL.实时荧光定量RT-PCR法其标准曲线显示,Ct值与病毒拷贝数的对数之间的相关系数为0.977,相关性较好.结论门头沟区56.3%手足口病患儿EV71病毒载量＞103copies/mL,31.1%患儿Cox A16病毒载量＞103copies/mL.实时荧光定量RT-PCR法对咽拭子标本中的EV71、CoxA16 RNA定量检测较方便快捷,为进一步研究病毒载量与临床表现之间的关系打下基础.%Objective To identify the viral infection types of the children with hand - foot -mouth disease in Mentougou district and to develop real - time fluorescenee quantitative reverse transcription - polymerase chain reaction ( RT - PCR ) for detection of EV71 and Cox A16. Methods RNA was extracted from the throat swab of the children with hand - foot - mouthdisease. The extracted RNA was tested by real -time fluorescence quantitative RT - PCR. Results The EV71 viral load of 58 samples exceeded 103 copies/mL. The standard curve of the real - time fluorescence quantitative RT -PCR showed good correlation coefficient( r = 1.000 ) between the cycle threshold values and logarithm of the viral copy number. The Cox A16 viral load of 32 samples exceeded 103copies/mL. The standard curve of the real - time fluorescence quantitative RT - PCR showed good correlation coefficient ( r = 0. 977 ) between the cycle threshold values and logarithm of the viral copy number. Conclusion In this study, 56. 3% of the children with hand - foot - mouth disease were caused by EV71,31. 1% of the children with hand - foot - mouth disease were caused by Cox A16 in Mentougou District. Real - time fluorescence quantitative RT -PCR offers a rapid and simple method to detect EV71 or Cox A16 from specimens,andallow to analyze the associations of the clinical symptoms and virus load.【总页数】3页(P62-64)【作者】刘海涛;庄国良;王志越;吕秋艳;宋景红【作者单位】北京市门头沟区疾病预防控制中心微生物检验科,北京,门头沟,102300;北京市门头沟区疾病预防控制中心微生物检验科,北京,门头沟,102300;北京市门头沟区疾病预防控制中心微生物检验科,北京,门头沟,102300;北京市门头沟区疾病预防控制中心微生物检验科,北京,门头沟,102300;北京市门头沟区疾病预防控制中心微生物检验科,北京,门头沟,102300【正文语种】中文【中图分类】R373.23【相关文献】1.多重荧光RT-PCR快速检测手足口病病原体的结果分析 [J], 沈伟锋;邵平扬;殷新光;邹洪兴;吕青山;杨清萍2.实时荧光定量RT-PCR法检测安徽宿州市手足口病病原体结果分析 [J], 胡雪影;张玲3.RT-PCR检测手足口病病原体EV71 [J], 王松;许诚;张红梅;刘勇军;刘威龙;徐六妹;谭艳;谢靖婧;陈心春4.实时荧光定量RT-PCR法检测手足口病患儿大便标本中肠道病毒71型 [J], 刘丽艳;叶颖子;王建设;俞蕙;朱启殚5.EV71与Cox A16病原体RT-PCR检测在预防手足口病传播中的意义 [J], 黄淑芬;戴晓帆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
实时荧光RT-PCR检测手足口病病毒核酸的临床应用价值【摘要】目的探讨实时荧光RT-PCR检测手足口病病毒核酸的临床应用价值。
方法采集县中医院2015年 3月-2016年3月收治的疑似手足口病患儿的咽拭子或疱疹液或粪便标本，共采集标本200份，从标本中提取病毒RNA，并采用实时荧光RT-PCR法进行检测，分析检测结果。
结果本组200份标本经实时荧光RT-PCR检测共检出阳性标本178份，阳性率为89.0%，阴性22份。
阳性标本中CoXA16病毒占比72.5%，EV71病毒占比19.7%，其他肠道病毒占比7.3%。
2015年 3月-2016年3月期间本地手足口病毒以CoXA16型为主。
结论实时荧光RT-PCR检测技术在手足口病病毒核酸检测中具有操作简单、快速、灵敏度高的优势，可作为手足口病早期诊断的首选检测方法。
【关键词】实时荧光RT-PCR；手足口病；病毒核酸[Abstract] objective to investigate the clinical application value of hft-pcr in real-time fluorescence rt-pcr. Methods to collect county hospital in March 2015 - March 2016 suspected children with hand，foot and mouth disease in our hospital pharyngeal swab or herpes fluid or stool specimens，a total of 200 samples，the viral RNA extracted from the specimen，and USES the real-time fluorescent rt-pcr method for detection and analysis of test results. Results the samples of 200 specimens were tested positive for 178，and the positive rate was 89.0% and negative 22. The CoXA16 virus accounted for 72.5 percent of the positive specimens，and theEV71 virus accounted for 19.7 percent，while the other enteroviruses accounted for 7.3 percent. From March 2015 to March 2016，the local HFMD virus was dominated by CoXA16. Conclusionreal-time fluorescent rt-pcr detection technique in the hand，foot and mouth disease virus nucleic acid detection has the advantages of simple operation，rapid，high sensitivity，and can be usedas early diagnostic method of choice for hand，foot and mouth disease.[Keywords] real-time fluorescent rt-pcr；Hand，foot and mouth disease；The virus nucleic acid手足口病是临床常见传染性疾病，该病由多种肠道病毒及其他微生物感染引起，是儿童常见疾病。
多重荧光RT-PCR同时检测口蹄疫O A AsiaⅠ三种血清型邱杨;肖性龙;赵丽;刘建丽;余以刚;吴晖【摘要】口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是一种动物烈性传染病,被OIE 列为A类家畜传染病之首.根据O、AsiaⅠ、A三种血清型FMDV的保守基因序列,设计特异性引物和以不同荧光素标记的 Taq Man探针.通过对 PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了检测O、AsiaⅠ、A三种血清型FMDV的多重荧光RT-PCR检测方法.结果表明,该方法有效、特异、敏感,对于口蹄疫病毒的诊断和疫苗的使用具有重要意义.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2010(046)006【总页数】3页(P9-11)【关键词】口蹄疫病毒;多重荧光PCR;检测【作者】邱杨;肖性龙;赵丽;刘建丽;余以刚;吴晖【作者单位】东莞出入境检验检疫局,广东,东莞,523072;华南理工大学轻工与食品学院,广东,广州,510640;深圳太太基因工程有限公司,广东,深圳,518057;东莞出入境检验检疫局,广东,东莞,523072;东莞出入境检验检疫局,广东,东莞,523072;华南理工大学轻工与食品学院,广东,广州,510640;华南理工大学轻工与食品学院,广东,广州,510640【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.6口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,对偶蹄兽有重大危害。
口蹄疫病毒共有7个血清型,各个血清型的病毒之间不能产生交叉免疫。
因此,口蹄疫病毒快速准确的分型是口蹄疫诊断的重要内容,可为疫苗的选择和流行病学研究提供有价值的信息。
目前我国主要受周边国家和地区O、AsiaⅠ、A三种血清型病毒的威胁,本试验建立了多重荧光 RTPCR方法用于区分上述3种血清型FMDV。
相比于常规的诊断方法,PCR检测具有准确直接的优点,对于口蹄疫病毒的快速定型具有重要意义。
荧光定量pcr检测步骤嘿，朋友们！今天咱就来唠唠荧光定量PCR 检测步骤这档子事儿。
你想想看啊，这就好比一场奇妙的旅程。
首先呢，咱得把要检测的样本准备好，这就像是给旅程准备行囊，可不能马虎呀！样本得纯净，不能有杂七杂八的东西捣乱。
然后呢，就是设计引物啦！这引物就像是旅程中的指南针，得特别精准，才能指引我们往正确的方向走。
设计得不好，那可就容易迷路啦，检测结果也会乱七八糟的。
接下来，就是配制反应体系啦！各种试剂就像旅途中的伙伴，得搭配好，让它们和谐共处，共同发挥作用。
这可不是随便倒倒就行的，得精确再精确。
再之后，把样本和反应体系混合好，放进PCR 仪里。
这PCR 仪啊，就像是旅程中的交通工具，带着我们的样本和反应体系一路前行。
在这个过程中，温度会不断变化，就像车子在不同的路况下行驶一样。
在 PCR 仪里跑了一段时间后，就到了检测荧光信号的时候啦！这荧光信号就像是旅途中的美景，我们得仔细观察，不能错过任何一个精彩瞬间。
嘿，你说这荧光定量 PCR 检测是不是很有意思？就像一次充满挑战和惊喜的冒险！每一步都得小心翼翼，却又充满期待。
要是哪一步出了差错，那可就前功尽弃啦！所以啊，做这个检测的时候，可得打起十二分的精神来。
就像你去旅行，总不能稀里糊涂的吧！得认真准备，认真对待每一个环节。
你想想，如果因为自己的不小心，导致检测结果不准确，那得多郁闷呀！这可关系到很多重要的事情呢，比如疾病的诊断、科学研究的进展。
哎呀，说了这么多，相信你对荧光定量 PCR 检测步骤也有了一定的了解啦！总之，认真对待，就像对待生活中的每一件重要事情一样，准没错！希望大家都能在这个奇妙的检测世界里顺利前行，得到准确又可靠的结果哟！。
手足口病的PCR检测对于手足口病的准确和迅速的诊断以及疾病的控制和治疗非常重要。
在手足口病的诊断中，聚合酶链反应（PCR）技术发挥着关键作用。
PCR技术通过检测病毒的核酸序列，可以准确、敏感地确定手足口病的存在与否，并区分不同的病毒血清型。
目前，我国对手足口病进行检测，通常采用聚合酶链式（PCR)结合Taqman荧光探针技术，对人粪便和咽拭子样本中C4亚型EV71型、CA16型及其他型（如CA2、4、5、、7、9、10、和CB1、2、3、4、5等）肠道病毒鉴别检测。
一、我国手足口病原谱现状在我国手足口病（HFMD）的致病血清型包括柯萨奇病毒（Coxsackievirus, CV)A组4~7、9、10、16型和B组1~3、5型，埃可病毒(Echovirus)的部分血清型和肠道病毒71型（Enterovirus A71, EV-A71)等，其中以CV-A16和EV-A71最为常见，重症及死亡病例多由EV-A71所致。
不同时期和地区的HFMD病原谱可能存在差异，这部分是由于肠道病毒的流行规律，另一部分可能受到近年EV71疫苗应用的影响。
在过去的20年中，HFMD在亚太地区频繁爆发，严重影响儿童的生命健康。
曾经，肠道病毒71型是导致HFMD危重症和死亡的主要病原体。
然而，随着肠道病毒的不断变化，非EV71等其他肠道病毒引起的HFMD的比例显著增加。
这意味着HFMD的病原谱正在发生变化，除EV71外的其他肠道病毒也开始成为引起HFMD的重要病原体。
这一变化可能对疫苗的研发和防控策略产生影响，需要进一步的研究和监测来了解病原谱的动态变化，以便更好地应对HFMD的流行和控制。
二、手足口病PCR检测的原理手足口病PCR检测是一种基于聚合酶链反应（PCR）技术的分子诊断方法，旨在检测手足口病毒的核酸序列。
该方法通过扩增病毒的特定DNA或RNA片段，从而实现对手足口病毒的快速、准确的检测。
PCR检测的原理基于DNA的复制过程，它涉及三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。
口蹄疫病毒RT-PCR快速检测方法的建立张书光;丁宏;李乙江;杨科;普仕华;高花英;李佳赟【摘要】目的:建立了一种RT-PCR的方法,用于检测O、A和亚洲Ⅰ型口蹄疫病原.方法:设计合成一套引物,通过反应条件的优化,建立RT-PCR的方法,以扩增口蹄疫病毒的基因,并用该法检测患病猪的颌下淋巴结和扁桃体,牛、羊的食道-咽分泌物(O-P液)等样品.结果:该方法可快速灵敏检测出猪的颌下淋巴结和扁桃体,牛、羊的食道-咽分泌物(O-P液)中的FMDV,并具有较好的特异性和重复性.结论:建立了一种RT-PCR检测O、A和亚洲Ⅰ型口蹄疫病原的方法.【期刊名称】《中国畜牧兽医文摘》【年(卷),期】2016(032)009【总页数】2页(P59,83)【关键词】口蹄疫病毒;RT-PCR;快速检测方法【作者】张书光;丁宏;李乙江;杨科;普仕华;高花英;李佳赟【作者单位】德宏州动物疫病预防控制中心,云南德宏678400;德宏州动物疫病预防控制中心,云南德宏678400;德宏州动物疫病预防控制中心,云南德宏678400;德宏州动物疫病预防控制中心,云南德宏678400;德宏州动物疫病预防控制中心,云南德宏678400;德宏州动物疫病预防控制中心,云南德宏678400;德宏州动物疫病预防控制中心,云南德宏678400【正文语种】中文口蹄疫是由口蹄疫病毒引起如黄牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物感染的一种热性、接触性、烈性传染病，被国际动物卫生组织列为A类重要传染病之首。
该病的发生和流行严重危害畜牧业的健康持续发展，造成巨大的经济损失，因此世界各国相当重视对该病的研究和防治。
该病对畜牧业生产危害性极大，是世界各国检疫和防疫的重点对象。
德宏州地处云南滇西边境，与缅甸毗邻，边境线全长503.8km，边境线无人工和天然屏障，中缅贸易相互往来，牧场共用。
全州有两个国家一类口岸，两个二类口岸，28个渡口，64条通道，是我国东南亚的主要窗口和重要枢纽。
ELISA和RT-PCR联合检测手足口病患儿5种病毒结果比较发布时间：2021-11-17T02:05:12.941Z 来源：《中国医学人文》2021年6月6期作者：王德宇[导读]王德宇（吉林市疾病预防控制中心；吉林省吉林市132000）【摘要】目的：探讨应用酶联免疫吸附试验（ELISA）与反转录·聚合酶链反应（RT-PCR）对检测手足口病患儿EV-A71、CV-A16、EV病毒RNA、EV-A71病毒RNA、CV-A16病毒RNA的价值。
方法：纳入542例就诊的手足口病患儿，采取ELISA法检测EV-A71IgM、CV-A16IgM，采用RT-PCR测定粪便与肛拭子中EVRNA、EV-A71RNA、CV-A16RNA，比较各组测定情况。
结果：542例患儿EV-A71IgM阳性率9.41%、EV-A71RNA阳性率1.11%、、CV-A16IgM阳性率9.23%、CV-A16RNA阳性率2.58%、EV-RNA阳性率77.68%。
应用ELISA与 RT-PCR对EV-A71、CV-A16检测的一致性差，但ELISA对EV-A71、CV-A16的检测阳性率高于RT-PCR（P＜0.05）。
结论：手足口病患儿，经ELISA与RT-PCR对EV-A71、CV-A16测定的一致性差，以ELISA的测定阳性率明显更高。
【关键词】手足口病；酶联免疫吸附试验；反转录·聚合酶链反应手足口病是一种因肠道病毒造成的急性发热出疹性传染病，典型表现是以手足口等部位散发性皮疹为主，大多数的患儿预后良好，然而偶有重症可有后遗症，严重甚至可引起患者死亡，所以尽早的诊断疾病具有积极意义[1]。
对手足口病，病毒类型常见柯萨奇病毒（Coxsackie virus，CV）A组4～7/9/10/16型与B组1～3/5型，埃可病毒的部分血清型以及肠道病毒（enterovirus，EV）71型，其中以CA-A16、EV-A17型常见，对重症手足口病常是因EV-A71病毒感染所终[2]。
水泡性口炎病毒荧光PT-PCR检测方法 1、范围 本标准规定了水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测。 2、缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2.1、荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 2.2、Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 2.3、RNA 核糖核酸 2.4、DEPC 焦碳酸磷酯。 2.5、PBS 磷酸盐缓冲盐水，（配方见附录A）。 2.6、Taq酶 Taq DNA聚合酶 2.7、VSV 水泡性口炎病毒。 3、原理 水泡性口炎病毒属RNA病毒，根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。通过严格设计和筛选的引物和探针，涵盖水泡性口炎病毒的两个型和突变株，为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针。探针的5'端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团：3'端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。在扩增时，Taq酶发挥它的5'→3'端外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液中，仪器检测到发出的荧光信号。 4、材料与试剂 4.1、仪器与器材 4.1.1、荧光RT-PCR检测仪。 4.1.2、高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上)。 4.1.3、台式离心机(离心速度3000r/min)。 4.1.4、混匀器。 4.1.5、冰箱(2℃一8℃和一20℃两种)。 4.1.6、微量可调移液器（5μL,10μL,looμL,1000μL）及配套带滤芯吸头。 4.1.7、Eppendorf管(1.5mL)、透明薄壁PCR管(0.2mL)。 4.2、试剂 4.2.1、除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。 4.2.2、三氯甲烷。 4.2.3、异丙醇:一20℃预冷。 4.2.4、PBS:配方见附录A。 4.2.5、75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。 4.2.6、水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测试剂盒:组成、功能及使用注意事项参见附录B。 4.2.7、引物：上游引物为5'-ATGGCTCCTACAGAGTTAAGAGAATCA-3'，下游引物为5'-TGAAG-TAATCAGCCGGGTATTC-3'。 4.2.8、荧光双标记探针（10μmol/L）：(FAM)5'-CGAAATTACCGGCCA ACGAGGATC-3'(TAM-AR)。扩增目标片段长度为97bp。 5、抽样 5.1、采样工具 5.1.1、下列采样工具应经121℃+2℃,15min高压灭菌并烘干。 5.1.2、棉拭子。 5.1.3、剪刀、镊。 5.1.4、注射器。 5.1.5、1.5mlEppendorf管。 5.1.6、研钵。 5.2、样品采集 5.2.1、采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织。采集后立即冷藏送检或放入含抗生素的PBS缓冲液中于4℃环境中保藏。编号并做好记录。 5.2.2、水泡液及水泡皮，只有当水泡完整时才能采集到水泡液。水泡一旦出现很快就会破溃，所以要不失时机地采集水泡液。首先用75%酒精轻轻消毒水泡表皮，尽量去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓冲液灭菌瓶中。 5.2.3、水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放入含抗生素的PBS缓冲液中。若水泡已经破溃，则只能采取破溃的水泡皮，用灭菌生理盐水刷洗掉水泡皮上的污物，放入上述缓冲液中。 5.2.4、口腔分泌物和咽喉试子：用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔来回刮3次-5次取分泌液。拭子一并放入盛有1.0mL含抗生素的PBS液的1.5mLEppendorf管中。也可用食道探杯刮取咽喉液体，放入加有抗生素的PBS中。编号,冷藏送检或低温保藏。 5.2.5、血液:用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendorf管中，密封、编号后保存于4℃环境中送检。 5.2.6、肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低温保藏。 5.3、样品贮运 样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放人一个塑料袋内)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。 5.4、样品制备 5.4.1、水泡液、口腔分泌物、血液和精液 样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 5.4.2、水泡皮、肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃下以3000r/min离15min，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 5、样本存放 制备的样本在2℃-8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置于-70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过三次)。 6、操作方法 6.1、实验室要求 水泡性口炎病毒RT-PCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物配制区和检测区;各工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用;每一区域应有专用的仪器设备；进入各个工作区域应严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区。 6.2、样本的处理 6.2.1、在样本制备区进行。样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制。 6.2.2、取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标注），编号。 6.2.3、每管加入600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，一份样本换用一个吸头，再加入200μL三氯甲烷，在混匀器上震荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4℃以12000r/min离心15min。 6.2.4、取与6.2.2相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），做标记。吸取6.2.3各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混匀。 6.2.5、于4℃、以12000r/min离心15min（1.5mLEppendorf管口保持朝离心机转轴方向放置），，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL75%乙醇，颠倒洗涤。 6.2.6、于4℃、以12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）。 6.2.7、以4000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。 6.2.8、各管加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行PCR扩增;若需长期保存应放置于一70℃冰箱内。 6.3、检测 6.3.1、扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Tap酶，在室温下融化后，以2000r/min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n(n=u十2十1)，其中u为被检样品数、2为阳性对照数、1为阴性对照数，每个样品测试反应体系配制见表1。 表1 反应体系混合液的配制 6.3.2、反应体系混合液分装 根据测试样品的总数（n），计算好各试剂的使用量，加入到适当体积的试管中，向其中加入n×1/2(颗)RT-PCR反转录酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装40μL，转移至样本处理区。 6.3.3、加样 在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入6.2.8中制备的RNA溶液10μL，盖紧管盖，以500r/min离心30s。将PCR管放于96孔板上，一定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管、阴性对照管，转移至检测区。 6.3 4、荧光RT-PCR检测
序号 组分 每管用量/μL N管总用量/μL 1 荧光RT/PCR反应液（2×） 25 n×25 2 Tap酶 1 n×1 3 RT/PCR反转录酶颗粒 1/2（颗） N×1/2（颗） 4 RNA酶抑制剂（RNasin） 1 n×1
5 ROX参考染料（ROXreference dye） 1 n×1 6 DEPC水 12μL n×12 6.3.4.1、在检测区进行。将6.3.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。在96孔板内(表内)记录或填写被检样品(Unknown)阳照对照((PC),阴性对照(NTC)。设置探针:5’为FAM，3’为TAMAR。 6.3.4.2、循环条件设置: ——第一阶段，反转录42℃/30min; ——第二阶段，预变性92℃/3min; ——第三阶段,92℃/10s,45℃/30s,72℃/1min,5个循环; ——第四阶段，92℃/10s,60℃/30s,40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。 7、结果判定 7.1、结果分析条件设定 直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 7.2、质控标准 7.2.1、阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。 7.2.2、阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，否则，此次实验视为无效。 7.3、结果描述及判定 7.3.1、阴性
