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实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
实验（一）胰蛋白酶活性测定[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm 增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
酶工程技术的研究及其在医药领域的应用一、本文概述随着生物技术的飞速发展，酶工程技术作为其中的重要组成部分，已经在医药领域展现出广阔的应用前景。
酶，作为生物体内的一类特殊蛋白质，具有高效、专一和温和的催化特性，因此被广泛用于医药、化工、食品等多个领域。
本文旨在探讨酶工程技术的最新研究进展，并重点分析其在医药领域的应用现状和发展趋势。
本文将对酶工程技术的基本原理和方法进行简要介绍，包括酶的来源、分离纯化、固定化以及酶反应器的设计等。
在此基础上，文章将重点论述酶工程技术在医药领域的多个应用方面，如药物合成、药物转化、药物分析和疾病诊断等。
通过具体案例和数据分析，展示酶工程技术在提高药物生产效率、降低药物成本、改善药物质量和提高疾病诊疗准确性等方面的积极作用。
本文还将对酶工程技术在医药领域面临的挑战和未来发展方向进行深入探讨。
随着生物技术的不断进步，酶工程技术的研究和应用将更加深入和广泛。
例如，新型酶的发现与改造、酶固定化技术的创新、酶反应器的优化以及酶工程技术在基因治疗和细胞治疗等新兴领域的应用等，都将成为未来研究的热点和方向。
酶工程技术在医药领域的应用已经取得了显著成果，并展现出广阔的发展前景。
本文将从多个角度全面分析酶工程技术在医药领域的应用现状和发展趋势，以期为相关领域的研究和实践提供有益的参考和借鉴。
二、酶工程技术的基础理论酶工程技术，作为一门应用生物技术的分支，其基础理论主要涵盖酶学基本原理、酶反应动力学、酶分子设计和改造以及酶固定化技术等方面。
酶学基本原理是酶工程技术的基石。
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，具有高度专一性和高效性。
酶通过降低反应的活化能来加速生物化学反应，使得原本难以进行的反应在温和条件下也能迅速进行。
了解酶的结构、催化机制以及影响因素，对于酶工程技术的应用至关重要。
酶反应动力学是研究酶催化反应速率与反应物浓度关系的科学。
通过对酶反应动力学的研究，可以了解酶催化反应的速度控制步骤、反应速率常数以及反应机制等，为酶工程技术的优化提供理论依据。
蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析是一种高效分离方法，它利用生物大分子之间的特异性作用来选择性地分离目标蛋白质。
该方法具有分离效率高、操作简单易行、适用性强、损失小等优点，被广泛应用于生物化学、生物医学和生物工程等研究领域。
以下针对蛋白质亲和层析的基本概念、方法流程、实验注意事项等进行详细介绍。
一、蛋白质亲和层析基本概念蛋白质亲和层析是利用配体固定于某一介质孔隙中，通过生物大分子之间的特异性作用，选择性地分离目标蛋白质的一种纯化方法。
通常用于分离蛋白质与其结合分子的复合物，例如酶与底物、抗体与抗原等。
常用的配体有亲和素、金属离子、抗体及蛋白质等。
二、蛋白质亲和层析方法流程1. 设计实验流程：确定目标蛋白质及其结合配体，选择适当的分离介质、操作条件及检测方法。
2. 制备分离介质：将选择的配体固定于固相载体（如琼脂糖、琼脂糖-硫酸盐、硅胶等）上。
3. 样品制备：采用适当的方法，“开裂”细胞，释放所需的目标蛋白质。
去除细胞碎片后，可进行酶、抗体等前处理。
4. 样品加载：将制备好的样品加入到分离介质中，充分混合。
5. 洗脱：将非特异性蛋白质等杂质彻底洗脱，最终目标蛋白质作为复合物结合态定向脱附。
6. 脱附和再生：可用特定的洗脱剂或酸碱条件等方法对结合蛋白质进行脱附，目的是复合物的释放以及再生与维护分离介质的性质和活性。
三、蛋白质亲和层析实验注意事项1. 选择适当的配体：根据目标蛋白质特异性、结构、物理化学性质等因素，选择有特异性和较高亲和力的配体。
2. 制备良好的分离介质：要求固相载体颗粒粒径均匀、孔隙适当，配体固定稳定。
3. 样品质量要好：可通过细胞全裂方案、适当的培养培养、存储方式、冻干等方法保证目标蛋白质的活性、纯度和稳定性等。
4. 洗脱过程控制：要严格控制洗脱条件，防止目标蛋白质异常脱失或浓度降低之外，同时要特别关注分离介质稳定性，以维护肯定柱介质活性和再生可能性。
蛋白质亲和层析是一种高效、通用的纯化方法，适用于从复杂基质中分离出目标蛋白质及其复合物。
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
华南理工大学硕士学位论文尿激酶的亲和层析分离研究姓名：叶峰申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：阮复昌20040301摘要摘要尿激酶（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）是体内纤溶酶原激活剂。
自从在尿液中发现尿激酶以来，人们对它的研究也日益深入和全面。
尿激酶参与纤溶过程，因而常用作治疗脑血栓、急性心肌梗塞和静脉栓塞等疾病。
尿激酶是一种糖蛋白，属丝氨酸蛋白酶类，等电点在８．４～９．７之间。
尿激酶的活性检测方法主要有直接法与间接法，采用间接法较为快捷，如荧光分光光度法和可见光分光光度法是使用较广泛的测定方法。
高纯度的药用尿激酶价格昂贵。
通常是从成年健康男性尿液中提取，制得粗酶后早期采用沉淀和传统层析相结合的多步分离法，后来发展用亲和层析纯化尿激酶。
本文采用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ为基质，对氨基苯甲脒（Ｐ—ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ，ｐ－ＡＢＺ）年［Ｉ肌酸为亲和配基，制备亲和层析柱分离尿激酶。
在前人的研究工作基础上，本文选择对氨基苯甲脒层析柱在最优的条件下分离尿激酶：合成配基密度４８１．ｔｍｏｌ・ｇ。
１的亲和载体，最大吸附量达２．１７×１０５Ｉｕｇ。
载体以上；选择ｐＨ７．５含Ｏ．５ｍｏｌ・Ｌ。
ＮａＣＩ的０．０５ｍｏｌ・Ｌ‘１Ｎａ２ＨＰ０４～ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液为吸附条件，选择ｐＨ４．０含０．５ｍｏｌ・Ｌ‘１ＮａＣｌ的０．１ｍ０１．Ｌ～ＮａＡｃ～ＨＡｃ缓冲液洗脱条件：将尿激酶粗酶纯化５０．２倍，活性回收率为７９％。
首次将肌酸应用于分离尿激酶，并取得较好的效果：合成配基为５３１．ｔｍｏｌ・ｇ。
的亲和载体，最大吸附量为１．２８×１０５ＩＵ・ｇ。
载体；选择ｐＨ４．５含０．５ｍｏｌ－Ｌ１ＮａＣｌ，０．１ｔ００１．Ｌ～ＡＩＣｌ，的０．１ｍ０１．Ｌ～ＮａＡｃ—ＨＡｃ缓冲液为吸附条件，选择ｐＨ７．０含０．５ｍ０１．Ｌ。
１ＮａＣｌ的Ｏ．０５ｍ０１．Ｌ～Ｎａ２ＨＰ０４～ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液为最终洗脱条件；将尿激酶粗酶纯化６３．７倍，活性回收率为８ｌ％。
亲和层析原理和步骤亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。
它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。
在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。
当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。
固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。
常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。
样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。
通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。
非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。
目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。
洗脱条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。
常用的洗脱方法包括pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。
洗脱后的目标蛋白可以通过浓缩和纯化步骤得到纯品。
二、亲和层析的优缺点亲和层析作为一种分离和纯化方法，具有以下优点：1.特异性：亲和层析可以选择性地结合目标蛋白，从而实现与其他非目标蛋白的分离。
2.高纯度：亲和层析可以显著提高目标蛋白的纯度，使其达到实验或工业应用的要求。
3.选择性：亲和层析可以基于不同的配体，实现对不同蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
亲和层析蛋白纯化
亲和层析蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，利用目标蛋白与具有亲和作用的亲和基团结合，将目标蛋白从复杂的混合物中分离出来。
亲和基团通常是与目标蛋白有特异结合的小分子，如金属离子、抗体、亲和标签等。
在亲和层析过程中，将这种具有亲和基团的亲和剂固定在某种固相材料上，如琼脂糖或磁珠等。
将混合物加入亲和剂固定的层析柱中，目标蛋白与亲和基团结合，其他非特异结合的成分则通过柱子流过。
随后，通过改变缓冲条件或添加竞争性亲和剂，将目标蛋白从亲和基团上进行洗脱，最终得到纯化后的目标蛋白。
亲和层析蛋白纯化方法简单易行，纯化效果好，但也有一些局限性，如亲和基团的选择对纯化效果有很大影响，目标蛋白与亲和基团的结合力可能不够牢固，而且纯化过程中可能会有非特异结合的蛋白质被误纯化。
因此，在选择亲和层析方法时需要根据目标蛋白的特性及需求进行合理选择。
