胰蛋白酶抑制剂的测定.doc - NY

实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。

在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。

胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。

pH＜3时，胰蛋白酶易变性。

PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。

胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。

重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。

胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。

实验（一）胰蛋白酶活性测定[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。

此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。

因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。

本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。

在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm 增加0.001的酶量为一个BAEE单位。

NYT 1103中华人民共和国农业行业标准NY/T1103.2－2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定Safety assessment of genetically modified plant and derived products Part 2: assay of anti-nutrients pancreatic typsin inhibiter2006-07-10公布2006-10-01实施中华人民共和国农业部公布前言本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国农业转基因生物安全治理标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中国疾病预防操纵中心营养与食品安全所、农业部科技进展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。

本标准首次公布。

转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定1 范畴本标准规定了转基因植物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定方法。

本标准适用于转基因大豆及其产品、转基因谷物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定。

其他的转基因植物，如花生、马铃薯等也可用该方法进行测定。

2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

2.1转基因植物genetically modified plant指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的植物。

2.2转基因植物产品products derived from genetically modified plant 指转基因植物的直截了当加工产品和含有转基因植物的产品。

3 原理胰蛋白酶可作用于苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPA），开释出黄色的对硝基苯胺，该物质在410 nm下有最大吸取值。

转基因植物及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应，使吸光度值下降，其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。

用分光光度计在410 nm处测定吸光度值的变化，可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。

4 试验材料转基因植物及其产品、受体植物及其产品。

实验一胰蛋白酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。

实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。

胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。

酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（ A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。

胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般E1%表达。

这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。

不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。

E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。

由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。

在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。

器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。

试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。

1．胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。

2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。

·食品科技·豆制品中胰蛋白酶抑制剂的研究杨丽杰吴非霍贵成孙占海（东北农业大学）【摘要】对豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性进行了调查，发现水解蛋白、乳用蛋白、组织蛋白、水豆腐、干豆腐中胰蛋白酶抑制剂活性均被钝化了以上；对腐乳、豆酱中胰蛋白酶抑制剂活性进行检测，结果未检出。

无糖豆粉、豆粉、豆浆以及内酯豆腐中胰蛋白酶抑制剂钝化率低于。

比较了种热处理方式对胰蛋白酶抑制剂的钝化效果，得到巴氏杀菌可钝化胰蛋白酶抑制剂；高压杀菌可钝化，超高温灭菌可钝化。

【关键词】豆制品；胰蛋白酶抑制剂；热处理中图分类号：文献标识码：文章编号：（）大豆营养价值高，是人和动物的主要蛋白质来源，但其中含有胰蛋白酶抑制剂，有碍营养素的吸收，导致食用后身体不适或豆制食品感官上的缺陷，严重时会造成人或动物的死亡。

豆制品中胰蛋白酶抑制剂的存在还没有引起人们足够的重视。

目前失活胰蛋白酶抑制剂主要采用热处理，为达到彻底钝化而采用的过度加热可使大豆中的蛋白质溶解度降低，营养物质遭到破坏。

而且，胰蛋白酶抑制剂比较耐热，热处理的效果也很有限。

本研究对市场上多种豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性进行了测定调查，比较了常用热处理方式对胰蛋白酶抑制剂的钝化效果，有利于人们对豆制品安全性的认识，为更彻底地失活胰蛋白酶抑制剂提供依据。

材料与方法材料与设备腐乳、干豆腐、内酯豆腐、豆浆、水豆腐、豆酱、豆粉为市售；无糖豆粉、水解蛋白、乳用蛋白、组织蛋白为大豆蛋白食品公司提供；生豆粉为实验室自备；所用化学试剂为分析纯或生化试剂。

牛胰蛋白酶、、均由美国公司生产。

仪器设备：振荡培养箱（上海医用仪表厂）、离心机（北京医用离心机厂）、型凯氏定氮仪（北京宜兴科教仪器研究所）、多功能恒温水浴锅型（沈阳市医疗器械厂）、紫外可见分光光度计型（日本岛津公司）、高压灭菌器（上海医用核子仪器厂）。

试验方法豆制品中常规营养成分测定d水分含量测定：常压干燥法。

i粗蛋白测定：微量凯式定氮法。

胰蛋白酶抑制因子的测定方法：称取1g 样品( 液体也以质量称取), 每1g 样品用50ml 0.01 mol/L 的氢氧化钠溶液提取3h( 搅拌),样品的最大用量约为1g 。

分别吸取0 、0 . 6 、1 . 0 、1 . 4 、1 . 8 、2 . 0ml 的上层提取液注入2 组试管中, 并加水稀释至2ml. 分别加入2ml 胰蛋白酶溶液于每支试管中, 混匀。

在加入5ml 预热至37 ℃的BAPNA溶液,并严格地于10min 后加入1ml 醋酸溶液并混匀,已停止反应。

将内容物过滤, 并于410nm 出测定光密度值。

对于空白对照管, 是取2ml 样本提取液加5ml BAPNA试剂并保温在37 ℃10min , 然后加入1ml 醋酸溶液及2ml 胰蛋白酶溶液.活力的表示方法：一个胰蛋白酶单位(AU), 是10ml 反映溶液在本文叙述的条件下,于410nm 处测得反映前后所增加0.01光密度为1 单位( Absorbance Unit),胰蛋白酶抑制剂活力用胰蛋白酶抑制剂单位( TLU) 表示。

结果计算：用TLU ml 对分析所用提取液体积( ml)做标准曲线,并外推到零。

每克样品的TLU 值=延伸值×稀释倍数, 当用分析的提取液的TLU ml 对分析液体积做图并不是直线关系时，则计算出每单位体积提取液中TLU 平均值, 则TLU g 样品=平均值×稀释倍数。

试剂：0 . 05mol/ L tris - CaCl2 溶液( 三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液) pH: 8 . 2 溶解6 . 05g 三羟甲基氨基甲烷及2 . 94gCaCl2 . H2O 于约900ml 蒸馏水中, 调节至pH 为8 . 2 ,并用蒸馏水稀释成1L.底物溶液：称取40mg BAPNA溶于1ml 二甲基亚砜中,并用已预热到37 ℃的tris-CaCl2 溶液稀释成100ml 。

胰蛋白酶溶液:称取4mg 胰蛋白酶(不含盐) 溶于200ml 0.001mol/L的HCl 中。

胰蛋白酶细胞消化液的活性测定和抑肽酶对胰蛋白酶的抑制作用实验目的1.测定sigma公司的trypsin-EDTA细胞消化液的活性。

2.测定用重组抑肽酶抑制trypsin-EDTA细胞消化液中trypsin的活性直至达到完全时所需要的抑肽酶的量。

实验材料1)Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml Lot # SLBN6048V EXP Aug 17，0.25%, sterile filtered,BioReagent, suitable for cell culture, 2.5g porcine trypsin and 0.2g EDTA per liter of Hank’s Balanced Salt Solution with phenol red.2) RTI (recombinant aprotinin) Lot # 160301 , 5.8 EPU/mg, 21.9mg/ml。

3) 活性测定底物：BAEE溶液，按照公司标准方法配置。

4) 胰蛋白酶活性测定方法，按照公司标准方法操作。

实验过程及结果1) 测定trypsin-EDTA solution的活性：4150 BAEE unit/ml，2) 按照1EPU RTI可抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性，计算完全抑制4150 BAEE unit/ml胰蛋白酶的RTI用量为4150/16200=0.256 EPU。

具体实验如下（1）取150ul trypsin-EDTA solution，总活性为622.5 BAEE unit(4150 BAEE unit/ml * 0.15)，（2）计算完全抑制，所需加入RTI的体积，622.5/16200=0.0384 EPU，换算为体积为：0.0384/(5.8*21.9)=0.302ul，将RTI稀释10倍后，加入量为3.02 ul。

反应5min后，测定胰蛋白酶活性。

现行有效的转基因食品，转基因生物相关的部委规章和其他规范性文件以及部分地方规定，由食品伙伴网整理汇总，仅供参考。

一、法律法规农业转基因生物安全管理条例（国务院令第304号）进出境转基因产品检验检疫管理办法（总局令第62号）农业转基因生物安全评价管理办法（农业部令第8号）农业转基因生物进口安全管理办法（农业部令第9号）农业转基因生物标识管理办法（农业部令第10号）农业转基因生物加工审批办法（农业部令第59 号）转基因食品卫生管理办法（卫生部令第28号）国家标准：GB/T 19495.1-2004 转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T 19495.4-2004 转基因产品检测核酸定性PCR检测方法GB/T 19495.5-2004 转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T 19495.6-2004 转基因产品检测基因芯片检测方法GB/T 19495.7-2004 转基因产品检测抽样和制样方法GB/T 19495.8-2004 转基因产品检测蛋白质检测方法农业行业标准：NY/T 672-2003 转基因植物及其产品检测通用要求NY/T 673-2003 转基因植物及其产品检测抽样NY/T 674-2003 转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化NY/T 675-2003 转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法NY/T 719.1-2003 转基因大豆环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T 719.2-2003 转基因大豆环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T 719.3-2003 转基因大豆环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T 720.1-2003 转基因玉米环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T 720.2-2003 转基因玉米环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T 720.3-2003 转基因玉米环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T 721.1-2003 转基因油菜环境安全检测技术规范第1部分：生存竞争能力检测NY/T 721.2-2003 转基因油菜环境安全检测技术规范第2部分：外源基因流散的生态风险检测NY/T 721.3-2003 转基因油菜环境安全检测技术规范第3部分：对生物多样性影响的检测NY/T 1101-2006 转基因植物及其产品食用安全性评价导则NY/T 1102-2006 转基因植物及其产品食用安全检测大鼠90d喂养试验NY/T 1103.1-2006 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第1部分：植酸、棉酚和芥酸的测定NY/T 1103.2-2006 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定NY/T 1103.3-2006 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第3部分：硫代葡萄糖苷的测定出入境检验检疫行业标准：SN/T 1194-2003 植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法SN/T 1195-2003 大豆中转基因成分的定性PCR检测方法SN/T 1196-2003 玉米中转基因成分定性PCR检测方法SN/T 1202-2010 食品中转基因植物成分定性PCR检测方法农业部869号公告农业部953号公告农业部1193号公告农业部1485号公告。