分光光度法测定蔗糖酶的米是常数
一．实验目的：
1. 用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数M K 和最大反应速率m ax v 。
2. 了解底物浓度与酶反应速率之间的关系
3. 掌握分光光度计的使用方法
二．实验原理：
酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。它表现出特异的催化功能，因此叫生物催化剂。酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。
在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时，总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率，反应速率最大。
Michaelis 应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应速率和底物浓度的关系：
s
M s c K c v v +⋅=max 米氏常数M K 是反应速率达到最大值一半时的底物浓度。测定不同底物浓度时的酶反应速率，为了准确求得M K ，用双倒数作图法，可由直线方程：
max
max 111v c v K v s M +⋅= 以v
1为纵坐标，s c 1为横坐标，作图，所得直线的截距是m ax 1v ，斜率是m ax v K M ，直线与横坐标的交点为M
K 1-。 本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。该反应的速率可以用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系，因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。所以测量不同底物（蔗糖）浓度s c 的相应反应速率v ，就可用作图法计算出米氏常数M K 值。
三．仪器与试剂：
高速离心机一台；分光光度计一台；恒温水浴一套；比色管（25ml ）9支；称液管（1ml ）10支；称液管（2ml ）4支；试管（10ml ）10支；3,5-二硝基水杨酸试剂（即DNS ）；0.1mol.dm -3醋酸缓冲溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析纯）；葡萄糖（分析纯）。
四．实验步骤：
１．蔗糖酶的制取。在50ml的锥形瓶中加入鲜酵母10g，加入0.8g醋酸钠，搅拌15-20min 后使块团溶化，加入1.5ml甲苯，用软木塞将瓶口塞住，摇动10min，放入37℃的恒温箱中保温60h。取出后加入1.6ml的4mol/L的醋酸和5ml水，使PH为4.5左右。混合物以每分钟3000转的离心机离心灶小时，混合物形成三层，将中层移出，注入试管中，为粗制酶液。
２．溶液的配制。
（１）0.1%葡萄糖标准液（1mg/mL）：先在90℃下将葡萄糖烘1h，然后准确称取1g于100ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量移至1000ml容量瓶中。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂（即DNS）：6.3gDNS和262ml的2mol/LNaOH加到酒石酸钾钠的热溶液中（182g酒石酸钾钠溶于500ml水中），再加5g重蒸酚和5g 亚硫酸钠，微热搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容到1000ml，贮于棕色瓶中备用。
（3）0.1mol/L的蔗糖液：准确称取34.2g蔗糖溶解后定容至1000容量瓶中。３．葡萄糖标准曲线的制作。在9个50ml的容量瓶中，加入不同量0.1%葡萄糖标准液及蒸馏水，得到一系列不同浓度的葡萄糖溶液。分别吸取不同浓度的葡萄糖溶液
1.0ml注入9支试管内，另取一支试管加入1.0ml蒸馏水，然后在每支试管中加入
1.5mlDNS试剂，混合均匀，在沸水浴中加热5min后，取出以冷水冷却，每支内
注入蒸馏水2.5ml，摇匀。在分光光度计上用540nm波长测定其吸光度。由测定结果作出标准曲线。
K的测定。在９支试管中分别加入0.1mol/L蔗糖液、醋酸缓冲４．蔗糖酶米氏常数
M
溶液，总体积达2ml，于35℃水浴中预热，另取预先制备的酶液在35℃水浴中保温10min，依次向试管中加入稀释过的酶液各2.0ml，准确作用5min后，按次序加入0.5ml 2mol/L的NaOH溶液，摇匀，令酶反应中停止，测定时，从每支试管中吸取0.5ml酶反应液加入装有1.5mlDNS试剂的25ml比色管中，加入蒸馏水，在沸水中加热5min后冷却，用蒸馏水稀至刻度，摇匀，540nm波长测定其吸光度。
实验所需仪器设备
五．数据处理：
由各反应液测得的吸光度值，在葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖浓度，结合反应时间计算其反应速率v ，并将对应的底物（蔗糖）浓度s c ，一并用表格形式列出，将v 1对s
c 1作图，以直线斜率和截距求出M K 和m ax v 。 六．思考题
１．为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？为什么会产生过冷现象？ ２．试讨论本实验对米氏常数的测定结果与底物浓度、反应温度和酸度的关系。
