血清米氏常数的测定

酶活米氏常数实验一、实验前准备1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。

2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。

TMB （外间冰箱上层）溶于 DMSO （二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS （与TMB放在一起）溶于二次水。

3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200此和10此移液枪、50此排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25 C,提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量出02（每孔1mL 左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。

4、记录本上提前写好实验的加样顺序：催化底物TMB （或ABTS ）的酶促动力学过程加样顺序：①200丄缓冲液②10丄催化剂③底物 TMB （ABTS ）（0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 山④ 32 ^LH 2O2 （排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：① 200此缓冲液②10此催化剂③H2O2 （2, 4, 6, 8, 10 , 16, 32, 64 此）④ 10此底物 TMB （ABTS ）（排枪加）数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间, 般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。

Code1234567TimeTMBV0100.51246810Code1234567TimeH2O2246810163264、实验1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通）0,按Enter键进入系统。

电脑开机，密码为 mby-nano,双击酶标仪软件图标680生甬.，出，密码为5个pfcjisu ini现登录框 科节, 软件登求舌姓容应—密码登韋I 购I上禅科华左举区息技# 柵袋司 怕乐生酣医学产品印艮竖司 普,直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面栓脸就E金萍诵枷本（I 】 捡鉴E 呂MM■Htz]广空白®对试滾怅.1徴孑區蠣号 100616002 广阴性对Ml ） 匕:a试捌批号 2QQ2O325 广阳性对磐 眼腺堀率1 無时阖厂试剂有妓朋 0000/00/M) 亠r 灘品(fi) 进損方式厂试制儀应两 上更科洋「IS 控品竝｝ 旧性舍貳厂标本号范田也厂兀韵揖故检制-UK 鬪 A 飞 C 了01 0203 04 05 0B 07 08 | 0^」101112f \G HVJRiiill(T)iE 岀⑴，若底物为TMB ,选择“铁动力学”（波长为650nm ） IH 标役控制-JlKffN 「『口金〕顼目1%息 检验项目|樹th 力芈丄］ L 空白⑧ 广网性对厂咱性对照®L 标准品（2） 厂质控品⑴ 测试液长 振扳频车振板时河F0 竝黃 TRYER071122 OF 年11月22日iITT细胞活性肿霜坏死田子性性性性£姑刎刪定定L00616002_FE-K £111701751JKE-KI 铁动力学送白嵐 ■±T3] £i 鬟Si 麻從 ，选择模抹本类呈*普通馬車（P 广空&（E ） 厂阴性对慝迅）广昭性对愿住） 厂扌示唯品｛总 厂质揑品（Q ）呼目佶息橙脸项目|铁动力学 测试液按I 胡。

血清酶催化活性浓度和代谢物浓度检测技术酶反应动力学原理（影响酶反应的因素）酶反应动力学主要研究酶催化反应的过程与速率，以及各种影响酶催化速率的因素，定量时的观察对象是总单位时间内底物的减少或产物增加的量。

影响酶作用的因素包括底物的浓度、酶反应的最适pH、最适温度、酶的抑制作用，另外还包括试剂中表面活性剂的作用等因素。

1.底物浓度的影响在检测试剂中底物浓度、辅因子、活化剂、复构剂的种类和浓度均对酶的测定至关重要。

其中以底物的种类和浓度最为重要。

底物浓度影响遵循米氏方程：ν＝V[S]/K m＋[S]当底物浓度远远小于K m，增加底物浓度，反应速度增加。

当底物[S]＞＞K m时，公式近似为ν=V，反应速度不再增加，故此时反应速度为最大反应V。

从理论上说只有测定的是酶最大反应V，反应速度才和酶量成正比。

（1）底物的种类若所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，K m最小的底物往往是此酶的生理底物。

（K m 表示酶和底物的亲和力，K m越小亲和力越大）如该酶测定主要用于临床诊断工作，首先应考虑有效诊断价值的底物。

选择K m小的底物测定酶活性，在最大反应速度时底物浓度也将最低。

这意味着试剂成本可能较低，不易出现底物难溶解的困难。

（2）选择底物的合适浓度确定底物种类后，重要的是选择底物的合适浓度。

米氏方程在选择酶测定底物浓度有着重要的指导作用。

计算出某一酶的K m后就可以计算出不同底物浓度和K m间的比值，将其代入米氏方程就可以计算出此时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分比。

上述只能适应用于单一底物的酶。

2.反应体系的最适pH、缓冲液的种类和浓度测定酶活性浓度时一定要选择在最适pH。

因为此处酶反应速度最大，测定灵敏度最高。

此处酶活性变化的斜率最小，如反应体系中出现pH变化时，对测定结果影响最小。

pH还可以影响酶的稳定性。

为使反应体系能稳定在最适pH范围，实际检测时多采用不同类型、不同浓度的缓冲液。

3.温度的控制温度对酶活性影响具有双重性。

一、实验目的1. 理解并掌握米氏常数（Km）及其与最大反应速度（Vmax）的关系。

2. 通过实验测定酶的米氏常数，了解酶与底物之间的亲和力。

3. 学习并掌握酶促反应动力学的基本原理和实验方法。

二、实验原理米氏常数（Km）是酶的特征性常数，表示酶与底物结合的亲和力。

在一定的实验条件下，酶促反应的初速度（v）与底物浓度（[S]）之间的关系可用米氏方程表示：\[ v = \frac{V_{max} [S]}{Km + [S]} \]当底物浓度很低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，随着底物浓度的增加，反应速度逐渐加快，但增速逐渐减慢。

当底物浓度增加到一定程度时，反应速度达到最大值（Vmax），此时酶已全部被底物饱和。

本实验采用分光光度法测定酶的米氏常数。

实验中，通过改变底物浓度，测定不同浓度下酶促反应的初速度，根据米氏方程绘制v/[S]对1/[S]的曲线，通过线性回归分析求出曲线的斜率和截距，进而计算出Km和Vmax。

三、实验材料与仪器材料：1. 酶制剂（如蔗糖酶、淀粉酶等）2. 底物溶液（如葡萄糖溶液、淀粉溶液等）3. 碳酸盐缓冲液4. 4-氨基安替比林5. 铁氰化钾6. 0.1 mol/L NaOH溶液7. 葡萄糖标准溶液仪器：1. 分光光度计2. 移液管3. 移液器4. 恒温水浴5. 试管6. 比色皿四、实验步骤1. 制备酶溶液：将酶制剂溶解于适量的碳酸盐缓冲液中，调节pH值至最适值，稀释至一定浓度。

2. 制备底物溶液：将底物溶液稀释至不同浓度，备用。

3. 测定酶促反应初速度：a. 将不同浓度的底物溶液分别加入试管中，加入适量的酶溶液。

b. 将试管放入恒温水浴中保温一段时间。

c. 取出试管，立即加入适量的4-氨基安替比林和铁氰化钾，充分混匀。

d. 在分光光度计上测定溶液的吸光度，记录数据。

4. 数据处理：a. 以底物浓度[S]为横坐标，酶促反应速度v为纵坐标，绘制v/[S]对1/[S]的曲线。

b. 对曲线进行线性回归分析，求出曲线的斜率和截距。

⽶⽒常数的测定底物浓度对酶促反应速度的影响——⽶⽒常数的测定⼀．⽬的要求1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。

1.2掌握测定⽶⽒常数K m 的原理和⽅法。

⼆．实验原理酶促反应速度与底物浓度的关系可⽤⽶⽒⽅程来表⽰：式中：v ——反应初速度（微摩尔浓度变化/min ）；V ——最⼤反应速度（微摩尔浓度变化/min ）； [s]——底物浓度（mol/L ）； K m ——⽶⽒常数（mol/L ）。

这个⽅程表明当已知K m 及V 时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。

K m 值等于酶促反应速度达到最⼤反应速度⼀半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之⼀。

不同的酶，K m 值不同，同⼀种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和⼒⼤⼩：K m 值越⼤，表明亲和⼒⼩；K m 值⼩，表明亲和⼒⼤。

则测K m 值是酶学研究的⼀个重要⽅法。

⼤多数纯酶的K m 值在0.01～100mmol/L 。

Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作图法）是⽤实验⽅法测K m 值的最常⽤的简便⽅法：实验时可选择不同的[s]，测定对应的v ，以对作图，得到⼀个斜率为V Km的直线，其截距][1s 则为mK 1，由此可求出K m 的值（截距的负倒数）。

本实验以胰蛋⽩酶消化酪蛋⽩为例，采⽤Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。

胰蛋⽩酶催化蛋⽩质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键⽔解。

⽔解时有⾃由氨基⽣成，可⽤甲醛滴定法判断⾃由氨基增加的数量⽽跟踪反应，求得初速度。

][][s K s V v m +=V s V K v m 1][1.1+=v 1][1s三．试剂和器材3.1 试剂A.10～30g/L的酪蛋⽩溶液（pH8.5）：分别取10、20、25、30g酪蛋⽩溶于约900mL⽔中，加20mL 1mol/L NaOH 连续振荡，微热直⾄溶解，以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH调pH⾄8.5，定容1L，即⽣成四种不同[s]的酪蛋⽩标准溶液。

米氏常数名词解释生物化学
米氏常数是生物化学中一个重要的参数，用于描述酶催化反应
速率的特性。

它也被称为酶的米氏常数、Michaelis-Menten常数或Km值。

米氏常数是由酶底物与酶结合形成酶底物复合物的速率常数。

它是一个测量酶底物复合物形成和解离速率之间平衡的指标。

米氏
常数的单位通常是摩尔/升。

米氏常数的数值越小，表示酶对底物的亲和力越强，底物与酶
结合形成酶底物复合物的速率越快。

反之，米氏常数越大，表示酶
对底物的亲和力越弱，底物与酶结合形成酶底物复合物的速率越慢。

米氏常数与酶底物复合物形成速率以及酶底物复合物解离速率
密切相关。

它在酶动力学研究中起到了至关重要的作用，可以帮助
我们理解酶催化反应的速率限制步骤以及酶与底物之间的相互作用。

米氏常数的测定通常需要进行一系列实验，通过测量不同底物
浓度下酶催化反应的速率来确定。

通过绘制米氏常数与底物浓度的
关系曲线，可以得到酶对底物的亲和力以及酶的催化效率。

总之，米氏常数是生物化学中用于描述酶催化反应速率特性的重要参数，它能够帮助我们理解酶底物相互作用以及酶催化反应的速率限制步骤。

对米氏常数求法的一点补充米氏常数（Michaelis-Menten Constant，通常表示为K m）是酶动力学中的一个重要参数，它反映了酶对底物的亲和力。

在酶促反应中，米氏常数定义为反应速率达到最大速率一半时的底物浓度。

米氏常数的求法通常涉及到对实验数据的拟合，最常用的是通过Lineweaver-Burk双倒数作图法或者非线性回归分析方法。

这里对米氏常数的求法做一些补充说明：1.Lineweaver-Burk双倒数作图法：这种方法是将米氏方程[E]v=K m+[S]V max[S]转换为双倒数形式v1=V max K m⋅[S]1+V max1，其中v是反应速率，[E]是酶浓度，V max是最大反应速率，[S]是底物浓度。

通过实验测得不同底物浓度下的反应速率，然后作v1对[S]1的图，通过线性回归得到一条直线，该直线的斜率是V max K m，截距是V max1。

由此可以求出K m和V max。

2.非线性回归分析方法：这种方法直接使用米氏方程进行非线性拟合，通过迭代计算找到最佳拟合参数K m和V max。

这种方法相对于Lineweaver-Burk双倒数作图法来说更为准确，因为它不需要对数据进行转换，避免了转换过程中可能引入的误差。

3.注意事项：o实验数据的质量对求得的米氏常数有很大影响，因此需要确保实验条件的准确性和一致性。

o在进行数据分析时，应该检查数据是否符合米氏方程的预期行为，例如反应速率是否随着底物浓度的增加而增加，直到达到一个平台期。

o对于某些酶促反应，可能存在底物抑制或产物抑制等复杂情况，这时米氏方程可能不再适用，需要使用更复杂的模型来描述反应动力学。

4.其他求法：除了上述两种常用方法外，还有一些其他方法可以用来求解米氏常数，例如Eadie-Hofstee作图法、Hanes-Woolf作图法等。

这些方法各有优缺点，选择哪种方法取决于实验数据的特性和分析需求。

总之，在求解米氏常数时，应该根据实验条件和数据特性选择合适的方法，并确保实验数据的准确性和一致性。

用甘油作保护剂制备胆固醇三联酶液及胆固醇试剂的推广应用(一)用酶试剂测定血清总胆固醇(TC)是IFCC推荐的方法，县有简易、快速、精密，特异性好，适应于自动或半自动生化分析仪及各类分光光度计等优点，在我国正在逐步取代强酸显色剂。

全面推广使用TC酶法分析，胆固醇酯酶(CEH)和胆固醇氧化酶(COD)需要有优质，价廉，充足的供应来源。

上海医药工业研究院及河北省科学院微生物研究所研制的这两种酶，虽可达到常规生化检验的要求，但不能满足供应，所以我们引进了Boehinger公司CEH、COD，用甘油作保护剂制备了胆固醇三联酶液，设计以Trinder反应。

)为基础的改进的TC测定法。

液体胆固醇酶试剂减少了在制备过程中(如冻干球磨)酶活性的损失，保证了酶试剂质量，降低了成本。

材料和方法1.酶及试剂(1)CEH、COD系西德Boehringer产品，CEH13300u/g(25℃)，COD3580μ/g(25℃)；辣根过氧化物酶(HRP，R11.5～2)上海华美生物工程公司产品，200u/ng(25℃)。

(2)KH2PO4、Na2HP4、12H2O及酚类均为喻尔滨市化工试剂厂产品；聚乙二醇辛基醚(乳化剂OP)为东湖塘化学试剂厂；4-氨基安替比林(4AAP)为上海试剂一广产品；甘油为吉林省军区化工厂产品；胆酸钠为Serra产品；胆固醇亚油酸酯为Sigma产品，纯度99％。

(3)作对比研究用的酶试剂有美国BecRman、意大利Sdaro胆固醇试剂盒。

2.仪器岛律LKB-260紫外分光光度计，IL公司M-10，MoA全自动生化分析仪及美国ENCOR离心式自动生化分析仪；上海县曹行无线电原件厂81.2型磁力恒温搅样器。

3.实试方法(1)试剂配方选择：三联酶液：每升甘油PBS(PH7.2)酶稀释液中含CEH≤750u，COD≥750u,HRP≥5000u，在2-8℃环境中磁力搅拌2小时，分装安瓶(1ml/瓶)，在-20℃环境中可保存2年，在2-8环境中可保存半年。

双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：[][]S K S V v m max +⋅= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。

这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。

K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。

不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。

大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。

通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+⋅=以v 1对[]S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。

过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。

生物化学实验（齐鲁工业大学）知到章节测试答案智慧树2023年最新项目一测试1.在比色皿中放置被测溶液时应该（）。

参考答案:保持比色皿外壁洁净;先用少量被测溶液进行润洗2.用可调式移液器移取普通缓冲液时，正确的操作为（）参考答案:第一停点取液，第二停点放出溶液3.使用移液器移液过程的正确顺序是①卸去吸头②吸液③容量设定④安装吸头⑤放液（）参考答案:③④②⑤①4.1、容量瓶可以直接用来贮存配制好的试剂。

( )参考答案:错5.移液器使用完毕，应将移液器的量程调至最小值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。

( )参考答案:错项目二测试1.黄色的DNS与还原糖在碱性条件下共热后，DNS被还原成什么颜色？（）参考答案:棕红色2.碘-碘化钾溶液的作用是（）。

参考答案:指示提取物是否完全水解，完全水解不显示蓝色。

3.关于本实验，以下说法不正确的是（）。

参考答案:需要用若干标准浓度的淀粉作标准曲线。

4.在3,5-二硝基水杨酸试剂加入亚硫酸钠可以消除试剂中的溶解氧的影响，起稳定试剂的作用。

（）参考答案:对5.在3,5-二硝基水杨酸试剂中加入重蒸酚为了增强试剂的显色能力。

（）参考答案:对6.下列哪个不是蛋白质含量测定的方法？（）参考答案:3,5-二硝基水杨酸法7.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，测定反应产物浓度是在（）波长下进行光吸收值测定。

（）参考答案:595 nm8.可以通过考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理是（）。

（）参考答案:考马斯亮蓝染色法在一定范围内符合比尔定律;考马斯亮蓝 G-250 可与蛋白质结合形成复合物，这种结合具有高敏感性9.使用考马斯亮蓝法测定蛋白质时，待测样品蛋白质含量应在10~100µg之间。

（）参考答案:对10.考马斯亮蓝 G-250 主要是与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合。

（）参考答案:对11.染料氧化型的2,6-二氯酚靛酚在酸性条件下呈（）色。

（）参考答案:粉红色12.氧化型的2,6-二氯酚靛酚在中性或碱性条件下呈（）色。

米氏常数和最大反应速率的测定米氏常数和最大反应速率是化学和生物学实验中常用的概念，用于描述反应的速度、强度和动力学特征。

本文将简要介绍这两个概念的概念解释、测定方法和实验应用。

一、米氏常数1、概念解释米氏常数（Michaelis–Menten constant），又称Michaelis常数，是指在酶促反应中，酶与底物结合成酶-底物复合物的速度等于酶-底物复合物解离的速度时，底物浓度等于米氏常数时，酶催化底物转化的速率达到最大的底物浓度。

即具有一定的底物浓度时，酶反应速率线性增加，但当底物浓度增加到一定程度时，反应速率不再随之增加。

2、测定方法测定米氏常数的实验方法叫作Michalis-Menten方法。

首先，在不同的底物浓度下，测定酶催化底物转化的速率（V0），然后作图，以底物浓度为自变量，速率为因变量，得到一个曲线。

通过对这个曲线拟合，计算出Vmax（酶的最大催化速率）和Km（米氏常数）。

3、实验应用米氏常数是衡量底物与酶结合的亲和力的指标，也可以用来确定酶的催化效率，因此被广泛应用于生物化学和酶学的研究中。

例如，在药物开发过程中，可以通过测定药物对酶的抑制作用来计算Km值，以此评估药物的有效性和选择性。

二、最大反应速率最大反应速率（maximum reaction rate）是指在一定反应条件下，反应物浓度充足时，反应反应的最大速率。

最大反应速率是反应速率的一个重要参数，因为它反映了反应物种类、反应条件、反应物浓度等因素对反应速率的影响。

测定最大反应速率的方法主要有两种：手动法和自动法。

手动法适用于较为简单的反应，如催化反应；自动法适用于反应物种类较多、反应复杂的反应，如酶催化等反应。

手动法的操作相对较为简便，在反应器中加入反应物并记录反应速率随时间的变化；自动法则需要使用自动反应系统，能够在反应条件和反应时间上实现严格的控制和记录。

最大反应速率是反应速率的一个重要参数，可以用于评估反应的强度、动力学特征和反应机理。

过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐121140012一、实验目的1. 了解米氏常数的测定方法2. 学习提取生物组织中的酶二、实验原理1.米氏反应动力学米氏方程(Michaelis-Menten Equation):2.米氏常数的意义：①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无关。

②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。

其数值大小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。

③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶的最适底物。

3.米氏常数的求法：该方法的缺点是难以确定最大反应速度Vmax。

该作图法应用最广。

但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。

因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。

此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。

[S]<<Km时图形近于水平线，[S]>>Km时直线将在原点附近与轴相交。

4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：①POD：过氧化物酶②SOD:超氧化物歧化酶③CAT：；过氧化氢酶5.过氧化氢酶的作用：植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。

过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。

氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。

过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。

6.过氧化氢酶活力的测定方法：①紫外吸收法：过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。