过氧化氢酶米氏常数的测定

双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：[][]S K S V v m max +⋅= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。

这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。

K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。

不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。

大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。

通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+⋅=以v 1对[]S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。

过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。

过氧化氢酶km值的测定实验报告过氧化氢酶（catalase）是一种重要的酶类，在生物体内起着重要的氧化还原作用。

本实验旨在通过测定过氧化氢酶的Km值，来研究该酶对底物浓度的敏感程度，从而深入了解过氧化氢酶的催化特性。

首先，我们需要准备实验所需的材料和试剂，包括过氧化氢酶样品、过氧化氢底物溶液、缓冲液、吸光度计等。

接着，按照实验方案，我们将过氧化氢底物溶液分别配制成不同的浓度，然后将不同浓度的底物溶液与过氧化氢酶样品混合，反应一定时间后，利用吸光度计测定反应体系中过氧化氢的浓度。

通过对不同浓度底物下反应体系中过氧化氢浓度的测定，我们可以得到不同底物浓度下过氧化氢酶催化反应的速率。

在实验过程中，我们需要注意保持反应体系的温度稳定，避免温度对反应速率的影响。

此外，为了减小误差，我们需要进行多次重复实验，取平均值作为最终结果。

在实验结束后，我们将利用实验数据，通过线性回归分析，计算出过氧化氢酶的Km值。

通过本实验，我们可以得到不同底物浓度下过氧化氢酶的催化速率，进而绘制出酶的底物浓度与催化速率的曲线。

通过分析曲线斜率的变化，我们可以得到过氧化氢酶的Km值。

Km值表示酶与底物结合的紧密程度，Km值越小，表示酶对底物的亲和力越大，反之亦然。

在实验结果分析中，我们可以得出不同底物浓度下过氧化氢酶的Km值，从而揭示了过氧化氢酶对底物浓度的敏感程度。

这有助于我们更深入地了解过氧化氢酶的催化特性和底物结合机制。

同时，对于医学和生物工程领域，对过氧化氢酶的Km值的准确测定也具有重要的应用意义。

综上所述，通过本实验的Km值测定，我们可以更深入地了解过氧化氢酶的催化特性和底物结合机制，为相关领域的研究和应用提供重要的参考依据。

希望本实验能为相关领域的研究工作提供一定的帮助和启发。

过氧化氢酶米氏常数各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503 组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：/L（4）KMnO4实际浓度：/L3.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）实验（2）对照（1）对照（2）（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）(A?B)?VT??V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=酶活(mgH2O2/g·min)=（A-B）= VT====10min二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel 作图）1/s 1/v2008040（四）求出Km（mol/L）和Vmax （mmol/min）Km11?? vv[S]v如（三）中图maxmaxy=+ x=0时y=1/Vmaxy=0时x=-1/KmKm= Vmax=第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。

1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。

2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。

3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。

4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。

2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。

2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。

3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O24.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。

实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。

二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。

本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。

2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。

3.温度计（0～100℃）。

4.微量滴定管5ml（×1）。

5.容量瓶1000ml（×1）。

四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。

2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。

3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。

4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。

5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。

6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。

第一部分 实验一、 原理1、过氧化氢酶米氏常数的测定：H 2O 2被过氧化氢酶分解出H 2O 和O 2，未分解的H 2O 2用KMnO 4在酸性环境中滴定，根据反映前后H 2O 2的浓度差可以求出反应速度。

本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km2、黄素蛋白酶的定性试验：黄素蛋白酶是以黄素核莓酸（FMN 或FDA ）为辅基的脱氢酶类。

某些黄素蛋白酶还含有铁、铜或钼类金属离子。

分子中核黄素部分能与氢原子可逆地结合，从而引起递氢作用。

N N C NH CN O O CH 2(CHOH)3CH 2OH H 3C H 3C N H N CNH C H N O O CH 2(CHOH)3CH 2OH H 3C H 3C +2H -2H这类脱氢酶可以催化脱去底物分子中的氢氧或从还原态辅酶Ⅱ（NADH,H+及NADPH ，H+）上把氢传给氧。

在无氧条件下，可用甲烯蓝代替氧。

例如牛乳中的黄嘌呤氧化酶就是黄素蛋白酶的一种。

它能催化水合甲醛把氢交给甲烯蓝3、酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定：酵母中含有丰富的蔗糖酶（EC3.2.1.26），本实验以酵母为原料，首先通过研磨法以及温度差破碎法破碎细胞的方式得到粗酶，之后先通过调节pH 到5.0杂蛋白的等电点，不影响酶活的情况下，使其凝聚沉淀，最后保温至最适温度反应后，通过测定没催化产物量来间接测定酶活。

细胞破碎方法有机械破碎法（通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法），物理破碎法（通过压力、温度、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，常用的有温度差破碎法、压力差破碎法和超声波破碎法）和化学破碎法（通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法）。

研磨法是利用研体、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可以加入精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。

研磨法设备简单、可以采用人工研磨液可以采用电动研磨。

实验二过氧化氢酶km值的测定
过氧化氢酶（H2O2）是一种经典的多功能过氧化物。

它可以在氧化还原或化学反应中发挥作用。

因此，它在生物氧化解氧化反应中非常重要。

H2O2可以与其他过氧化物，包括氧原子和自由基，反应形成复杂的反应物组合。

这些反应控制着氧化脱氢反应，而过氧化氢酶（Km）是这种反应序列的关键步骤。

Km是H2O2和其他过氧化物之间氧化脱氢反应的活性位置，它表示H2O2在氧化脱氢反应中显示出其最大活性的浓度。

它是生物体氧化脱氢反应进行的重要指标，可以帮助我们了解这种反应的效率和机理。

测定Km值可以看出这个过程的氧化-脱氢速率，从而优化氧化脱氢反应的效率。

Km值的测定大致可以分为三个部分：进行反应的准备工作、进行该反应的实验操作和数据处理。

首先，用实验室内的设备准备反应液，其中应包括酶溶液、过氧化氢和反应基质。

其次，把反应液倒入试剂瓶，用磁力搅拌器搅拌均匀，使酶蛋白完全溶解。

然后，用光度仪测定溶液的响应时间，并确定反应停止的时间。

最后，对得到的数据进行分析，以确定Km值。

Km值测定是一个比较复杂的实验，需要实验室设备、当心操作和熟练的数据处理。

这些都是关键因素，控制着测定结果的准确性和可信度。

因此，在实验室中必须做好准备，并且试剂、实验仪器要有正确的温度、湿度和搅拌速度，以保证实验的准确性和可靠性。

此外，实验室人员还需要做好安全防护措施，以防止接触有毒物质，确保实验的安全性。

总之，测定H2O2的Km值是比较复杂的，需要安全准备、细心操作和合理数据分析，以获得准确、可靠的结果，为氧化解氧化反应提供参考。

过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐121140012一、实验目的1. 了解米氏常数的测定方法2. 学习提取生物组织中的酶二、实验原理1.米氏反应动力学米氏方程(Michaelis-Menten Equation):2.米氏常数的意义：①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无关。

②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。

其数值大小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。

③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶的最适底物。

3.米氏常数的求法：该方法的缺点是难以确定最大反应速度Vmax。

该作图法应用最广。

但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。

因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。

此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。

[S]<<Km时图形近于水平线，[S]>>Km时直线将在原点附近与轴相交。

4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：①POD：过氧化物酶②SOD:超氧化物歧化酶③CAT：；过氧化氢酶5.过氧化氢酶的作用：植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。

过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。

氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。

过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。

6.过氧化氢酶活力的测定方法：①紫外吸收法：过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。