ELISA测定中影响因素简析

ELISA试剂盒试验的影响因素
ELISA试剂盒，即酶联免疫法。

ELISA法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，并具有操作简便、无放射性危害的优点，因而多年来广泛应用于各高校、医院、血站和科研机构的实验室中。

影响ELISA实验的因素：
我们技术人员通过几年的实验观察，认为影响ELISA实验的因素有如下三方面：
一、试剂盒
1、抗原、抗体活性对效价的影响：主要是试剂中抗体（或抗原）的效价降低或失活，结果不易判断。

再有ELISA试剂盒灵敏度高，对杂质的反应灵敏度也高，实验中空白对照OD值偏高或假阳性；
2、酶结合物浓度过高，也会导致OD值假性增高。

二、试验仪器
1、加样器是否经过校正，酶免测定血清用血量很少，如手工加样器的性能不好，吸取样品不，会使结果忽高忽低；
2、每次洗板前，应检查洗板机针孔有无堵塞。

三、操作
1、检测前先将试剂盒从冰箱取出置室温平衡20min后使用，试剂用完及时放回冰箱冷藏，以免造成试验结果假性降低；
2、加样时注意勿触及包被板底部，以免擦伤包被物使抗体（抗原）脱落而影响实验结果的准确性；
3、洗涤不充分，会使结果假性增高，过分洗涤呈假阴性；
4、比色时应保持包被孔底部无异物、无水汽，特别是冬季板从37℃水浴箱取出时，底部留有水汽，应将板底擦干后进行比色，水汽或孔内气泡也会使OD值升高；
5、抗原与抗体反应达到平衡，依赖于温度与时间。

温度高于45℃易引起失活及标记物脱落，温度低于4℃，影响反应速度。

总之，由于ELISA试剂盒实验的影响因素较多，在实际工作中操作规范、仔细，避免和排除各种因素的影响，使之得到准确可靠的检验结果。

影响ELISA试验因素叙述酶联免疫吸附试验（Enzyme—Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到快速的发展和广泛应用。

尽管早期的ELISA由于特异性不足高而阻碍了其在实际中应用的步调，但随着方法的不绝改进、料子的不绝更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便应用和标准化，从而使其成为广泛应用的检测方法之一、基本原理：ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会转变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。

滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，显现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。

此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

一、试剂的影响因素：应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。

试剂应妥当保管于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。

试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。

过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。

二、影响因素：酶联免疫（ELISA）是目前检验科常用的免疫学检测方法之一，其操作简单，无须特殊设备，使其在各级医院都有应用。

但是，假如忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性，因此，了解影响试验的因素，减少过错事故的发生是极其必需的。

ELISA检测的影响因素的分析【关键词】 ELISA检测；影响因素；分析ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。

Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为“enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”。

由于ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定［1］。

如乙肝、丙肝抗体等等。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。

本文就ELISA检测的影响因素做如下讨论。

1 标本的影响1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性［2］。

所以严重溶血标本禁用。

1.2 标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。

1.3 标本保存不当在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。

1.4 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性最好使用真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。

1.5 标本凝固不全在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。

一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30~60 min，各试剂在使用前充分混匀。

②酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。

二、操作不当导致1、加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异；2、除包被外，都宜采取45°加样，且要避免加到侧壁上；3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会对结果造成较大影响。

4、孵育时间过长，会导致非特异性反应增强；5、显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数；6、酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴；7、贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。

8、Elisa实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空白值或背景值升高。

三、检测样品处理不当引起溶血或污染1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；2、待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；3、在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；4、标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。

如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。

为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。

5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。

此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可，产生泡沫或样品的过度混合将引起血清蛋白的变性。

浅谈ELISA的影响因素ELISA即酶联免疫吸附试验,ELISA是一种敏感性高、重复性好的固相酶联免疫测定广泛用于各种抗原抗体的检测,但影响因素较多,有时易出现假阳性或假阴性,本文重点针对内源性、外源性因素对ELISA测定结果的影响进行探讨。

标签：酶联免疫吸附试验(ELISA);测定结果;影响因素如今病毒性疾病的诊断主要依赖对其抗原、抗体的检测。

而检测方法大多采用酶联免疫吸附试验(ELISA),如何保证实验结果的准确性,现结合自己的实际工作经验,总结了下列影响因素,希望对检验工作者有所帮助。

1内源性干扰因素1.1类风湿因子(RF)在类风湿患者、其他自身免疫性疾病及正常人的血清中,常含有较高或不同浓度的RF,RF一般为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。

用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可以充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。

1.2补体补体易激活C1q起到铰链作用,结果易出现假阳性。

1.3嗜异性抗体人类血清中含有天然的嗜异性抗体,将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,造成假阳性。

1.4自身抗体由于B细胞的超反应性,患者血清中常出现一些自身抗体,能与靶抗原结合形成复合物。

1.5溶菌酶可致假阳性。

2外源性干扰因素2.1标本溶血,分离不完全、加有血球。

2.2标本被细菌污染。

2.3标本储存时间过长。

2.4标本凝固不全。

2.5冰冻保存标本反复冻融。

2.6试剂在室温下平衡<30分钟,配洗液的水不符合要求。

2.7加样速度过快,加样时加在孔壁上或产生气泡。

2.8温育时关键因素之一,尽量选择温度低的,温育时间长的试剂盒。

2.9洗涤要彻底。

2.10双波长比色可减少容器上的划痕和指印等造成的光干扰。

2.11试剂质量的影响。

选用高质量的试剂是保证结果准确的关键因素之一。

3高值鉤状效应(HOOK效应)在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时出现钩状效应。

过量抗原分别和固相抗体和酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常规法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应,因为标准曲线到达高峰后钩状弯落。

影响ELISA试验结果操作的因素总结操作的影响因素酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一种特别的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上进展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果推断较为客观，是目前试验室检测抗原抗体*经济、*普遍的试验诊断方法。

影响ELISA试验结果操作的因素总结如下：1 、试剂的预备试剂的质量如抗原抗体的纯度及亲和力、标记物的比活性、滴度及特异性等直接影响检测结果，为保证检测质量，全部试剂必需经国家食品药品监督管理总局注册批准、批检测合格，临床评估特异性、敏感性、稳定性较高且在有效期内才有使用价值。

不同厂家试剂敏感性、特异性不尽相同，有报道不同厂家酶标板孔间 A 值差大小可达 15%，标记酶的活性及显色液的稳定性也相差较大，所以合理有效的试剂选择尤为重要，对 ELISA 试剂盒应正确选择，定期评价并建立科学的接收标准，结合常规血液筛查状况，对实际的均一性、适用性、稳定性，选出灵敏度、特异度及精密性合适的试剂保证检测结果的精确。

有报道不同厂家-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶结合物溶液对检测结果有区分，配制抗 HCV-cAg 酶结合物溶液前应检测小鼠-IgG 与产品的适配性。

其次试剂盒的储存方式、运输条件及有效期均为影响检测结果的重要因素，试剂盒一般2~8℃冰箱保存，留意不要紧贴冰箱储存室后壁以防止试剂冻结失效，可避开使用时试剂受温差影响导致酶标板上凝集小水珠及反应消失温差而影响抗原抗体的反应。

使用前需将试剂盒放置37℃恒温箱温育30min，且不同厂家、不同批号的试剂不能混合使用。

剩余试剂应准时放入干燥剂密封保存在2~8℃冰箱，试剂打开后一周内有效，同时留意做好室内质检，确保试验结果的牢靠性。

不同方法学的检验试剂会使乙肝两对半结果消失不同，如临床操作中电化学检测 HBsAg 呈阳性，而采纳 ELISA 检测则呈阴性，此外，使用单抗或多抗试剂对检测结果同样造成肯定的影响。

酶联免疫吸附试验影响因素探讨【摘要】ELISA法具有灵敏高、特异性强、重复性好的特点。

被广泛用于临床上多种疾病的检查、诊断，但在标本的采集、试剂的质量、操作的程序、结果的判断等方面受人为的因素影响较多，为了确保ELISA的准确度和精密度，保证临床安全用血，笔者就实际工作中常见的试验影响因素进行了总结探讨。

1 标本的采集1.1 防止污染血液标本的采集做到一人一针一管，吸样时，必需使用一次性移液嘴，以防污染。

1.2 及时测定血样采集后应及时检测，久置后细胞代谢，细菌繁殖，增加了许多异性物质，易产生溶血。

如不能及时测定，应将标本血清分离后放置在4℃冰箱中保存，但不超过3 d。

1.3 避免稀释标本在留取时，不能采用被保养液(抗凝剂)稀释后的抗凝血进行测定，否则被检测物的浓度降低，结果出现假阴性。

2 试剂的影响2.1 目前卫生部国家药品生物制品研究所对国内应用甚广的ELISA试剂，按照国家标准实行“批批检”，凡合格者，贴上国家防伪标签才能使用。

如HBsAg、抗,HCV、抗,HIV抗体等。

2.2 不同批号、不同厂家的试剂，由于酶标记物中酶的浓度不尽相同，与固相载体上的相应抗原或抗体发生特异性反应的程度不同，故不能混合使用。

对于超过有效期的试剂则严禁使用。

2.3 试剂的运输、贮存要在低温(2～8℃)条件下进行。

因酶类物质是一种特殊的蛋白质，久置、反复冻融或受热后，酶易失去活性，合格试纸条如果一次用不完时，应进行密封保存防止受潮。

3 操作的要求3.1 不同厂家生产的试剂其样品加入量、水浴时间、阴阳对照等各不相同，应严格按照说明书中要求进行，吸样要准确，试剂加入的顺序不能颠倒，每一步加样后均需在振荡器上充分混匀。

3.2 洗涤的效果直接影响实验结果的准确性。

每次洗板之前要配制新鲜的洗涤液，室温较低时，洗涤液要在水浴箱中先预温30 min。

用洗板机进行洗板时，每次都要吸净孔内洗液且不能留有气泡，倾去洗液时，必需用吸水纸吸尽洗液。