高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察

高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。

分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。

（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。

填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。

甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。

（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。

第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。

分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。

2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。

按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。

用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。

极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。

第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。

通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

高效液相色谱柱效能的评定1. 实验目的和要求1.1了解高效液相色谱仪的基本结构。

1.2初步掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。

1.3学习高效液相色谱柱效能的评定及分离度的测定方法。

2. 实验原理苯、萘、联苯分子非极性部分的总表面积不同，缔合能力不同，其保留时间也不同。

通过计算色谱峰的理论塔板数以及各个化学物质间的分离度评价色谱柱的效能。

3. 实验仪器与试剂3.1 仪器高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）分析天平3.2 试剂苯、萘、联苯（均为分析纯）甲醇（色谱纯）纯净水4. 实验步骤4.1 色谱条件色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm流动相：甲醇-水（80：20，v/v）流速：1mL·min-1检测波长：254nm柱温：30℃进样量：10μL4.2 操作步骤分别精密配制含苯、萘、联苯浓度均为约1mg·mL-1的3份对照品溶液各10mL。

● 分别精密吸取上述对照品溶液各2mL 置于10mL 容量瓶中，加流动相稀释，并定容至刻度，摇匀，得到含苯、萘、联苯的混合对照品溶液。

● 按照上述色谱条件操作，进样，记录色谱图。

● 计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。

4.3 实验数据处理● 记录实验条件，测试各试样后记录苯、萘、联苯的保留时间、峰宽、半峰宽，计算出各物质对应的理论塔板数。

根据保留时间与峰宽信息，计算相邻物质对间的分离度。

● 柱效计算式中：t R 为峰值保留时间（min ），W 1/2为半峰宽（min ），W 为峰宽（min ）●式中：t R1和t R2分别为相邻两组分的峰值保留时间（min ）W 1和W 2分别为相邻两组分色谱峰的峰宽（min ）5. 问题与讨论2212)(54.5)(16W t W t n R R ==5.1 如何用实验方法判别色谱图上苯、萘、联苯的色谱峰归属？5.2 如何改变色谱条件，可以减小苯、萘、联苯的保留时间？5.3若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改变实验条件以获得改善？。

现代食品检测技术第一部分——色谱分析——高效液相色谱第七章高效液相色谱分析法High performance liquid chromatograph 第一节高效液相色谱的特点与仪器第二节主要分离类型与原理第三节液相色谱的固定相与流动相第四节影响分离的因素与操作条件的选择第五节新型液相色谱简介2010-1-25第一节高效液相色谱的特点与仪器2010-1-25一、高效液相色谱法的特点在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论。

在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。

高效液相色谱法的突出特点：1）高效（柱效约为30000n /米）2）高速（较经典色谱法））3）高压（150 -350*105Pa4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光：10-11g ）2010-1-251. HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1）经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1～3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀；常压输送流动相，柱效低（H↑，n↓）；分析周期长、无法在线检测。

2）HPLC：分离和分析柱内径2～6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）；高压泵输送流动相，柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩短、可以在线检测。

2010-1-252. HPLC与GC差别9相同：兼有分离和分析功能，均可以在线检测9主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别1）分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，仅能分析有机物的20％。

HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80％。

2010-1-252）流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3）操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大）2010-1-25二、液相色谱仪器2010-1-25三、流程及主要部件Process and main assembly of HPLC 1.流程2010-1-252.主要部件(1) 高压输液泵♥主要部件之一，压力：150～350×105Pa。

高效液相色谱柱柱效测定一、实验目的1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理2．学习高效液相色谱仪的使用3．学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法二、基本原理高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。

气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即：式中：t R为组分的保留时间Y1/2为色谱峰的半峰宽度Y为色谱峰的峰底宽度三、仪器和试剂1．仪器1：KLC321型高效液相色谱仪（紫外检测器）2．仪器2：Agilent 1200 高效液相色谱仪（紫外检测器）3．50μl微量进样器4．试剂：苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯；纯水为重蒸的去离子水。

配制成含苯、萘、联苯各30μl/ml 的甲醇溶液。

四、实验条件1．色谱柱1 长15cm，内径 4.6mm，装填10mm的C-18烷基键合固定相2．色谱柱2.. 长15cm，内径 4.6mm，装填5mm的C-18烷基键合固定相3．流动相甲醇:水（85:15），流量0.8ml/min4．紫外光度检测器波长254nm，灵敏度0.085．进样量 5μl五、实验步骤1．根据实验条件和实验录像指导，按KLC321仪器操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，色谱工作站之“采样系统”基线平直时，即可进样。

2．吸取5μl苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，并用色谱工作站记录色谱数据，同时记录色谱数据文件名。

3．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。

4. 在Agilent 1200仪器上测定色谱柱2的塔板数，打印色谱图并比较色谱柱柱效差异。

六、数据记录及处理1．记录实验条件。

（1）色谱柱与固定相（2）流动相及其流量、柱前压（3）检测器及其灵敏度（4）进样量2．记录色谱峰的保留时间t R和相应色谱峰的半峰宽Y1/2。

3．分别计算苯、萘、联苯在该色谱柱上的理论塔板数n和理论塔板高度。

通则0512高效液相色谱法--)日26月3年-(-2016．18) 页药典四部60日） (26（ 2016年3月 0512高效液相色谱法通则2 /高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；18) 页60） (药典四部3（ 2016年月26日高效液相色谱法通则0512/ 3常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

．18) 页药典四部6026日） (（ 2016年3月 0512通则高效液相色谱法4 /温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察一、实验目的1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理2．学习高效液相色谱仪的使用3．学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法4．考察流动相配比对分离情况的影响二、基本原理高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。

气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即：222/11654.5⎪⎭⎫ ⎝⎛=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛=Y t Y t n R R 式中：t R 为组分的保留时间Y 1/2为色谱峰的半峰宽度Y 为色谱峰的峰底宽度影响高效液相色谱分离的因素很多，其中，流动相的种类及配比是最重要的参数。

三、仪器和试剂1．仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪（紫外检测器）2．50μL 微量进样器3．试剂：苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯；纯水为重蒸的去离子水。

配制成含苯、萘、联苯各30μL/ml 的甲醇溶液。

四、实验条件1．色谱柱 长15cm ，内径 4.6mm ，装填5μm 的C-18烷基键合固定相2．流动相 组成1：甲醇:水（95:5）；组成2：甲醇:水（85:15）；流量均为0.8ml/min3．紫外光度检测器 波长254nm4．进样量 5μL五、实验步骤1．设定流动相为“组成1”的比例，按照标准操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，且色谱基线达到平直时，开始进样。

2．吸取5μL 苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，在此条件下用色谱工作站记录色谱数据。

3．改变流动相比例至“组成2”，待平衡后重复步骤2操作。

4．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。

六、数据记录及处理1．记录实验条件。

（1）色谱柱与固定相（2）流动相及其流量、柱前压（3）检测器波长（4）进样量2．分别记录三个组分色谱峰的保留时间t R 和相应色谱峰的半峰宽Y 1/2。

实训项目十四高效液相色谱柱的性能考察及分离度测试一、实验目的1. 了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，初步掌握其操作技能。

2. 学习高效液相色谱柱效能的评定及分离度的测定方法。

3. 了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。

二、实验原理在高效液相色谱中，若采用非极性固定相（如十八烷基硅烷，辛烷基硅烷等）、极性流动相（由水和一定量的与水互溶的极性调节剂组成，如甲醛、乙腈等），即构成反相色谱分离系统。

反之，则称为正相色谱分离系统。

反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。

这种分离方式适合于同系物、苯并系物等。

萘、联苯、菲在十八烷基硅烷键合硅胶柱上的作用力大小不等，它们的分配比不等，在柱内的移动速率不同，因而随流动相流出柱子的时间顺序有先后之分。

定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。

分离度：R==柱效( 理论板数)：n=5.54()2=16()2三、主要仪器与试剂1．仪器高效液相色谱仪（配有紫外检测器）；分析天平；C18色谱柱；超声波清洗器；流动相过滤器；容量瓶；吸量管；10μL平头微量进样器。

2．试剂苯、萘、联苯、正己烷等均为分析纯；甲醇（色谱纯）；高纯水。

四、操作步骤1．色谱条件色谱柱：长150nm，内径4.6nm，装填5μm的C18烷基键合固定相柱温：室温流动相：甲醇-水(87 :13)，流量1.0mL·min-1紫外检测器：波长254nm，灵敏度0.080。

进样量：3μL。

2．标准溶液的配制①标准贮备液配制含苯、萘、联苯各1000μg·mL-1的正己烷溶液，混匀备用。

②标准使用液用上述贮备液配制含苯、萘、联苯各10μg·mL-1的正己烷溶液，混匀备用。

3．色谱测定①按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动在线工作软件，设定操作条件。

至系统稳定、基线平直后，即可进样。

②吸取3μL的样品进样，记录各组分色谱峰的保留时间、峰面积及分离比，再重复进样两次。

实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。

2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。

3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。

二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。

在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。

反之，则称为正相色谱分离系统。

反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。

定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。

分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(Y1/2＋Y1/2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； Y1/2 与Y1/为此相邻两峰的半峰宽。

除另外有规定外，分离度应大于1.5。

本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。

它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。

但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。

待测物性质见表1。

表1色谱柱测试条件出峰次序样品组成1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP）2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。

三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。

2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：苯基柱，柱温：室温流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％检测器：DAD检测器(二极管阵列检测器)；检测波长：220nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。

高效液相色谱法《中国药典》2015年版高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2～8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

高效液相色谱柱效能的测定高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它的基本概念及理论基础，如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度等，与气相色谱是一致的。

但又有不同之处。

高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点。

(1)流动相的不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力;(2)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4～5个数量级;(3)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配制成二元或多元体系，满足梯度洗提的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率 (柱效能)；（4）高效液相色谱采用5～10μm细颗粒固定相，使流动相在色谱柱上渗透性大大减小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相;(5)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、萤光光度检测器等。

与气相色谱相比较，高效液相色谱同样具有高灵敏、高效能和高速度的特点，但它的应用范围更加广泛。

据估计在自然界数百万种有机化合物中，仅有20%可以不经过化学预处理，直接采用气相色谱分析。

而对于总数的75%～80%,则可采用高效液相色谱进行分离分析，特别是许多高沸点、难挥发、热稳定性差的物质,如生物化学制剂、金属有机络合物等物质的分离分析，尤需借助于高效液相色谱方法。

目前高效液相色谱已得到愈来愈广泛的应用。

根据固定相的类型和分离机制，高效液相色谱可分为:液-固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱等几大类。

高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中采用保留值定性，或与其他定性能为强的仪器分析法联用，如与质谱法、红外吸收光谱法等联用。

在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分试样时，有些组分常不能出峰。

实验八 高效液相色谱柱效能的测定一、目的要求（1）学习高效液相色谱柱效能的的测定方法；（2）了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，初步学习操作方法。

二、实验原理对色谱体系，色谱柱的柱效能，可以定量地用理论塔板数N 来表示：222/1)(16)(54.5Yt Y t N R R == 速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响HPLC 柱效的各种因素，同样具有指导意义：Cu uBA H ++= 由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项（uB）对色谱峰扩展的影响可以忽略，而传质阻力项Cu 则成为影响柱效的主要因素。

因此，提高柱内填料装的均匀性和减小粒度，以加快传质速率，可以提高柱效能。

除上述因素以外，还应考虑一些柱外展宽的因素，其中包括进样器的死体积和进样技术等所引起的柱前展宽，以及由柱后联结管、检测器流通池体积所引起的柱后展宽。

三、仪器与试剂1.仪器 岛津LC-10A ( Shimadzu, Japan)高效液相色谱仪，SPD-10A 紫外可见波长检测器和SCL-10ASP 色谱数据处理器(日本岛津公司)。

超声波清洗器2.试剂 甲苯、萘、联苯、甲醇（色谱醇）、正已烷 （A.R ）. 标准溶液配制（1）甲苯标准储备液(1.0000 g ⋅L -1) 准确称取0.0100ｇ甲苯,在10mL 容量瓶中用正己烷定容。

（2）萘标准储备液(1.0000 g ⋅L -1) 准确称取0.0100ｇ萘，溶于正己烷中，在10mL 容量瓶中用正己烷定容。

（3）联苯标准储备液(1.0000 g ⋅L -1) 准确称取0.0100ｇ联苯，溶于正己烷中，在10mL 容量瓶中用正己烷定容。

（4）甲苯标准使用液，吸取上述甲苯标准储备液0.3 mL 、0.6 mL 、0.9 mL 、1.2 mL 、1.5 mL ，于10mL 容量瓶中用正己烷定容。

（5）萘标准使用液，吸取上述萘标准储备液0.3 mL 、0.6 mL 、0.9 mL 、1.2 mL 、1.5 mL ，于10mL 容量瓶中用正己烷定容。