填充色谱柱的柱效测定

高效液相色谱法高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录V D)系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪,由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成,仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期鉴定并符合有关规定。

1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。

反相色谱系统使用非极性填充剂,以十八烷基键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。

正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。

离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性填充剂。

填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充,直接影响供试品的保留行为和分离效果。

孔径在15nm(1nm=10?)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物,分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。

除另有规定外,分析柱的填充剂一般在3~10μm之间。

粒径更小(约2μm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。

使用微径柱时,输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要,色谱条件也需作适当的调整。

当对其测定结果产生争议时,应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。

以硅胶为载体的键合固定相的使用温度不超过40℃,为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度,但不宜超过60℃。

流动相的pH指应控制在2~8之间。

当pH指大于8时,可使载体硅胶溶解;当pH指小于2时,与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。

当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时,应选用耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时,应选用耐酸的填充剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂,或有机-无机杂化填充剂等。

1.典型的色谱图在用热导检测器时，往色谱仪中注入带有少量空气的单一样品时，得到图1-3-4的典型气相色谱图。

在图1-3-4中当没有样品进入色谱仪检测器时0t是噪声随时间变化的曲线，一般是一条直线，叫作“基线” 。

h是峰高，其他符号将在后边解释。

2. 区域宽度区域宽度是色谱流出曲线中很重要的参数，它的大小反映色谱柱或所选色谱条件的好坏。

区域宽度有以下三种表示方法：（1）半高峰宽（peak width at half height）（Wh/2）是在峰高一半处的色谱峰的宽度，即图 1-3--2中的CD ，单位可用时间或距离表示。

（2）峰宽（peak width）（W ）是在流出曲线拐点处作切线，在图1-3-2中于基线上相交于E，F 处，此两点间的距离叫峰宽，有些色谱书上叫做“基线宽度” 。

（3）标准偏差（σ ）在图 1-3-2中AB距离的一半叫标准偏差。

在这三种表示方法中以前两者使用较多，三者的关系是：3. 保留值（retention value）保留值是总称，具体参数的名称有以下一些：（1）死时间（dead time）(tM) 一些不被固定相吸收或吸附的气体通过色谱柱的时间，如用热导池作检测器时，从注射空气样品到空气峰顶出现时的时间，以s或min为单位表示。

（2）死体积（dead volume）（Vm）指色谱柱中不被固定相占据的空间及进样系统管道和检测系统的总体积，等于死时间乘以载气的流速。

（3）死区域（dead zone）（ Vg）指色谱柱中不被固定相占据的空间。

（4）保留时间（retention time）（ tR）从注射样品到色谱峰顶出现时的时间，以s或min为单位表示。

（5）调整保留时间（adjusted retention time）保留时间减去死时间即为调整保留时间（tR-tM）。

（6）保留体积（retention volume）（ Vr）从注射样品到色谱峰顶出现时，通过色谱系统载气的体积，一般可用保留时间乘载气流速求得，以mL为单位表示。

色谱柱柱效标定方案：我们目前的柱子均是很新的色谱柱，但是随着时间推移，柱子的柱效会越来越低，此外我们可能要借用QC或者二楼的比较老的色谱柱，来进行方法开发或者验证与样品测定。

用柱效差的色谱柱可能误导我们实验的方向，以及影响实验的测定结果。

总之因为种种原因，在使用一根色谱柱前，对其进行柱效标定已经显得尤为必要，因此制定本方案，来对柱子柱效进行测定。

对于如下情况，我们在使用色谱柱前需要对其进行柱效测定，且柱效测定时不要接保护住：1.柱子使用两年之后且柱效明显下降的情况下再启用。

2.柱子用过离子对试剂之后，再使用的。

3.其它特殊原因：如柱子经过反接后使用的。

不耐受纯水的柱子经纯水相冲洗的。

超过柱子柱温或者pH耐受范围使用的等。

因为柱子的种类很多，C18、C8、苯基柱、氨基柱、氰基柱、离子交换柱、手性色谱柱、聚合物型色谱柱等等。

不同填料的柱子可能需要选用不同的标准物质对其柱效进行标定。

我们报买色谱柱后首先要保留其使用说明书，以备经后柱效标定时参考。

因为柱子说明书上一半都会有该色谱柱的柱效标定出厂报告以及其合格接受标准。

对于实在无法找到使用说明书的柱子我们可以根据其性质来拟定一个通用的标定规则。

1.C18、C8类型色谱柱：对于该类型色谱柱，一般常用含苯环化合物进行柱效标定。

常见的如：苯、苯酚、甲苯、萘、尿嘧啶等。

理论塔板数不低于2000/米。

拖尾因子在0.9~1.1之间。

最终柱效的接收标准还是首选参考柱说明书的要求来定。

例如：UV254nm检测波长；乙腈-水（60:40）或甲醇-水（70:30）等度洗脱15min，进样体积10μl。

2.氨基柱该种类型色谱柱常用于糖类物质测定，可以选择常见类型的糖类，并选用视差或者ELSD、CAD等通用型检测器对柱效进行标定。

常见的可以选用甘露醇、乳糖等物质标定，理论板数不低于8000。

以TOSOH TSKgel Amide-80 5μm4.6*250mm柱为例：采用RI检测器，75%乙腈作为流动相，1.0ml/min流速，25℃柱温，2g/L的甘露醇（75%乙腈溶解）作为供试品溶液，进样20μl。

色谱柱柱效关于“色谱柱柱效”色谱柱是色谱分析中的核心部件，其质量的好坏对于分析结果具有重要的影响。

色谱柱柱效是衡量色谱柱品质好坏的重要指标。

本文将对色谱柱柱效进行详细介绍。

一、什么是色谱柱柱效？色谱柱柱效是用于描述色谱柱分离性能的一个指标，用来反映某一物质在色谱柱中距离占总色谱柱长度的百分数，即某一物质在色谱柱中的保留时间。

通俗地说，色谱柱柱效就是描述色谱柱在分离上表现的能力或强度的量化指标。

色谱柱柱效的高低取决于柱内填料的特性和柱的设计。

它与分离石英管的长度和直径、填料颗粒大小、填料类型、填充密度等有关。

二、色谱柱柱效的计算方法在分析中，某一物质在色谱柱中的保留时间（tR）除以色谱柱的总长度（L）即可得出该物质在色谱柱中占据的百分比，即柱效（N）。

柱效（N）=保留时间（tR）/ 总柱长（L）×100%其中，保留时间的计算方法是在一定的条件下，测量该物质的到达时间（ta）和流出时间（tf）后，减去流出时间，即tR=tf – ta。

三、如何影响色谱柱柱效？总的来说，影响色谱柱柱效的因素主要有以下几点：1、填料类型锥形管填充材料是影响柱效的重要因素之一。

柱效随填料活性的增加而增加。

2、填料粒径填料粒径可以影响柱效。

通常情况下，细小的颗粒（即小粒径）的柱比粗颗粒（大粒径）的柱效果更好。

3、填料形状填料形状也会影响色谱柱柱效。

颗粒形状越规则，柱效越高。

4、柱直径随着柱直径的不断增加，柱效不断降低。

5、流速在某些情况下，流速的增加可能会提高柱效。

但随着流速的继续增加，柱效会逐渐降低。

四、如何提高色谱柱柱效？了解了色谱柱柱效的影响因素后，提高色谱柱柱效的方法也就很清晰。

1、选择合适的填料和填料粒径，根据分析需要进行选择，最大化柱效的作用。

2、保持柱内工作温度的稳定。

在色谱柱用于样品分离过程的过程中，温度波动会导致柱效下降。

3、注意选择适当的流量。

流量过大或过小都会影响柱效。

4、柱的维护保养。

柱就像人的身体一样，需要保持良好的状态才能发挥出良好的性能。

c18柱色谱填料使用
C18色谱柱是一种常用的色谱柱，其填料具有亲脂性，常用于反相色谱中。

以下是使用C18色谱柱的注意事项：
1. 流动相的选择：C18色谱柱通常使用正己烷和甲醇作为流动相。

正己烷可以增加分离物与固定相的相互作用力，甲醇则有助于溶解非极性溶剂。

根据分析需要，可以调整正己烷和甲醇的比例。

2. 预处理：在使用C18色谱柱之前，需要进行预处理以去除可能存在的杂质和保证柱子的稳定性。

常见的预处理方法包括使用高压液相系统进行洗脱、使用有机溶剂或酸碱溶液进行洗脱等。

应避免用过酸性或过碱性的洗脱剂，以免对C18柱填料造成损害。

3. 样品准备：样品的溶解度和纯度对分离效果有很大影响，因此在分析前需要充分溶解样品，并通过滤器除去杂质。

4. 色谱柱平衡：在使用C18色谱柱之前，需要将其平衡至最佳状态。

可以通过逐步增加流动相的流速并监测基线来找到最佳流速。

在达到最佳流速之前，应缓慢增加流速以避免对色谱柱造成过度压力。

5. 柱效测定：在使用C18色谱柱之前，需要测定其柱效。

可以通过使用标准品进行测定，并比较标准品和样品的保留时间和峰形来进行评估。

6. 清洗和维护：在使用C18色谱柱过程中，需要定期清洗和维护以保持其性能和寿命。

需要定期更换流动相、清洗柱子并检查其性能。

总之，使用C18色谱柱需要了解其特点和注意事项，并进行充分的预处理、样品准备、色谱柱平衡、柱效测定以及清洗和维护。

这些步骤对于获得准确、可靠的色谱结果非常重要。

实验1 气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定一、目的要求1.了解气相色谱仪的基本结构、工作原理与操作技术；2.学习选择气相色谱分析的最佳条件，了解气相色谱分离样品的基本原理；3.掌握根据保留值，作已知物对照定性的分忻方法。

4.掌握归一化法测定混合物各组分的含量。

二、基本原理气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。

由于物质的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定时间的流动后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。

根据出峰位置，确定组分的名称，根据峰面积确定浓度大小。

对—个混合试样成功地分离，是气相色谱法完成定性及定量分析的前提和基础。

而其中气相色谱分离条件的选择至为关键。

主要涉及以下几个方面：1. 载气对柱效的影响：载气对柱效的影响主要表现在组分在载气中的扩散系数D m(g)上，它与载气分子量的平方根成反比，即同一组分在分子量较大的载气中有较小的D m(g) 。

根据速率方程：（1）涡流扩散项与载气流速无关；（2）当载气流速u 小时，分子扩散项对柱效的影响是主要的，因此选用分子量较大的载气，如N2、Ar，可使组分的扩散系数D m(g)较小，从而减小分子扩散的影响，提高柱效；（3）当载气流速u 较大时，传质阻力项对柱效的影响起主导作用，因此选用分子量较小的气体，如H2、He 作载气可以减小气相传质阻力，提高柱效。

2. 载气流速（u）对柱效的影响：从速率方程可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，所以要使理论塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。

对于选定的色谱柱，在不同载气流速下测定塔板高度，作H-u 图。

色谱柱柱效的评价和提高方法总结
柱效
色谱柱的柱效能是评价色谱性能的一项重要指标，混合物能否在色谱柱中得到分离，除取决于选择合适的固定相外，还与色谱操作条件及色谱柱的装填状况等因素有关。

在一定的色谱操作条件下，色谱柱的柱效可用理论塔板数或理论塔板高度来衡量。

一般说来塔板数愈多，或塔板高度愈小，色谱柱的分离效能愈好。

如何对柱效进行评价
实验仪器与试剂
仪器：高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）、分析天平。

试剂：苯、萘、联苯（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）、纯净水。

实验步骤
色谱条件：色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm；流动相：甲醇-水（80：20，v/v）；
检测波长：254nm；流速：1mL·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL。

操作步骤：
分别精密配制含苯、萘、联苯浓度均为约1mg·mL-1的3份对照品溶液各10mL。

分别精密吸取上述对照品溶液各2mL置于10mL容量瓶中，加流动相稀释，并定容至刻度，摇匀，得到含苯、萘、联苯的混合对照品溶液。

按照上述色谱条件操作，进样，记录色谱图。

计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。

实验数据处理。

色谱柱的柱效指标为1色谱柱的概念色谱柱（Column）是色谱仪器的主要部件，也是色谱固定相分离的重要组成部分，它将溶剂和样品混合液平均分散在色谱固定相上，允许样品和溶剂流经色谱柱，从而达到对混合物进行色谱分离的目的。

色谱柱中间被填充有一种吸附材料，用于将混合溶液中按分子结构差异进行分配，根据其能够实现定性和定量检测的特性，色谱柱现已成为分析化学和生物化学中最常用的仪器之一，广泛应用于药物分析、食品分析、化工类检测等多个领域。

2色谱柱的类型色谱柱的类型有很多，例如：长度纤维柱、钻石柱、油管柱、立体柱等，它们均可以根据用户的不同需求进行搭配，以实现最佳的色谱效果和最佳的色谱效率。

除了上述几种标准的色谱柱，还有一些特殊的可替换柱，它们可以更有效地改变样品的流速，以提高柱效指标。

3色谱柱的柱效指标色谱柱的柱效指标是指由色谱柱进行分离的样品的有效度，常用的柱效指标包括柱效（Column Efficiency）、峰宽（peak width）和不均匀度（unevenness）。

柱效是色谱柱的一个重要指标，它反映了柱中分离混合溶液的能力，它是以每升样品经过柱时通过柱口体积（Cav）来表示的，其数值越高，柱效指标越高。

其他指标中，峰宽表示溶剂和样品组分从柱口压力出来的宽度；不均匀度表示柱中溶剂和样品组分有没有重结合该成不规则形状，它越低，柱效指标越高。

4色谱柱的应用色谱柱的应用十分广泛，可以用于实验室分析化学和生物学研究，也可以用于各种类型的产品实际检测，比如：药物分析，食品分析，精细化工检测，农产品分析等。

它还应用于八大类分子的检测，比如抗生素的分析检测，维生素的分析检测，矿物质的分析检测等，可以为我们带来更多丰富的知识以及深刻的认识，带来新的发展空间。

总之，色谱柱是色谱仪器中重要的部分，也是色谱仪器决定色谱效率和色谱效果的关键。

在实验室或检测领域中，使用不同种类的色谱柱根据分析要求，搭配合适的色谱仪器，可以达到色谱分析的最佳效果，帮助我们快速准确的分析检测更多的物质或物质，为我们的生活带来更多的快乐！。