Red重组技术研究进展

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细菌λ Red 重组技术的应用及其影响因素

细菌λ Red 重组技术的应用及其影响因素付喜爱;张德显;周维;于立辉;田春莲;刘明春【摘要】由λ噬菌体的exo、beta、gam 3个基因分别编码的Exo、Beta和Gam蛋白组成λ Red同源重组系统。

λRed重组是细菌靶基因置换的有效技术，该技术发展迅速，已广泛应用于大肠埃希菌等细菌染色体DN A的基因敲除、基因整合，可以对任何大小的DN A分子进行精确修饰。

利用λ Red重组系统不仅可以构建工程菌，还可以为研究细菌的致病机理和耐药机制提供新的方法。

然而，许多应用因重组频率而受到限制，影响重组频率的因素主要有底物浓度、同源片段的长度、内源性核酸酶、错配蛋白等。

论文综述了λ Red同源重组技术的应用进展及影响重组的因素，以期为优化重组试验方案及提高实验的成功率提供帮助。

%TheλRed homologous recombination system is consisted ofExo ,Beta and Gam protein ,which are encoded by exo ,beta ,gam intheλphage respectively .This system has got an increasing development because of its efficiency in gene replacement of bacteria .It has been widely used in bacterial gene replace‐ment including gene knockout and gene integration in E .coli genomic DNA ,precise modification without consideration of any molecule weight .TheλRed homologus recombination system can not only build engi‐neering bacteria ,but also can provide a new insight for mechanisms of drug resistance and pathogenicity in bacteria .However ,many applications are limited by its low recombination frequency .Reports indicated that many factors contribute to recombination such as concentration of substrate ,length of homologous fragment ,endogenous nucleases ,mismatch protein and so on .In thispaper ,the application and factors , which may influenceλRed homologous recombination ,were discussed in detail ,and aimed to optimize pro‐tocol and improve the efficiency in experiments .【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P91-95)【关键词】λRed同源重组;重组频率;底物;内源性核酸酶;错配蛋白【作者】付喜爱;张德显;周维;于立辉;田春莲;刘明春【作者单位】沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866【正文语种】中文【中图分类】Q78同源重组是指发生在姐妹染色体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，常用于基因敲除或者置换。

RedET同源重组技术概述

RedET同源重组技术概述RedET同源重组技术是一种利用酵母宿主的遗传重组系统，将目标基因在酵母中进行同源重组而得到转基因株系的技术。

该技术在生物医学和生物工程领域具有广泛的应用前景。

本文将对RedET同源重组技术进行概述并介绍其原理、应用以及存在的问题。

RedET同源重组技术的原理基于酵母自然发生的同源重组机制。

酵母是一种单细胞真核生物，其核糖体RNA和转录因子与哺乳动物的细胞中类似，使得酵母成为一种理想的宿主，用于表达复杂蛋白质的研究和生产。

在RedET同源重组技术中，采用了遗传重组系统来介导目标基因与酵母染色体发生同源重组，从而实现目标基因的插入和表达。

RedET同源重组技术的核心是一种诱导目标基因与酵母染色体同源重组的DNA修复机制。

该修复机制主要基于酵母中两个DNA重组酶RecE和RecT的相互作用。

RecE酶在酵母中识别并切割目标基因与酵母染色体之间的同源序列，形成单链切口。

然后RecT酶结合在切口上，介导目标基因与酵母染色体的DNA重组。

最后，通过酵母DNA修复机制，目标基因与酵母染色体实现了同源重组，并插入到酵母基因组中。

RedET同源重组技术具有广泛的应用领域，尤其在基因工程和蛋白表达中具有重要作用。

首先，该技术可以用于基因敲除和基因座替换，为基因功能研究提供了有效的手段。

其次，RedET同源重组技术也可以用于构建表达突变蛋白或蛋白片段的酵母株系，用于蛋白结构和功能研究。

此外，通过RedET同源重组技术，还可以构建酵母株系用于产生异源重组蛋白，并通过大规模筛选酵母株系实现高效蛋白生产。

然而，RedET同源重组技术在应用过程中也存在一些问题和局限性。

首先，该技术的目标基因与酵母染色体之间需要具有足够的同源性，这对于异源基因的插入造成了一定的限制。

其次，RedET同源重组技术在染色体插入位置的选择性方面存在一定的限制，这可能影响目标基因的表达水平和稳定性。

此外，酵母株系在目标基因插入后可能会发生染色体结构的重组和重排，这可能会对酵母的生长和基因表达产生影响。

Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用

Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用吕沈聪;赵颖颖;钟卫鸿【摘要】大肠杆茵基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟.综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势.%Gene knockout technique of Escherichia coli is developing rapidly.Emerging of various kinds of new technologies has simplified the genome modification of E.coli than before.Especially,the Red homologous recombination system becomes more and more mature in gene knockout of E.coll.In this article,a few different kinds of Red homologous recombination technologies were reviewed.The mechanism and application strategies of each method were analyzed with its characteristics and superiority highlighted.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2013(030)006【总页数】6页(P1-6)【关键词】大肠杆菌;Red同源重组;基因敲除【作者】吕沈聪;赵颖颖;钟卫鸿【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032【正文语种】中文【中图分类】Q78随着多种细菌基因组测序工作的完成，获得了大量的分子遗传学信息。

Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用

Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用李鑫;李亚芯;戴建君【摘要】基因敲除是研究基因功能最直接的方法.对于大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂.Red同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速、简单,在E.coli基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟.作者介绍了Red同源重组系统的组成和同源重组原理,阐述了常用的两步同源重组法敲除E.coli基因的操作步骤及注意事项.大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造、病原菌致病机理、耐药机制研究等领域做出巨大贡献,由于两步法仍保留有Red同源重组系统电转效率低、有序列残留的缺陷,作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍,通过对以上方法及应用进行综述,为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考.%Knock-out is the most direct way to exploregene''s function.The traditional method of Escherichia coli (E.coli) gene knock-out is to use its own RecA reorganization system, which relies onthe specific given cleavage sites of restriction enzymes, requires long homologous arm, furthermore, the operation is complex.Modification of the genome has become simple and rapid since the advent of Red homologous recombination method.And its application in E.coli gene knock-out has been more mature.The structure and functional principle of Red homologous recombination is introduced, besides, this review expounds the operating steps and notices of the common two-step Red-mediated recombination.The Red homologous recombination technologyin E.coli has made great contribution in the area of modifications ofengineering strain, pathogenicity and bacterial resistance of the pathogenic bacteria.Additionally,the advantages and shortcomings of the method are set forth.According to the disadvantage that the traditional method do leave recombinase recognition site scars and has low efficiency, a sum of classical methods for scar-less gene replacement are described in the final part of the article.These approach can provide better applications for the construction of E.coli genome.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)007【总页数】7页(P1934-1940)【关键词】大肠杆菌;Red同源重组;基因敲除;两步法【作者】李鑫;李亚芯;戴建君【作者单位】南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095【正文语种】中文【中图分类】Q784通过一定途径使基因去除或失活的技术称为基因敲除，又称基因打靶[1]，该技术可定向改造微生物，近年来已成为构建新型大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)生物工程菌的重要手段。

Red同源重组技术研究进展

Red同源重组技术研究进展Red 同源重组技术研究进展韩聪1,2张惟材1*游松2(1军事医学科学院⽣物⼯程研究所北京 100071 2沈阳药科⼤学沈阳 110016)摘要伴随着分⼦⽣物学的发展,⼀种基于噬菌体Red 重组酶的同源重组系统已应⽤于⼤肠杆菌基因⼯程研究。

Red 重组系统由三种蛋⽩组成:E xo 蛋⽩是⼀种核酸外切酶,结合在双链DNA 的末端,从5 端向3 端降解DNA,产⽣3 突出端;Beta 蛋⽩结合在单链DNA 上,介导互补单链DNA 退⽕;Gam 蛋⽩可与RecBC D 酶结合,抑制其降解外源DNA 的活性。

Red 同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率⾼的特点。

这种技术可在DNA 靶标分⼦的任意位点进⾏基因敲除、敲⼊、点突变等操作,⽆需使⽤限制性内切酶和连接酶。

此外,这种新型重组技术可直接将⽬的基因克隆于载体上,⽬的基因既可来源于细菌⼈⼯染⾊体也可是基因组DNA 。

Red 同源重组技术使难度较⼤的基因⼯程实验顺利进⾏,⼤⼤推动功能基因组研究的发展。

关键词 Red 同源重组基因打靶基因⼯程收稿⽇期:2003 08 05 修回⽇期:2003 11 03*通讯作者,电⼦信箱zhangweicai@/doc/c711836424.html同源重组是基因⼯程实验中常⽤的技术⼿段,在基因打靶和基因克隆⽅⾯具有重要作⽤。

常规的基因打靶技术是以Rec A 同源重组为基础,通常需要数百碱基甚⾄更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中⼤量重复序列的存在,⽽导致意外重排现象的发⽣。

B AC 、PAC 、YAC 等克隆载体的构建为基因克隆提供了有⼒⼯具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,⼤⼤限制了对⼤⽚段基因功能的研究。

近⼏年来,⼀种基于噬菌体Red 重组酶作⽤的同源重组技术逐渐成为基因⼯程研究的热点之⼀,并取得了⼀系列重要进展。

Red 同源重组技术的原理是将⼀段携带与靶基因两翼各有40~60bp 同源序列的PCR ⽚段导⼊宿主菌细胞,利⽤噬菌体Red 重组酶的作⽤,使导⼊细胞的线性DNA ⽚段与染⾊体(或载体)的特定靶序列进⾏同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所⽰)。

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

摘
要
重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术，可应用于靶 4*: 序列的敲入、敲除和
基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现，体外重叠 JL. 法难以获得高质量的目的 4*: 打靶片段，严重影响重组效率。为了解决上述问题，根据 ./3 重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用 JL. 方法合成 %1-= 和然后将其电击共转化进入携带 ./3 重组酶和 ;04*:"_8 载体 4*: 的大肠杆菌 4W""8 菌株 >+$ 两条末端互补的线性 4*: 片段，阳性率可达到 #^‘ ，内，经体内同源重组直接产生的 ;04*:" ) 8O %1-=O >+$ 环状重组质粒 4*: 分子可通过抗生素标记筛选获得，瞬时转染 ;04*:"_8O %1-=O >+$ 可获得绿色荧光蛋白在 !?" 细胞中的表达。关键词重组工程，基因体内融合，重组质粒构建 ./3 重组酶， ZN8! 文献标识码 : 文章编号 8$$$O"$98 （!$$%） $#O$^?NO$#
./0/12/3：4/0/56/7 8， !$$9；:00/;</3：+=>,=7- ?， !$$% ) （ *’) $9G:"!?） @A1B C’7D C=B B,;;’7</3 6- <A/ E7=>< F7’5 <A/ G/310=( H01/>0/ I’,>3=<1’> ’F JK: ) M N9O8$O99?#N%8"； PO5=1(： QA’,REST ;,6(10) 6<=) >/< ) 0> " L’77/B;’>31>E =,<A’7 ) @/(：全军医药卫生科研基金（ *’) $9G:"!?）资助。

RedET同源重组技术概述.pptx

引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求，重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体和插入片段的黏性末端（15-50bp）互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B）（图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。

采用Red重组系统敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因

ｒｉｃｈｉａ－ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒｐＵＣＰ，ａｎｄｔｈｅｐＵＣＰ — ＲｅｄｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＰＡＯ１ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｏ —
采用Ｒｅｄ重组系统敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因
余华，熊浚智，何晓梅，盛哈蕾，蔡文强，谢玮，张克斌
摘要：目的敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因，获得无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株。方法采用ＰＣＲ从ｐＫＤ４６质粒上扩增噬菌体的Ｒｅｄ重组酶基因，并将其克隆到大肠杆菌和铜绿假单胞菌穿梭质粒ｐＵＣＰ多克隆位点上，电击转化铜绿假单胞菌ＰＡＯ１感受态细胞，构建ＰＡＯ１／ｐＵＣＰ — Ｒｅｄ基因敲除体系。常规基因操作构建两端与弹性蛋白酶基因上、下游同源，中间为庆大霉素抗性基因的线性打靶片段；并将其电击转化ｐＵＣＰＲｅｄ／ＰＡＯ１感受态；采用庆大霉素和羧苄青霉
ＹＵＨｕａ，ＸＩＯＮＧＪｕｎ — ｚｈｉ，ＨＥＸｉａｏ — ｍｅ பைடு நூலகம் ，ＳＨＥＮＧＨａ — ｌｅｉ，ＣＡＩＷｅｎ — ｑｉａｎｇ，ＸＩＥＷｅｉ，ＺＨＡＮＧＫｅ — ｂｉｎ

RedET同源重组技术概述(PPT 49页)

Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、什么是Red/ET同源重组二、技术的特点三、作用机制四、功能元件五、操作流程及关键因素六、在基因工程中的主要应用七、新技术的发展八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法

Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用

［ｂｔｃ］ＲｄｂｓｄｒｃｍｉｅｒｇｉｄｖｌｉｇｒｐｄｙａｄｈｓｂｅｉｅｓｄｉＥｃｅｉｉｏｉｇｎｍｅＡｓａｔｒｅ－ａｅｅｏｂｎｅｉｓｅｅｐｎａｉｌｎａｅｎｗｄｌｕｅｎｓｈｒｈａｃｌｅｏｎｏｙｃ
综
述
Ｒｄ同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用ｅ
孙旭１，长林，２周方宏清
１．中国药科大学生命科学与技术学院，苏南京２００；２江１０９．军事医学科学院生物工程研究所，京１０７北００１［要］Ｒｄ同源重组技术发展迅速，摘ｅ已广泛应用于大肠杆菌基因组修饰，点突变、因敲除、列整合等方面发在基序挥着重要作用。要综述了Ｒｄ同源重组的重组机制和操作策略等研究进展，简ｅ并介绍了Ｒｄ同源重组在大肠杆菌基ｅ
ＡｐｌａｉｎｏＲｅＭｅｉｔｄＲｅｏｂｎｔｏｉＥｓｈｒｃｉｃｌｐｉｔｏｆｃｄｄａｅｃｍｉａｉｎｎｃｅｉｈａｏｉＧｅｏｅＭｏｉｃｔｏｎｍｄｆａｉｎｉ
ＳＮＸＺＵｕＨＯＵＣａｇＬｎ，Ａｎ－ｉｇｈｎ－ｉＦＮＧＨｏｇＱｎ
ｍｅａｏｉｍａｈｙａｄＳｎｔｂｌｓｐｔｗａｎＯｏ．
［ｙｗｒｓｌｍｄｅｅｏｂｎｔｎＥｃｅｉｉｏｉｅｅｋｏｋｕ；ｍｃａｉＫｅｏｄ］ａｂａｒｄｒｃｍｉａｏ；ｓｈｒｈａｃｌｉｃ；ｇｎｎｃｏｔｅｈｎｓｍ

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收稿日期 ห้องสมุดไป่ตู้ 2005204226 修回日期 : 2005209229 3 中国石油股份有限公司资助项目 (104003) 33 电子信箱 : zhangquan@ fripp. com. cn
Red重组技术 ,外源线性 DNA 通常是 PCR 产物、寡核苷酸片断等 ,在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列 40～60bp。这种 Red重组技术省去了体外 DNA 酶切、连接等步骤 ,使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单 ,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段 [8, 9 ] 。下文将论述 Red 重组系统的结构、作用机理及其在细菌染色体基因敲除中的应用。
DNA 的双链末端启动 Red介导的重组。然后 λ外切核酸酶 ( Exo)结合到外源线性 DNA 片断的双链末端 ,连续降解 5′末端链 , 留下 3′单链尾巴。接着 RecA 和 RecB 蛋白引导 3′单链尾巴与细胞染色体的靶基因同源序列配对 , 置换靶基因。当宿主细胞缺失 RecBCD 时 ,λRed重组只需起双链修复和重组作用的 Exo 和 Redβ蛋白参与即可。重组的其它步骤由宿主蛋白来完成。 Poteete 等 [20 ] 提出了一个不依赖解旋酶 RuvC 和 RecG的 Red重组机理 ,见图 4。该重组过程的前几个步骤与图 3同 ,但是由于宿主缺失 RecG,所以在随后的
PL 与 PR :左边和右边的启动子 ; attL 与 a ttR:λ基因与 E. coli染色体基因连接位点 F ig. 2 The defective prophage in E. coli chroma som e
113 其他重组系统的结构 M urphy等 [8 ]报道了在具有 recBCD 突变背景以及 λ噬菌重组功能 ( Exo和 Beta)的 E. coli中高效重组含有与靶基因有较长同源序列的线性 DNA 的方法。此 λ 重组体系与酵母中的线性 DNA 重组功能相似 ,也是利用了细胞 DNA 双链断裂后的自我修复功能。
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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 26 No. 1 2006
过程中 DNA 链的支点发生了移位 ,导致在标记 B 位置形成了异源双链。然后宿主中存在的自发性错配修复系统把异源双链修复为同源双链。整个过程绕开了 Holliday连接体的内切酶溶解过程。接着内切核酸酶从被置换链的右侧某位点断裂并修剪了被置换链。但是如果异源序列插入到了置换链末端和标记 B 的位置 ,则通向如图 4a所示的重组路径将受到阻碍 ,因此更依赖于 RuvC和 RucG,见图 4b。
3 Red重组策略
本文主要介绍两个 2000 年开发并应用的 Court重组和 W anner重组方案。它们都利用一个具有非常短同源序列 ( 30 ～50bp ) 的 PCR 产物启动染色体靶基因失活。这一类方案中发生的 DNA 交换通常叫做“Red - 交换 ”。 311 C our t重组策略 Court重组方案利用整合在 E. coli染色体上的缺陷性原噬菌体在 c I857 ( Ts)抑制子控制下从 λPL 表达 bet、 gam 和 exo基因 ,见图 2。利用 Court重组 ,重组率可以达到 0. 1%以上。Court重组策略分为三步 :第一步 ,合成 2个寡核苷酸片段作为 PCR 引物。寡核苷酸的 5′端有 30～50bp 与靶基因末端同源 , 3′端有 20bp 与替换基
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和重组启动。 gam 基因的表达产物 Gam 蛋白与宿主的 RecBCD 复合体结合并抑制宿主外切核酸酶活性 ,阻止外源线性 DNA 片段被降解。 [8 ] 1. 1 W anner重组系统的结构 Datsenko等 [10 ]构建的辅助质粒如 pKD20与 pKD46 含有包括 gam 基因在内的整套 Red系统 ,见图 1。利用 pKD20 与 pKD46 质粒完成的重组又称 W anner重组。 pKD20有优化的核糖体结合位点 ,在阿拉伯糖启动子
原噬菌体的 Red表达系统是温度依赖型的 ,在 42℃培养 7～20m in即可启动重组。而且它不需宿主 RecA ,仅依赖于自身表达的 Exo、Beta 和 Gam 酶功能 , 见图 2。图 2中原噬菌体含有的 λ基因从 cl到 in t。
图 2 E. co li染色体上的缺陷性原噬菌体 1) E. coli染色体基因 ; 2)λ原噬菌体基因 ; 3)已删除的原噬菌体右边基因 cro - attR - bioA;
中国生物工程杂志 China B iotechnology, 2006, 26 (1) : 81～86
Red重组技术研究进展 3
张全 33 高会杰佟明友
(中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院抚顺 113001)
摘要主要从 Red系统组成元件、作用机理、重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用 Red重组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法。首先简要介绍了传统的细菌染色体重组技术 ,指出了其中的缺陷。然后提出了 Red重组技术的定义 :利用噬菌体 Red系统介导来实现外源线性 DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组的方法 ,外源线性 DNA通常是 PCR产物、寡核苷酸片断等 ,在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列 40～60bp。这种 Red重组技术省去了体外 DNA酶切和连接等步骤 , 使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单 ,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。关键词 Red重组系统细菌靶基因基因敲除中图分类号 Q813. 4
2006, 26 (1)
张全等 : Red重组技术研究进展
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时 ,诱导 sbcB 和 sbcC 或 sbcD 基因表达其它核酸酶 ,也能发生有效重组 , 这种重组依赖于 RecG、RecQ 和 RuvAB 等解旋酶 [15 ] 。解旋酶 PriA 也在许多野生型细菌的重组中起重要作用 [17 ] 。重组蛋白 RuvC 是结合专一性内切核酸酶 ,有 Hollida连接体溶解酶的属性 [18 ] 。被 λ噬菌体感染的 E. coli会表达一种 Red重组系统 ,该系统能够启动高效的双链断裂修复和瞬间重组。如果没有感染 λ噬菌体的 E. coli细胞表达 λ重组蛋白 ,这种 Red 诱导的“高效重组 ”能力会持续存在 [19 ] 。图 3是 Red介导的重组机理 [20 ] 。重组过程中 ,λ噬菌体的 Gam 蛋白使 RecBCD 编码的酶失活 ,从外源线性
2 Red 重组的作用机理
E. coli与染色体同源重组有关的蛋白约有 15 ～20 种 [15 ] ,但是仅 RecA 是重组必需的酶。RecA 蛋白在细菌重组中起到联会与 DNA 链置换两个功能 [16 ] 。解旋酶 RecBCD 则参与重组时发生的结合或普通性转导。 RecBCD 是一种复杂的核酸酶 , 当缺乏 RecBCD 蛋白
1 Red重组系统的结构
λ噬菌体基因 Red区段编码了一个能够启动细菌染色体与外源 DNA 发生同源重组的系统。Red重组技术就是利用整合到细菌染色体或质粒中的 Red系统编码的 Red重组酶来实现外源 PCR 片段与基因组中靶基因的同源重组。λRed 区段包括 3 个基因 : bet ( akaβ) 、 exo和 gam ( akar) [ 8, 。 10～13 ] Exo是 5′→3′外切酶 ,能降解线性 DNA 的 5′末端。晶体学研究发现 , Exo 核酸外切酶三个亚基组成环形聚合体 ,具有一个漏斗型的中心通道。 bet 基因编码的 β 蛋白是一个单链 DNA ( ssDNA )结合蛋白 ,它可以结合到由 Exo 产生的单链 DNA 的 3′端 ,从而启动互补 DNA 链的退火 ,引发 DNA 链的交换反应 [8, 11～13 ] 。β蛋白在溶液中的游离状态为环状物 ,当结合到 dsDNA 时形成螺旋状纤维 [14 ] 。β蛋白还可与 Exo外切核酸酶形成复合体 ,调节核酸溶解
图 3 Red介导的线性 D NA与细菌染色体基因重组机理 F ig. 3 Possible m echan ism of Red2m ed ia ted recom b ina tion involv ing strand inva sion
图 4 Red介导不依赖 RuvC和 RecG的线性 D NA与细菌染色体基因重组机理 F ig. 4 Possible m echan ism of recom b inan t forma tion v ia the Red pa thway independen t of RuvC and RecG
图 1 Red重组表达质粒 pKD 20与 pKD 46 F ig. 1 Pla sm ids of pKD 20 and pKD 46 applied in Red recom b ina tion
2. 2 Court重组系统的结构 Red系统可以整合到染色体 , Yu 等 [11 ]利用一个缺陷型 λ原噬菌体实现了外源线性 DNA 在 E. coli细胞中与体细胞 DNA 重组 ,称做 Court重组。这个缺陷型 λ
日益成熟的微生物分子克隆技术为目的基因的研究提供了有效手段。例如目的基因的失活是目前研究基因的热点领域 ,最常用的方法是等位替换。在细菌中这种等位替换方法通常需要闭合环状的克隆载体介导才能实现 [ 1～3 ] 。而在酿酒酵母 ( S accha rom yces cerevisiae)和白色念珠菌 ( Cand ida a lbicans)中外源线性 DNA 片段可直接与染色体中的靶基因进行同源重组 [4～6 ] 。大多数细菌因为核酸内切酶的存在而不能如 S. cerevisiae等一样转化线性 DNA[7 ] 。敲除细菌基因的传统方法是利用 RecA 重组系统。RecA 重组系统是大肠杆菌内源性的同源重组体系 ,它由 RecA 和 RecBCD 组成。RecA 蛋白促进各类 DNA 分子间的同源联会和配对。RecBCD 分子量较大 ,是由 RecB、RecC 和 RecD 组成的复合体 ,具有 ATP依赖的外切酶 Ⅴ和解旋酶活性 ,它能与双链切口结合解开 DNA 链 ,并在 Chi位点形成单链 ,然后由 RecA 蛋白促进同源重组。这种方法需要较长的靶基因同源序列 ,还需构建具有靶位点的质粒。噬菌体 Red重组系统可以催化同源侧翼序列短的线性 DNA 片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组。这种利用噬菌体 Red 系统介导来实现外源线性 DNA 片断与细菌染色体靶基因进行同源重组的方法即为