下载文档原格式
Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。
为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。
然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免外界环境引起的不必要的突变。
1 传统同源重组自然发生的同源重组是两个DNA分子之间进行片段交换，从而使序列重排。
1956年，在大肠杆菌中，A John Clark发现了两种与同源重组有关的酶，RacA和RecBCD.在同源重组发生的时候，RecA 结合DNA单链或双链，对双链DNA进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身与被入侵DNA链配对。
当配对成功后，RecA蛋白脱落。
或者在RecBCD的引导下，使目标DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的帮助下进行重组。
当两条链发生重组时，会产生holliday中间体，该中间体在重组完成时由RuvAB和RecG蛋白进行拆分。
至此，形成两条含有异源序列的双链DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于75bp时会使重组率显着降低。
但是实际上，在RecA重组系统中，要求同源臂的长度在1kb左右，且反应条件要求比较苛刻。
2 Red/ET 同源重组技术Red/ET同源重组系统，其实是Red同源重组系统和ET同源重组系统的总称，其中ET系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中导的Rac噬菌体中发现，随后又在噬菌体中发现了Red系统。
Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用李鑫;李亚芯;戴建君【摘要】基因敲除是研究基因功能最直接的方法.对于大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂.Red同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速、简单,在E.coli基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟.作者介绍了Red同源重组系统的组成和同源重组原理,阐述了常用的两步同源重组法敲除E.coli基因的操作步骤及注意事项.大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造、病原菌致病机理、耐药机制研究等领域做出巨大贡献,由于两步法仍保留有Red同源重组系统电转效率低、有序列残留的缺陷,作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍,通过对以上方法及应用进行综述,为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考.%Knock-out is the most direct way to exploregene''s function.The traditional method of Escherichia coli (E.coli) gene knock-out is to use its own RecA reorganization system, which relies onthe specific given cleavage sites of restriction enzymes, requires long homologous arm, furthermore, the operation is complex.Modification of the genome has become simple and rapid since the advent of Red homologous recombination method.And its application in E.coli gene knock-out has been more mature.The structure and functional principle of Red homologous recombination is introduced, besides, this review expounds the operating steps and notices of the common two-step Red-mediated recombination.The Red homologous recombination technologyin E.coli has made great contribution in the area of modifications ofengineering strain, pathogenicity and bacterial resistance of the pathogenic bacteria.Additionally,the advantages and shortcomings of the method are set forth.According to the disadvantage that the traditional method do leave recombinase recognition site scars and has low efficiency, a sum of classical methods for scar-less gene replacement are described in the final part of the article.These approach can provide better applications for the construction of E.coli genome.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)007【总页数】7页(P1934-1940)【关键词】大肠杆菌;Red同源重组;基因敲除;两步法【作者】李鑫;李亚芯;戴建君【作者单位】南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095【正文语种】中文【中图分类】Q784通过一定途径使基因去除或失活的技术称为基因敲除，又称基因打靶[1]，该技术可定向改造微生物，近年来已成为构建新型大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)生物工程菌的重要手段。
Red同源重组技术研究进展Red 同源重组技术研究进展韩聪1,2张惟材1*游松2(1军事医学科学院⽣物⼯程研究所北京 100071 2沈阳药科⼤学沈阳 110016)摘要伴随着分⼦⽣物学的发展,⼀种基于噬菌体Red 重组酶的同源重组系统已应⽤于⼤肠杆菌基因⼯程研究。
Red 重组系统由三种蛋⽩组成:E xo 蛋⽩是⼀种核酸外切酶,结合在双链DNA 的末端,从5 端向3 端降解DNA,产⽣3 突出端;Beta 蛋⽩结合在单链DNA 上,介导互补单链DNA 退⽕;Gam 蛋⽩可与RecBC D 酶结合,抑制其降解外源DNA 的活性。
Red 同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率⾼的特点。
这种技术可在DNA 靶标分⼦的任意位点进⾏基因敲除、敲⼊、点突变等操作,⽆需使⽤限制性内切酶和连接酶。
此外,这种新型重组技术可直接将⽬的基因克隆于载体上,⽬的基因既可来源于细菌⼈⼯染⾊体也可是基因组DNA 。
Red 同源重组技术使难度较⼤的基因⼯程实验顺利进⾏,⼤⼤推动功能基因组研究的发展。
关键词 Red 同源重组基因打靶基因⼯程收稿⽇期:2003 08 05 修回⽇期:2003 11 03*通讯作者,电⼦信箱zhangweicai@/doc/c711836424.html同源重组是基因⼯程实验中常⽤的技术⼿段,在基因打靶和基因克隆⽅⾯具有重要作⽤。
常规的基因打靶技术是以Rec A 同源重组为基础,通常需要数百碱基甚⾄更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中⼤量重复序列的存在,⽽导致意外重排现象的发⽣。
B AC 、PAC 、YAC 等克隆载体的构建为基因克隆提供了有⼒⼯具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,⼤⼤限制了对⼤⽚段基因功能的研究。
近⼏年来,⼀种基于噬菌体Red 重组酶作⽤的同源重组技术逐渐成为基因⼯程研究的热点之⼀,并取得了⼀系列重要进展。
Red 同源重组技术的原理是将⼀段携带与靶基因两翼各有40~60bp 同源序列的PCR ⽚段导⼊宿主菌细胞,利⽤噬菌体Red 重组酶的作⽤,使导⼊细胞的线性DNA ⽚段与染⾊体(或载体)的特定靶序列进⾏同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所⽰)。
red同源重组操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!Red同源重组操作流程：1. 构建载体，构建包含目标基因同源序列的载体。
Red同源重装步骤1.制备BL21及HMS的red同源重组大肠杆菌。
(1)目前有pKD46质粒，BL21化学感受态，HMS174电击感受态。
(2)实验准备①LB液体培养基（无抗/氨苄抗性），LB固体培养基（4个），氨苄抗生素，甘油(3)实验操作①化学转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置5min。
2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置30min；3)42℃热激90s，重新插回冰中放置5min；4)在超净台内每支EP管中各加1mL的LB液体培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；5)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。
弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。
6)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。
②电击转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置2min。
2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置2-3min；3)电击2500v后，立即加入提前预热好的培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；4)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。
弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。
5)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。
2.red同源重组电击感受态制备(1)实验准备①泡酸：两个250mL锥形瓶，一个培养皿。
②灭菌：1)活化培养基25ml（1mL*3*2）2)50*2感受态培养基3)一个过滤L-阿拉伯糖的滤器4)100ml左右去离子水5)150ml左右15% 甘油（22.5mL甘油）6) 1.5ml ep管枪尖（黄枪尖要剪）50ml离心管*4③试剂：1)Amp 抗生素（）2)10M的L-阿拉伯糖（1.80g加入1.2ml水中，过滤。
