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RedET同源重组技术概述RedET同源重组技术是一种利用酵母宿主的遗传重组系统，将目标基因在酵母中进行同源重组而得到转基因株系的技术。
该技术在生物医学和生物工程领域具有广泛的应用前景。
本文将对RedET同源重组技术进行概述并介绍其原理、应用以及存在的问题。
RedET同源重组技术的原理基于酵母自然发生的同源重组机制。
酵母是一种单细胞真核生物，其核糖体RNA和转录因子与哺乳动物的细胞中类似，使得酵母成为一种理想的宿主，用于表达复杂蛋白质的研究和生产。
在RedET同源重组技术中，采用了遗传重组系统来介导目标基因与酵母染色体发生同源重组，从而实现目标基因的插入和表达。
RedET同源重组技术的核心是一种诱导目标基因与酵母染色体同源重组的DNA修复机制。
该修复机制主要基于酵母中两个DNA重组酶RecE和RecT的相互作用。
RecE酶在酵母中识别并切割目标基因与酵母染色体之间的同源序列，形成单链切口。
然后RecT酶结合在切口上，介导目标基因与酵母染色体的DNA重组。
最后，通过酵母DNA修复机制，目标基因与酵母染色体实现了同源重组，并插入到酵母基因组中。
RedET同源重组技术具有广泛的应用领域，尤其在基因工程和蛋白表达中具有重要作用。
首先，该技术可以用于基因敲除和基因座替换，为基因功能研究提供了有效的手段。
其次，RedET同源重组技术也可以用于构建表达突变蛋白或蛋白片段的酵母株系，用于蛋白结构和功能研究。
此外，通过RedET同源重组技术，还可以构建酵母株系用于产生异源重组蛋白，并通过大规模筛选酵母株系实现高效蛋白生产。
然而，RedET同源重组技术在应用过程中也存在一些问题和局限性。
首先，该技术的目标基因与酵母染色体之间需要具有足够的同源性，这对于异源基因的插入造成了一定的限制。
其次，RedET同源重组技术在染色体插入位置的选择性方面存在一定的限制，这可能影响目标基因的表达水平和稳定性。
此外，酵母株系在目标基因插入后可能会发生染色体结构的重组和重排，这可能会对酵母的生长和基因表达产生影响。
Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。
为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。
然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免外界环境引起的不必要的突变。
1 传统同源重组自然发生的同源重组是两个DNA分子之间进行片段交换，从而使序列重排。
1956年，在大肠杆菌中，A John Clark发现了两种与同源重组有关的酶，RacA和RecBCD.在同源重组发生的时候，RecA 结合DNA单链或双链，对双链DNA进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身与被入侵DNA链配对。
当配对成功后，RecA蛋白脱落。
或者在RecBCD的引导下，使目标DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的帮助下进行重组。
当两条链发生重组时，会产生holliday中间体，该中间体在重组完成时由RuvAB和RecG蛋白进行拆分。
至此，形成两条含有异源序列的双链DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于75bp时会使重组率显着降低。
但是实际上，在RecA重组系统中，要求同源臂的长度在1kb左右，且反应条件要求比较苛刻。
2 Red/ET 同源重组技术Red/ET同源重组系统，其实是Red同源重组系统和ET同源重组系统的总称，其中ET系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中导的Rac噬菌体中发现，随后又在噬菌体中发现了Red系统。
同源重组同源重组（Homologous Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。
目录1简介2基因敲除1. 2.1 定义2. 2.2 技术路线3转移法4DNA1简介同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
同源重组同源重组反应通常根据交叉分子或holliday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。
同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性，100%重组的DNA分子之间的重组常见于非姐妹染色体之间的同源重组，称为Homologous Recombination，而小于100%同源性的DNA分子之间或分子之内的重组，则被称为Hemologus Recombination。
后者可被负责碱基错配对的蛋白如原核细胞内的MutS 或真核生物细胞内的MSH2-3等蛋白质“编辑”。
同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（Gene Conversion)。
Red同源重装步骤1.制备BL21及HMS的red同源重组大肠杆菌。
(1)目前有pKD46质粒，BL21化学感受态，HMS174电击感受态。
(2)实验准备①LB液体培养基（无抗/氨苄抗性），LB固体培养基（4个），氨苄抗生素，甘油(3)实验操作①化学转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置5min。
2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置30min；3)42℃热激90s，重新插回冰中放置5min；4)在超净台内每支EP管中各加1mL的LB液体培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；5)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。
弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。
6)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。
②电击转化1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置2min。
2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，然后插入冰中静置2-3min；3)电击2500v后，立即加入提前预热好的培养基，30℃、200rpm摇晃培养1h；4)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。
弃部分上清，留100μL左右留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培养过夜。
5)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保存至-80℃冰箱中。
2.red同源重组电击感受态制备(1)实验准备①泡酸：两个250mL锥形瓶，一个培养皿。
②灭菌：1)活化培养基25ml（1mL*3*2）2)50*2感受态培养基3)一个过滤L-阿拉伯糖的滤器4)100ml左右去离子水5)150ml左右15% 甘油（22.5mL甘油）6) 1.5ml ep管枪尖（黄枪尖要剪）50ml离心管*4③试剂：1)Amp 抗生素（）2)10M的L-阿拉伯糖（1.80g加入1.2ml水中，过滤。
21卷 3 期 2005年 5 月生物工程学报Chinese Journal o f Biotechnology V ol. 21N o. 3May 2005R ed Π ET重组及其在生物医学中的应用R ed Π ET R ecombination and its Biomedical王军平13,张友明2W ANGJun 2Ping 13and ZH ANG Y ou 2Ming 211, 重庆 40003821基因桥研究室 , 11State K ey Laboratory o f , and Injury , Institute o f Combined Injury , College o f Preventive Medicine , The Third Military MedicalUniver sity , Chongqing 400038, 21G ene Bridge G mbH , Dresden 01307, G ermanyαβ系统而成立的 DNA 工程平台—摘要经过应用Rac噬菌体的RecEΠRecT和λ噬菌体的 Red Π Red ——Red Π ET重组 , 是一种不依靠于限制性内切酶的分子克隆新技术。
运用该技术能够介导PCR 产物或寡核苷酸对目标基因进行剪切、插入、交融及突变等多种操作, 在生物医学领域里拥有广阔的应用远景, 特别在基因组功能研究中对 BACs 、PACs 和细菌染色体的打靶修饰以及基因敲除动物DNA 靶分子的迅速建立等方面最有效。
跟着 Red Π ET重组的推行与应用 , 该技术自己也在不停被改进 , 在工作效率获取明显提升的同时 , 其操作也变得更为简单、省时、省力。
联合自己的一些研究结果 , 对 Red ΠET重组的技术特色、发显现状和在修饰 , BACs , 噬生物医学中的应用进行了详尽论述。
重点词Red ΠET重组 ,DNA菌体中图分类号Q78 文件表记码 A 文章编号100023061(20050320502205Abstract Red Π ET recombination , a powerful hom olog ous recombinationsystem based on the Red operon ofλ phage or RecEΠ RecT from Rac esph a gen , provid innovative approach for DNA engineering. Deletion , insertion and mutation can bequickly and precisely performed on the target gene mediated by RedΠ ET recombination with PCR derived DNA fragments or olig onucleoti 2des. This technical platform hasextensive applications in biomedical field including bacterial artificial chrom osome modification , gene knock 2out construction and genetic m odification of E . coli strains aswell as some other kinds of m icroorganisms. Recently , Red Πn ETwasrecombinatioim provedin several aspects so that it becomes m ore powerful and maneuverable. The characteristic and development of Red Π ET recombination and its biomedicalapplications were described in this review. K ey w ords Red Π ET recombination ,DNA m odification , bacterial artificial chrom osomes , phage跟着包含人类基因组计划在内的各样基因组测序工程的实行与达成, 以序列信息为基础的基因组功能研究随即成为生命科学领域的又一重要课题 [1] 。
