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黄酒酿造过程细菌群落结构变化初步研究本研究旨在了解黄酒酿造过程中细菌群落结构变化的情况，为提高黄酒生产质量提供科学依据。
一、黄酒为酿造的重要产品黄酒是中国特有的一种古老的源自古代的酿造产品，也是中国酿酒文化的重要组成部分，常被用于饮食、婚礼和宗教仪式。
由于其营养价值、生物活性成分等特点，黄酒已经被认可为中国优质、饮品类研究与开发的一个重要领域。
二、黄酒酿造过程中细菌群落的结构变化酿造过程中，主要是靠葡萄糖及木质素等氨基酸的发酵生成乙醇，发酵过程中存在大量的细菌群落。
发酵过程是由一系列的生物学变化、物理化学反应和化学变化所构成的一个复杂的系统。
研究表明，细菌群落的结构变化是控制和调节发酵过程中糖和乙醇及其他有关物质的积累、稳定和反应的重要因素。
因此，对黄酒酿造过程中细菌群落变化的研究对于科学规范黄酒生产有着重要的意义。
三、研究方法本研究采用宏基因组和测序技术，运用基于PCR-DGGE和16S rRNA基因测序技术分析黄酒酿造过程中细菌群落结构变化的情况。
在PCR-DGGE技术下，采用适量的有机溶剂提取样品的DNA，以V3的ITS区域为检测引物，以CEPH1 和 CEPH2 为控制引物PCR试验，然后将PCR产物进行DGGE分析。
在16S rRNA基因测序技术中，对每一份样品的细菌16S rRNA基因区域序列以454 FLX 为仪器，以F27 和R1598 引物子进行PCR扩增，最后进行16S rRNA基因序列测序分析。
四、研究结果研究表明，在黄酒酿造过程中，细菌群落越来越多样化和复杂化，尤其是在酒窖环境条件下，细菌数量增多和种类变动较大。
基于PCR-DGGE的结果发现，酿造过程中细菌群落的多样性主要受气候变化和发酵度的影响，而发酵度程度为主要影响因素。
而基于16S rRNA基因测序技术的结果表明，发酵过程中酒窖环境下更容易出现高度复杂的细菌群落，细菌多样性更高。
五、结论本研究首次利用PCR-DGGE和16S rRNA基因测序技术，深入研究了黄酒酿造过程中细菌群落结构变化的情况，可以为提高黄酒发酵质量的工作提供重要的科学依据。
黄酒酿造过程中细菌群落组成及发酵特性研究张凤杰;褚小米;薛洁;王异静;王德良;周建弟;钱斌【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2013(000)012【摘要】对麦曲、浸米水和黄酒发酵醪中的细菌进行分离和鉴定,并分析代表菌株的生长速度、产酸能力和酸味特性.结果表明,分离的41株细菌经16S rDNA序列鉴定为乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)4个属.乳酸菌一直存在于酿造过程中,且种类丰富,其中短乳杆菌数量最多;从菌体增殖的OD600值、产酸能力和产酸风味三方面评价乳酸菌代表菌株,植物乳杆菌L15生长较快,产酸能力突出且酸味清爽,副干酪乳杆菌L46次之,短乳杆菌虽增殖和产酸状况良好,但酸味恶臭.其他菌种产酸能力不突出.【总页数】4页(P32-35)【作者】张凤杰;褚小米;薛洁;王异静;王德良;周建弟;钱斌【作者单位】中国食品发酵工业研究院,北京100027;国家黄酒工程技术研究中心,浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司,浙江绍兴31200;中国食品发酵工业研究院,北京100027;中国食品发酵工业研究院,北京100027;中国食品发酵工业研究院,北京100027;国家黄酒工程技术研究中心,浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司,浙江绍兴31200;国家黄酒工程技术研究中心,浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司,浙江绍兴31200【正文语种】中文【中图分类】TS262.4;TS261.4;Q93-3;TS261.1【相关文献】1.红曲黄酒传统酿造过程中的细菌菌群结构及其动态变化 [J], 贾瑞博;饶平凡;倪莉;吕旭聪;潘雨阳;胡荣康;周文斌;蒋雅君;郭伟灵;朱风风;吴林秀;刘斌2.黄酒酿造过程中真菌群落组成及挥发性风味分析 [J], 牟穰;毛健;孟祥勇;刘芸雅3.机制黄酒酿造生产过程中氨基酸变化研究 [J], 张辉;袁军川;毛严根;叶敏4.绍兴黄酒酿造过程中氨基酸态氮量变化及u2003控制研究 [J], 陈回军;高轶岚5.黄酒酿造过程中优势细菌产生物胺的检测与评价 [J], 张凤杰;王德良;薛洁;闫寅卓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
麦曲微生物组成分析及其对即墨老酒品质的影响李静;谭海刚【摘要】对两种即墨老酒麦曲中微生物群落组成和酿酒性能进行研究.结果表明,两种麦曲中的主要微生物类别均为细菌、霉菌和酵母菌,但其中微生物群落组成明显不同,麦曲A和麦曲B中三类菌的比例分别为3:6:4和60:15:1;麦曲A在老酒酿造过程中的群落更替顺序为:霉菌酵母菌细菌,酒精度(v/v)11.0%、固形物含量9.0 Brix、感官评分75分;麦曲B的群落更替顺序为:细菌霉菌酵母菌,酒精度6%(v/v)、固形物含量16.0 Brix、感官评分66分.酒曲微生物群落组成不同,所酿造的酒品质也各不相同.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2016(024)006【总页数】3页(P42-44)【关键词】麦曲;微生物组成;即墨老酒【作者】李静;谭海刚【作者单位】青岛农业大学食品科学与工程学院,山东青岛 266109;青岛农业大学食品科学与工程学院,山东青岛 266109【正文语种】中文【中图分类】TS261.1酒曲本质即是一种粗酶制剂［1］。
酶具有生物催化作用，能促使小麦、大米、蘖等所含的淀粉或糖质原料发酵转变成糖、氨基酸，然后由酵母的酒化酶将糖变成乙醇，即酒精［2］。
不同制作工艺做出的酒曲，所包含的微生物群系各不相同［3］，所带来的生化反应效果也就不同，即使用同一种酿酒原料，也可以酿造出丰富多彩、不同风格的酒。
例如白酒按用曲种类可分为大曲酒、小曲酒、麸曲酒；黄酒有麦曲酒、红曲酒等。
目前，酒曲微生物类别是研究的热点。
刘效毅［4］从以高温大曲中分离出147株微生物，其中细菌97株，霉菌50株。
蔡丽［5］从孝感地区制备米酒质量最好的酒曲中分离到13株根霉，其中6株为米根霉（Rhizopus o－ryzae），7株为华根霉（Rhizopus chinesis）。
本研究以即墨老酒的两种工艺麦曲为研究对象，分析不同麦曲中的主要微生物菌群类别和数量比例，并在酿酒过程中检测微生物演替情况及酿酒性能，以期找到最佳酒曲微生物比例，建立制曲工艺（参数）、菌相及酿酒品质之间的相关关系，最终提高即墨老酒的生物营养价值、出酒率以及综合质量。
麦曲菌群结构全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：麦曲菌，是一类生长在麦子上的真菌，主要包括曲霉、青霉和根霉等。
这些真菌在麦子上形成的菌群结构，对于麦曲的发酵过程和品质有着重要的影响。
在这篇文章中，我们将探讨麦曲菌群结构的组成、作用和调控。
麦曲菌群结构的组成是多样的，通常包括曲霉、青霉、根霉等多种真菌。
曲霉是麦曲中的主要成分，主要负责酵母发酵和产生醇类、酸类等气味物质。
青霉则在麦曲中具有较强的抑菌作用，可以抑制其他真菌的生长，保证麦曲的稳定性和品质。
根霉则在麦曲中起到补充酶类物质、促进发酵反应的作用。
麦曲菌群结构在麦曲的发酵过程中发挥着重要的作用。
曲霉和根霉等真菌会分泌大量酶类物质，将麦子中的淀粉、蛋白质等分解为糖类和氨基酸等物质，为酵母的生长提供营养物质。
曲霉会产生大量的二氧化碳和乙醇等气体，推动发酵反应的进行。
青霉等真菌的存在可以抑制一些有害微生物的生长，保证发酵过程的顺利进行。
麦曲菌群结构的调控是麦曲发酵的关键。
在传统的酿造过程中，麦曲的菌群结构主要依赖于自然环境中的微生物竞争和自然选择。
但随着现代科学技术的发展，人们可以通过调节发酵温度、湿度、通风等条件来控制麦曲菌群结构的组成和比例，从而实现对麦曲发酵过程的精确控制。
麦曲菌群结构在麦曲的发酵过程中扮演着重要的角色。
不同种类的真菌在麦曲中各司其职，相互协作，促进发酵过程的顺利进行。
通过调控麦曲菌群结构的组成和比例，可以提高麦曲的品质和产量，为麦曲酿造业的发展提供有力支持。
【文章结束】第二篇示例：麦曲菌是一种广泛存在于大自然中的真菌，主要生长在植物表面、土壤中或有机废物中。
麦曲菌具有较强的适应能力，在不同的环境中都可以生长繁殖。
麦曲菌在生物学上是一种真菌类微生物，有着与细菌类微生物相似的特点，如在分解有机物，参与生物循环中发挥着重要作用。
麦曲菌群结构是指由多个不同种类的麦曲菌组成的一个多样化的微生物群落。
这些不同种类的麦曲菌可以共同生存繁殖，形成一个相对稳定的群落结构，通过相互合作或竞争来维持整个群落的稳定性。
清爽型黄酒酿造微生物群落结构及其与风味物质相关性研究黄酒是我国的民族特产。
传统黄酒受复杂酿造菌系影响,其口味醇厚而略带酸涩,地域性消费明显。
清爽型黄酒是在传统黄酒酿造工艺基础上,通过添加酶制剂、降低生麦曲用量等改良工艺酿制而成,口味鲜爽淡雅,低度保健,迎合了当今消费者追求健康的消费理念。
然而,作为新工艺黄酒,清爽型黄酒发酵过程的研究尚处于起步阶段。
尽管对麦曲及发酵过程有一定研究,但发酵过程中微生物群落结构,风味物质产生途径,微生物与风味物质产生的关系仍未得到解析。
本研究利用高通量测序技术全面解析了清爽型黄酒酿造微生物的群落结构,把握发酵过程中微生物群落的演变规律,研究清爽型黄酒的风味特征,探讨微生物对清爽型黄酒风味物质生成的影响,对提高黄酒质量,指导黄酒生产具有重要的意义。
主要研究结果如下:(1)清爽型黄酒中氨基酸、有机酸和挥发性成分含量随发酵时间的延长呈增长趋势。
精氨酸、丙氨酸和谷氨酸是清爽型黄酒中含量最高的三种氨基酸;乳酸和乙酸是主要有机酸;HS-SPME-GC/MS共检测到清爽型黄酒的49种挥发性风味物质,其中高级醇类和酯类含量占比例较大,醛类其次。
(2)利用Mi Seq高通量测序平台分析了麦曲和发酵液中的微生物群落结构。
发现发酵液中细菌多样性远高于麦曲中细菌多样性,主要细菌门包括Proteobacteria(44.59%)、Firmicutes(32.23%)、Actinobacteria(9.51%)和Cyanobacteria(3.48%);发酵液属水平上主要为Bacillus(7.61%)、Pseudomonas(5.38%)、Lactococcus(4.81%)、Weissella(3.95%)、Staphylococcus(2.97%)、Saccharopolyspora(2.30%)、Lactobacillus(2.10%)、Acinetobacter(1.31%)、Leuconostoc(0.93%)、Citrobacter(0.83%)、Thermoactinomyces(0.53%)和Enterococcus(0.36%);麦曲中主要细菌属为Bacillus(18.59%)和Staphylococcus(1.49%)。
黄酒麦曲中主要霉菌的分子鉴定及分类方华;曹钰;陆健;谢广发【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2006(000)003【摘要】采用土豆琼脂培养基、麦汁琼脂培养基和察氏培养基分离麦曲中的霉菌,共得到18株霉菌.所得5株主要霉菌(数量级在105以上)经氯化苄法提取基因组DNA后,应用真菌ITSrDNA通用引物ITS1和ITS4扩增整个ITS序列(包括ITS1和ITS2),经测序和序列比对,这5株菌分别为伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、微小毛霉(Rhizomucor Pusillus)、米曲霉(Aspergillusorgyze)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、米根霉(Rhizopus oryzae).【总页数】3页(P45-47)【作者】方华;曹钰;陆健;谢广发【作者单位】江南大学生物工程学院,江苏,无锡,214036;江南大学生物工程学院,江苏,无锡,214036;江南大学生物工程学院,江苏,无锡,214036;浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司,浙江,绍兴,312000【正文语种】中文【中图分类】Q93-33;TS262.4;TS261.1【相关文献】1.木霉菌形态学分类检索与分子生物学鉴定 [J], 张广志;杨合同;文成敬2.北方黄酒麦曲中真菌的筛选·鉴定及系统发育分析 [J], 谭婷婷;王家林;桑戈;安宝祯3.婴幼儿乳粉中霉菌的分类和鉴定 [J], 萨丽塔娜提·居努司4.分子生物学技术在链霉菌分类中的应用 [J], 张楠;张本峰;于建;刘训理5.16S rRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用 [J], 洪义国;孙谧;张云波;李勃生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
绍兴机械化黄酒风味形成途径和功能微生物的研究机械化黄酒采用可控温的大型发酵罐生产,是多菌种参与的双边发酵。
研究黄酒发酵过程中风味形成与微生物代谢的关系,揭示与特定风味物质形成相关的主要功能微生物和代谢途径,对指导黄酒生产和控制黄酒质量有重要意义。
目前关于黄酒原料和发酵过程中微生物的演替规律和风味动态变化已有较多研究,但缺乏黄酒风味物质形成与微生物代谢途径的关联研究。
本研究主要研究了绍兴机械化黄酒发酵中风味物质的动态变化及形成相关的功能微生物,主要内容如下:1、采用气相色谱-质谱联用仪和高效液相色谱共检测了绍兴机械化黄酒发酵过程中的94种物质,主要包括氨基酸18种、有机酸8种、单体酚6种和挥发性风味物质62种。
研究发现在前酵阶段(前72 h)风味物质含量快速增长,而在后酵中期(312 h)酯类、挥发性酚、高级醇及部分氨基酸含量开始下降。
发酵过程中,有机酸主要为乳酸,占总酸含量的57.57%~73.17%;氨基酸主要为苦味氨基酸,占氨基酸总含量的42.39%~53.29%,γ-氨基丁酸在发酵结束(432 h)时含量达到202.56±10.11 mg/L;酯类物质主要为乳酸乙酯和乙酸乙酯,醇类物质主要为β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇和2,3-丁二醇,挥发性酚类物质主要为4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙基苯酚;单体酚在前酵期间主要为儿茶素,在后酵期间主要为表儿茶素。
2、根据风味物质的变化趋势和发酵工艺的关键控制点,选择了发酵24 h、72 h、120 h和312 h的黄酒发酵醪样品进行宏基因组测序,获得105794条unigenes序列。
通过物种注释,发现机械化黄酒发酵过程中优势微生物有糖多孢菌属、酵母菌属、曲霉菌、葡萄球菌属、乳杆菌属、链霉菌属、多孢放线菌、拟无枝酸菌、乳球菌属和糖单孢菌属,相对丰度在81.53%~83.72%。
通过功能注释,发现黄酒发酵过程中主要代谢过程分类为碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢,从基因水平佐证了黄酒中风味物质形成的物质基础。
麦曲中的菌群结构包括多种不同的微生物，其中优势菌群主要包括糖多孢菌属、金黄杆菌属、多孢放线菌属和芽孢杆菌属等。
这些菌群在麦曲的制作和发酵过程中起着重要的作用。
糖多孢菌属是一种安全的生物功能菌，属于放线菌门，能够产生重要的活性物质，如各种酶类、抗生素、维生素等。
金黄杆菌属则可能参与麦曲的发酵过程，并对黄酒的风味产生影响。
芽孢杆菌属是麦曲细菌属中的另一优势菌群，具有耐强酸碱、耐高温的特点，是非常普遍的污染菌。
在麦曲的发酵过程中，芽孢杆菌属可能与其他菌群共同作用，促进黄酒的酿造。
除了优势菌群外，麦曲中还存在其他多种微生物，如葡萄球菌属、假单胞菌属、泛菌属、蓝细菌属、肠杆菌属等。
这些微生物在麦曲的制作和发酵过程中也可能起到一定的作用。
在麦曲的菌群结构中，不同微生物之间的相互作用和平衡对黄酒的风味和品质具有重要影响。
因此，在黄酒的酿造过程中，需要合理控制和管理麦曲的菌群结构，以确保黄酒的品质和口感。
黄酒熟麦曲中细菌多样性的评价崔梦君;折米娜;张振东;赵慧君;郭壮【摘要】以黄酒熟麦曲为研究对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chan reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)与MiSeq高通量测序技术相结合的方法对其细菌多样性进行解析.DGGE结果表明:Bacillus(芽孢杆菌)、Weissella(魏斯氏菌)、Pediococcus(片球菌)、Staphylococcus(葡萄球菌)和Lactobacillus(乳酸杆菌)普遍存在于麦曲样品中.MiSeq高通量测序结果表明:熟麦曲中的细菌门主要为Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria,平均相对含量分别为87.95％、9.00％和1.16％.熟麦曲中的细菌属主要为Bacillus(芽孢杆菌属)、Weissella(魏斯氏属)、Staphylococcus(葡萄球菌)、Klebsiella(克雷伯菌属)、Pantoea(泛菌属)和Lactobacillus(乳杆菌属),其平均相对含量分别为70.70％、8.55％、2.67％、2.29％、1.32％和1.07％.由此可见,Bacillus(芽孢杆菌)为熟麦曲中的优势细菌.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2019(040)011【总页数】6页(P194-199)【关键词】熟麦曲;聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳;MiSeq高通量;细菌;多样性【作者】崔梦君;折米娜;张振东;赵慧君;郭壮【作者单位】湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳 441053;湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053【正文语种】中文作为黄酒酿造中的重要原料，麦曲中包含霉菌、酵母菌和细菌等微生物，由于微生物与生物环境的互生、共生、寄生和拮抗等关系，逐渐形成了一个复杂且具有多样性的微生物区系，同时对黄酒风味也起到了至关重要的作用[1-2]。
绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方华，曹钰，陆健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。
富集后的图谱中只有4条带在免培养图谱中能找到对应的位置。
通过土豆培养基、察氏培养基和麦曲浸提液培养基对麦曲中的真菌进行分离，共得到24株真菌。
三种培养基分离得到的纯种数目和菌落数分别为8种、18种、11种和4.7×104 cfu/g 曲、1.4×104 cfu/g曲、8.4×104 cfu/g曲。
不同的培养基分离出来的优势菌不一样，每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株。
必须联合使用多种培养基才能最大限度和更加准确的分离和了解麦曲中的真菌及其群落结构。
关键词：绍兴黄酒；麦曲；微生物群落结构；DNA提取；核糖体基因间隔区分析(RISA)前言麦曲在黄酒的酿造过程中起着非常重要的作用。
它是在一定的地理环境和生长条件下，通过制曲工艺的驯化，其中的微生物不断的发生着有序的消长和变化，逐步形成稳定的微生物区系。
分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理解制曲过程中的微生物和周边环境的相互关系，建立麦曲微生物生态数据库，实现麦曲微生态系统的人工模拟和异域再现具有重要的指导意义。
国内对黄酒麦曲中的微生物尤其是真菌从筛选产酶的角度进行过研究，通过传统的分离培养方法[1]对真菌的种类进行分类鉴定，操作方法繁琐、周期较长，而且对鉴定者经验要求较高。
而对于麦曲中的微生物群落结构以及微生物种群之间的相互影响的关系，即微生物生态还未见研究报告。
目前，微生物生态学的研究有两个主要趋势：一方面，结合传统研究方法和各种分子生物学技术对不同环境的微生物群落进行研究，使人们能更加客观地认识环境中微生物的自然存在状况；另一方面，加强对各种复杂环境微生物的研究，希望从中发现更多新的微生物及基因资源，了解微生物对特定环境的适应机制，为合理利用和保护微生物资源奠定基础。
因此，本章采用不同的培养基对黄酒麦曲中可培养真菌进行系统分离和初步研究，同时比较不同培养基的分离能力。
通过大规模的平板稀释分离，将得到的不同种的真菌采用扩增真菌的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS）保守序列，测定其序列组成，然后通过序列比对的方式对未知真菌进行鉴定。
另外，采用免培养的方法对麦曲中的真菌进行分离鉴定，通过比较，以综合利用这两种方法，更加客观准确地了解和掌握麦曲中真菌的群落结构。
1. 材料与方法1.1 麦曲样品的收集与保存黄酒麦曲样品采自绍兴黄酒厂某分厂的成品麦曲JH。
样品采集完成后转入无菌塑料袋中带回实验室。
分别取两块平行样品，粉碎，混合均匀，得到均一样品后，称取500 g放入塑料袋中，保存于4 ℃备用。
1.2 分离培养基土豆琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、定容至1000 mL、pH自然。
察氏培养基（CPK）：NaNO3,2 g、K2HPO4, 1 g、KCl, 0.5 g、MgSO4·7H2O, 0.5 g、FeSO4·7H2O, 0.01 g、蔗糖30 g、定容至1000 mL。
麦曲浸提液培养基(WQE): 500 g 粉碎的麦曲样品，加入1500 mL蒸馏水，100 ℃煮沸1 h 后，用四层纱布过滤，0.1 MPa下灭菌20 min备用[2]。
三种培养基中均添加去氧胆酸100 mg/L、链霉素3 × 104 U/L分别抑制菌丝的蔓延和细菌的生长，各培养基的固态培养基琼脂的添加量均为15 g/L，0.1 MPa下灭菌20 min。
1.3分离培养条件取10 g均一麦曲样品，加入到90 mL磷酸盐缓冲液中(PBS, 137 mmol/LNaCl, 2.7 mmol/L KCl, 4.3 mmol/L NaH2PO4·7H2O, 1.4 mmol/L KH2PO4, pH 7.0)，轻轻振荡10 min。
取上清液分别用PBS作梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。
平板稀释分离：取不同稀释度的样品100 μL，分别涂布于对应的固态培养基上，每个稀释度作五个平行。
其间进行平板菌落计数，表示单位为cfu/g干曲。
然后根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，分离纯化，得到纯种菌株。
液态培养基富集：取不同稀释度的样品1 mL 分别接入(接种量为10%, v/v)到装有9 mL各种培养基(PDA, CPK 和WQE)的试管中，在30℃下振荡培养2天。
1.4分离获得的真菌的鉴定1.4.1真菌基因组DNA的提取采用氯化苄抽提真菌DNA[3]：用接种环刮取一环纯种斜面的孢子于土豆液体培养基中，30℃摇瓶过夜。
将摇瓶培养物抽滤后，收集菌丝体，超纯水洗涤3遍后，转入7 mL离心管中，加入2.5 mL 提取液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0; 40 mmol/L EDTA，pH 8.0; 2% SDS)振荡混匀后，再加入1 mL 10% SDS和2 mL氯化苄，50℃保温1 h(每10 min上下颠倒混匀)，加入1 mL 3 mmol/L的NaAc，冰浴15 min，9,800×g离心15 min，取上清，加入等体积的异丙醇，室温放置20 min，9,800×g离心15 min，弃上清，加入70%乙醇洗涤，离心15 min，弃上清，室温放置15 min后，加入50 µL TE溶解。
0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.4.2 ITS-PCR扩增真菌的ITS(内转录间隔区)序列扩增参照White等[4]的方法。
采用引物对pITS1：5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，pITS4：5’ - TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’来扩增真菌的ITS 保守序列。
PCR扩增的反应体系为：50 µL的总反应体积中含有1 µL dNTP(10 mmol/L)，5 µL 10×Buffer，10 mmol/L的MgCl2，2.5 U的Taq酶(上海申能博彩生物技术公司)，引物pITS1、pITS4各10 pmol/L，DNA模板量1 μL。
扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。
PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统拍照。
1.4.3 ITS-PCR产物胶回收割下含目的DNA片段的琼脂糖凝胶(尽量小)，放入1.5 mL的离心管中，采用小量琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜生物工程公司)对PCR产物进行纯化，具体操作步骤见说明书。
1.4.4 PCR纯化产物与pUCm-T载体连接连接体系为10 µL。
在微型离心管中加入以下成分：1.0 µL的10 ×连接酶缓冲液和1.0 µL的T4连接酶，pUCm-T Vector 1.0 µL，纯化后的PCR产物7.0 µL。
16℃连接过夜。
1.4.5转化采用CaCl2法预先大量制备E.coli JM109的感受态细胞，取出一支100 µL已制备好的保存在-70℃超低温冰箱中的感受态大肠杆菌，放在冰上，加入DNA连接液10 µL，冰上放置30 min。
然后42℃, 热击90 s。
取出0℃，放置2 min。
加入LB液体培养基400 µL，37℃摇床150 r/min，振荡培养45 min。
将离心管中的液体9,800 ×g离心1 min，用枪吸掉300 µL，剩余的菌液用枪混匀后全部涂布在含Amp、IPTG、X-Gal (终浓度均为100 mg/mL) 的LB固体平板上，37℃培养过夜。
1.4.6 阳性克隆子的挑选与质粒抽提观察培养皿上的转化子的生长状况，在超净台上用接种针从每个培养皿上挑取5个白色克隆子，接入含有Amp+(终浓度均为100 mg/mL)的LB液体培养基小试管中，37℃，180 r/min摇床上培养8 h。
将培养好的细菌全部倒入2 mL的离心管中，9,000 ×g离心1 min。
弃上清，得到菌体进行质粒抽提，具体操作步骤见说明书。
提取的质粒放在-20℃保存备用。
1.4.7 质粒PCR法验证插入片段以上述抽提的质粒为模板，用质粒PCR法验证插入片段是否有插入片段。
PCR扩增条件参照1.4.2。
1.4.8 序列测定将含插入片段的质粒，送往宝生物(大连)生物工程公司进行序列测定。
1.4.9 系统发育学分析从NCBI (National Center for Biotechnology Information)数据库中选取一些已知的序列，采用Clustal X 软件（ver. 1.8）将已知序列和测得的序列进行多重序列比对，比对完成后用MEGA生物软件(ver 3.1)中的邻接法构建系统发育树。
1.5麦曲中真菌的核糖体内转录基因间隔区分析(RISA)1.5.1 免培养法和液态富集培养后菌体总DNA的提取免培养法：称取1.0 g均一的麦曲样品于7 mL离心管中，加入提取缓冲液，采用氯化苄抽提样品的总DNA。
具体操作方法参照1.4.1。
液态富集培养法：液态培养结束后，菌悬液于10,000 ×g离心10 min 收集菌体，总DNA的提取方法参照1.4.1。
1.5.2 麦曲样品的RISA图谱分析以1.5.1方法中得到的总DNA为模版分别进行PCR扩增，具体扩增条件参照1.4.2。
PCR产物经PCR Purification Kit(上海华舜生物工程有限公司)纯化后，进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳。
100V电泳12 h。
电泳结束后，溴化乙锭染色15 min。
去离子水洗15 min，紫外系统成像拍照后，用手术刀割下胶中的各条带，放置于1.5 mL的离心管中，供回收DNA使用。
1.5.3 回收条带的克隆和序列测定在装有回收条带的离心管中加入50 µL的洗脱缓冲液[5](500 mmol/L乙酸铵，10 mmol/L乙酸镁，1mmol/L EDTA，0.1% SDS)，37℃水浴5 h，12,000 ×g离心10 min，取上清，用PCR Purification Kit 回收DNA。
然后以纯化的DNA为模板，进行克隆测序，以下操作步骤参照1.4.4-1.4.8所述。
1.5.4 ITS序列的比对和同源性分析测序结果经DNAMAN 3.0软件去载体后，将序列提交GenBank数据库，利用Blastn软件进行序列比对，将所得序列提交GenBank数据库获得登录号。
