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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910355893.4(22)申请日 2019.04.29(71)申请人 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)地址 510070 广东省广州市越秀区先烈中路100号大院56号(72)发明人 谢小保 文霞 张淑瑶 张志聪 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限公司 44001代理人 刘明星 朱聪聪(51)Int.Cl.C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01)C12Q 1/06(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/385(2006.01) (54)发明名称一种提高铜绿假单胞菌检测准确性方法(57)摘要本发明公开了一种提高铜绿假单胞菌检测准确性方法。
它是配制样品备检溶液、向样品备检溶液中加入叠氮溴化丙锭进行反应，反应完毕后提取细菌总DNA，再用实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌。
本发明采用铜绿假单胞菌PCR技术+PMA可检出传统方法无法检出的VBNC细菌，同时加入PMA可有效避免死菌和受损菌DNA扩增，由于VBNC细菌丧失了在平板培养基上的繁殖能力，传统平板培养法无法检出，而本发明是通过扩增细菌DNA的方法检测细菌数量，无需细菌具有繁殖能力，因此，本发明比传统方法检测准确性高。
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图2页CN 110106265 A 2019.08.09C N 110106265A权 利 要 求 书1/1页CN 110106265 A1.一种提高铜绿假单胞菌检测准确性的方法，其特征在于，包括以下步骤：配制样品备检溶液、向样品备检溶液中加入叠氮溴化丙锭进行反应，反应完毕后提取细菌总DNA，再用实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的用实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌是针对铜绿假单胞菌oprL基因进行实时荧光PCR检测。
铜绿假单胞菌检验方法标准【原创版2篇】篇1 目录1.铜绿假单胞菌的概述2.铜绿假单胞菌的检验方法3.铜绿假单胞菌在化妆品中的卫生标准4.铜绿假单胞菌的致病性和治疗药物5.铜绿假单胞菌的防控措施篇1正文一、铜绿假单胞菌的概述铜绿假单胞菌，又称绿脓杆菌，是一种广泛存在于土壤中的细菌。
其菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
铜绿假单胞菌编码三种 VI 型分泌系统，即 h1-t6ss、h2-t6ss 和 h3-t6ss。
其中 h1-t6ss 被认为是一种严格的细菌靶向途径，而 h2-t6ss 和h3-t6ss 通过作为靶向宿主细胞并促进铜绿假单胞菌感染的毒力。
二、铜绿假单胞菌的检验方法铜绿假单胞菌的检验方法主要包括以下几种：1.形态学观察：通过暗视野显微镜或相差显微镜观察菌体的形态和结构。
2.培养法：将采集的样本在特定的培养基上进行培养，观察菌落的形态和特征。
3.免疫学检测：通过抗原 - 抗体反应检测样本中铜绿假单胞菌的抗原或抗体。
4.分子生物学检测：如 PCR、DNA 测序等方法，通过对特定基因进行扩增和测序，判断样本中是否存在铜绿假单胞菌。
三、铜绿假单胞菌在化妆品中的卫生标准在化妆品中，铜绿假单胞菌的检测是非常重要的，因为铜绿假单胞菌对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症。
因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出铜绿假单胞菌。
四、铜绿假单胞菌的致病性和治疗药物铜绿假单胞菌具有较强的致病性，可引起各种感染，如皮肤感染、败血症等。
针对铜绿假单胞菌感染的治疗，可选用以下药物：1.半合成青霉素：如阿洛西林和哌拉西林，其中以哌拉西林为最常用。
2.第三代头孢菌素：如头孢他啶、头孢哌酮。
3.其他内酰胺类药物：如亚胺配能及氨曲南。
4.氨基糖苷类：如庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和异帕米星。
5.氟喹酮类：如氧氟沙星、环丙沙星及氟罗沙星等。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201910273403.6(22)申请日 2019.04.05(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 110144305 A (43)申请公布日 2019.08.20(83)生物保藏信息CCTCC M 2019048 2019.01.15(73)专利权人 华中农业大学地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人 刘军伟 李国怀 何昊 叶俊丽 朱炜 (74)专利代理机构 武汉泰山北斗专利代理事务所(特殊普通合伙) 42250代理人 程千慧(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)A01N 63/27(2020.01)C09K 17/14(2006.01)A01P 21/00(2006.01)C12R 1/40(2006.01)审查员 周茂新(54)发明名称一种恶臭假单胞菌及其菌剂和应用(57)摘要本发明涉及一种恶臭假单胞菌，为恶臭假单胞菌WH -B3(Pseudomonas putida WH -B3)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2019048。
本发明提供了一种含有上述恶臭假单胞菌的微生物菌及微生物菌剂的制备方法，并提供了上述微生物菌剂在降解苯甲酸和缓解桃连作障碍中的应用方法。
本发明的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida WH -B3对苯甲酸具有极强的降解能力，在24小时内对土壤中500mg kg -1苯甲酸的降解效率能够达到99％以上，且降解产物无毒，具有良好的开发应用前景。
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图2页CN 110144305 B 2020.03.17C N 110144305B权 利 要 求 书1/1页CN 110144305 B1.一种恶臭假单胞菌，其特征在于，为恶臭假单胞菌WH-B3(Pseudomonasputida WH-B3)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M2019048。
铜绿假单胞菌检查1 简述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤，水及空气中，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品，本菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤、眼科及其他外科疾患中长引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度。
国内外药典均将铜绿假单胞菌列为检查项目之一。
铜绿假单胞菌按增菌，分离、纯培养、革兰染色、镜检及生化试验等步骤进行检验。
2 仪器、设备和用具（见大肠埃希菌2）。
3 试液、指示液3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液[附录3.1，3.3]。
3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[附录3.2]。
3.3 1%盐酸二甲基对苯二胺试液[附录2.1]。
3.4 盐酸试液[附录2.12]。
3.5 氯仿[附录1.57]。
4 培养基4.1 营养肉汤培养基[附录5.1]。
4.2 胆盐乳糖（BL）培养基[附录5.6]。
4.3 营养琼脂培养基[附录5.2]。
4.4 溴代十六烷基三甲胺[附录5.14]。
4.5 绿脓菌素测定用培养基（POP琼脂）[附录5.26]。
4.6 明胶培养基[附录3.27]。
4.7 硝酸盐胨水培养基[附录5.28]。
5 对照用菌液铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌加入量含10～100cfu（一般用量为0.1ml），菌数测定在做阳性对照实验用营养琼脂浇碟或平板涂布经培养后计数确定。
6 操作方法6.1 供试品的取样量（见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3）。
6.2 供试液的制备（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）；（大肠埃希菌6.2）。
6.3 增菌培养取胆盐乳糖培养基2份，每份100ml，1份加入1:10供试液10ml（相当于供试品1g或1ml）。
铜绿假单胞菌检测（滤膜法）
录入时间:2015-4-27 10:30:42 来源：青岛海博生物
一、原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒温箱中培养48h，能够在溴化十六烷基三甲铵选择性培养基上生长并产生绿脓菌素，或者能够在溴化十六烷基三甲铵选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。
二、培养基和试剂
1.假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（配制好之后低温避光保存）
2.金氏B（King’s B）培养基（配制好之后低温避光保存）
3.乙酰胺肉汤（用蒸馏水配制，配置好之后低温避光保存）
4.营养琼脂
5.氧化酶试剂
6.钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）
7.设备和仪器
8.玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高压蒸汽灭菌15分钟
9.恒温培养箱：36℃±1℃
10.紫外灯：波长应为360±20nm
11.滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ（处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将
滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15 min。
前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。
建议使用一次性无菌滤膜。
）12.显微镜：10×～100×
13.冰箱：0℃～8℃
三、操作流程图。
铜绿假单胞菌的鉴定
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本文概述：铜绿假单胞菌为条件致病菌，对抵抗力较弱的人群存在较大健康风险，容易引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。
铜绿假单胞菌如何鉴定呢?下面小编带您了解一下。
铜绿假单胞菌可在选择培养基上培养并产生绿脓色素的即可鉴定为铜绿假单胞菌，若无色素或在鉴别培养基上不发酵乳糖或葡萄糖的革兰阴性杆菌，可行以下方法进一步鉴别。
1.色素鉴定：可将细菌接种于KingA、B斜面培养基，37℃24h或置室温观察5天。
(1)绿脓色素：在KingA斜面上呈深绿色，液体培养基接触空气处绿色明显。
若色素不明显或混杂其他色素，可加氯仿于斜面，置室温观察1～24h，如仍不明显，可在氯仿液中滴加稀盐酸，绿脓色素在酸液层呈红色。
(2)绿脓荧光色素：铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌在KingB斜面培养基上呈现黄绿色荧光。
(3)红脓色素：在KingA斜面培养基上呈红紫色，如置37℃24h红色不明显，可再置室温3～5天观察。
铜绿假单胞菌产生红脓毒素者较少见。
(4)黑脓毒素：铜绿假单胞菌在含蛋白胨培养基中生长时常有黑脓毒素产生。
嗜麦。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910384933.8(22)申请日 2019.05.09(71)申请人 宁夏回族自治区食品检测研究院地址 750004 宁夏回族自治区银川市金凤区凤台路180号金宇名庭南区1号楼(72)发明人 岳苑 李睿 周梦诗 徐娟 吴明 赵飞 何微 贾冰凝 汪洪 高俊峰 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人 王文君 陈征(51)Int.Cl.C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/385(2006.01)C12R 1/40(2006.01) (54)发明名称鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法(57)摘要本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。
本发明通过对铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的基因组序列进行分析，提供了用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。
在此基础上，建立了利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。
该方法具有较高的灵敏度、特异性和准确性，能够高效检出铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌，具有操作简单、成本低、快速、高通量等优点，可用于临床检测、农业生产、食品安全等领域的假单胞菌的鉴别。
权利要求书1页 说明书9页序列表3页 附图7页CN 110106266 A 2019.08.09C N 110106266A1.用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。
2.权利要求1所述特异性引物对在制备用于鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒中的应用。
3.用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包含序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对。
纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法研究
李轲;禹建鹰;郭华麟;张淑霞;郭会清
【期刊名称】《棉纺织技术》
【年(卷),期】2018(46)6
【摘要】探讨纺织品中铜绿假单胞茵的快速检测方法.将免疫磁珠富集技术和环介导等温扩增技术结合起来,利用免疫磁珠富集技术富集样品中铜绿假单胞菌,富集液提取DNA,进行环介导等温扩增技术特异扩增.以49株铜绿假单胞茵菌株和21株非铜绿假单胞菌菌株测定特异性,以49株铜绿假单胞菌阳性茵液稀释成不同梯度测试灵敏度.结果表明:该方法特异性、灵敏度符合要求,检测限可达4.5 CFU/mL,且简化了测试流程,使检测时间显著缩短.认为:所建立的纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法鉴别准确、快速,尤其适用于基层检验、检疫机构.
【总页数】5页(P30-34)
【作者】李轲;禹建鹰;郭华麟;张淑霞;郭会清
【作者单位】河南出入境检验检疫局,河南郑州,450000;河南出入境检验检疫局,河南郑州,450000;四川农业大学,四川雅安,625000;河南出入境检验检疫局,河南郑州,450000;河南出入境检验检疫局,河南郑州,450000
【正文语种】中文
【中图分类】TS107
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5.纺织品中余氯、甲醛、pH的快速检测方法研究与应用 [J], 文杰清
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910384933.8
(22)申请日 2019.05.09
(71)申请人 宁夏回族自治区食品检测研究院
地址 750004 宁夏回族自治区银川市金凤
区凤台路180号金宇名庭南区1号楼
(72)发明人 岳苑 李睿 周梦诗 徐娟 吴明
赵飞 何微 贾冰凝 汪洪
高俊峰
(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人 王文君 陈征
(51)Int.Cl.
C12Q 1/689(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12R 1/385(2006.01)C12R 1/40(2006.01) (54)发明名称
鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法
(57)摘要
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及
鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。
本发
明通过对铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的基因
组序列进行分析，提供了用于高分辨熔解曲线技
术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性
引物对，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。
在此基础
上，建立了利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假
单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。
该方法具有较高
的灵敏度、特异性和准确性，能够高效检出铜绿
假单胞菌和恶臭假单胞菌，具有操作简单、成本
低、快速、高通量等优点，可用于临床检测、农业
生产、
食品安全等领域的假单胞菌的鉴别。
权利要求书1页 说明书9页序列表3页 附图7页CN 110106266 A 2019.08.09
C N 110106266
A
权 利 要 求 书1/1页CN 110106266 A
1.用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。
2.权利要求1所述特异性引物对在制备用于鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒中的应用。
3.用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包含序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对。
4.权利要求1所述特异性引物对或权利要求3所述试剂盒在鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌中的应用。
5.权利要求1所述特异性引物对或权利要求3所述试剂盒在饮用水、食品、农产品的假单胞菌检测中的应用，或在农业生产安全或食品安全监测中的应用。
6.一种利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的序列特征判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行荧光PCR扩增；
(3)采用高分辨熔解曲线技术分析PCR扩增产物的熔解曲线峰形，判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性10min；95℃变性15s，68℃退火40s，35个循环，升降温速度1.6℃/s；
熔解曲线的制作程序包括：①95℃、10s，60℃、1min；②95℃、15s，60℃、15s；其中，步骤
①至步骤②过渡的升温速率为0.025℃/s；步骤①和步骤②的升降温速率为1.6℃/s速率。
9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的30μL反应体系如下：2×Mix Taqman PCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、100×Rox Reference Dye Ⅱ 0.3μL、20×Evagreen in Water 1.5μL、待测样品基因组DNA 2μL，以灭菌纯水补足反应体系至30μL。
10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，根据熔解曲线制作熔解峰值图，若Tm值在83～84℃范围内出现熔解峰且峰形与恶臭假单胞菌的标准菌株一致，则判断待测样品恶臭假单胞菌检出；若Tm值在84～85℃范围内出现熔解峰且峰形与铜绿假单胞的标准菌株一致，则判断待测样品铜绿假单胞菌检出。
2。
