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第31卷第1期2009年2月 大连医科大学学报Journa l of Da l i a n M ed i ca l U n iver sityVol .31No .1Feb.2009VEGF 165对脱细胞真皮基质血管化影响的研究3李菲菲1,米立国2(1.大连医科大学人体解剖学教研室,辽宁大连116044;2.河北医科大学人体解剖学教研室,河北石家庄050000)摘要:[目的]观察十二烷基硫酸钠(sodiu m dodecyl sulfa te,S DS )和NaOH 复合消蚀法制备的胎儿脱细胞真皮基质(AD M )的组织相容性,以及血管内皮生长因子(VEGF)对AD M 血管化的影响。
[方法]将足月胎儿皮肤用S DS 和NaOH 复合消蚀,制备AD M (厚0.3mm )。
用重约300g 的S D 雄性大鼠45只,随机分为AD M 、AD M +r AAV /LacZ 和AD M +r AA V /VEGF 1653组进行真皮片皮下包埋实验。
术后的2、4、6周分别取材,经HE 染色或以V EGF 165、基质金属蛋白酶-1(MM P -1)、组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1(TI M P -1)的单克隆抗体进行免疫组织化学染色,检测3种蛋白质在移植后的皮肤中的表达情况。
观察并比较各组中AD M 血管密度,进行图像处理和统计学分析。
[结果]AD M 无细胞成分,胶原纤维结构规整;术后2周包埋AD M 组织中可见到新生血管,及VEGF 阳性细胞;无明显的炎性细胞浸润。
AD M 临近组织中MMP -1和TI M P -1均明显表达,MMP -1的表达高于TI M P -1;术后4周各组细胞数量和新生血管均高于2周。
此时MMP -1的表达高于TI M P -1,但TI M P -1的表达较2周时有所增强;术后6周r AAV /VEG F 165实验组中VEG F 阳性细胞和血管密度明显高于AD M 空白组和r AAV /LacZ 对照组(P <0.05)。
改良法处理人脱细胞真皮的脱细胞效果及其与体外细胞的相容性研究作者：邓霞钟惠兰来源：《中国美容医学》2019年第10期[摘要]目的：研究经改良法处理后的人脱细胞真皮的脱细胞效果及其与体外细胞的相容性。
方法：分别使用传统方法与改良方法脱去健康人皮肤的细胞成分，观察两种方法制备的脱细胞真皮的外观、HE染色结果、脱细胞效率、胶原纤维的完整度、体外降解时间、孔隙率、孔腔直径、细胞毒性及体外细胞相容性，并进行对比分析。
结果：改良法制备的脱细胞真皮柔韧度更好，塑形性更高;经HE染色后，改良法制备的真皮孔隙均匀、结构疏松、胶原纤维较传统方法更为纤细;改良法制备的脱细胞真皮的孔隙率及真皮网状面孔隙直径均优于传统方法，组间比较差异有统计学意义（P0.05）;改良方法制备的脱细胞真皮8d内连续检测结果均显示无细胞毒性。
经改良法制备的脱细胞真皮上的干细胞浸润基底层，且浸润范围随时间增加而扩大，细胞数量明显增加，而传统方法制备的脱细胞真皮无明显浸润现象。
结论：改良方法不仅操作简单，且制备的脱细胞真皮的脱细胞效果较好，无细胞毒性，体外相容性更佳。
[关键词]脱细胞真皮;相容性;改良法;体外细胞;孔隙率[中图分类号]R329.2; ; [文献标志码]A; ; [文章编号]1008-6455（2019）10-0102-03Abstract： Objective; To study the acellular effect of human acellular dermis treated by modified method and its compatibility with cells in vitro. Methods The appearance， HE staining results，acellular efficiency， integrity of collagen fibers， degradation time in vitro， porosity， pore diameter， cytotoxicity and cytocompatibility of acellular dermis prepared by the two methods were observed and compared. Results; The modified acellular dermis had better flexibility and higher plasticity. After HE staining， the improved acellular dermis had uniform pore， loose structure and finer collagen fibers than the traditional method. The porosity and pore diameter of the acellular dermis prepared by the improved method were better than the traditional method， and the difference between the two groups was significant （P0.05）. The acellular dermis prepared by the improved method showed no cytotoxicity within 8 days. Stem cells infiltrated the basal layer of the acellular dermis prepared by the improved method， and the infiltration range increased with time， and the number of cells increased significantly. However， the acellular dermis prepared by the traditional method had no obvious infiltration. Conclusion; The modified method is not only simple in operation， but also has better acellular effect， no cytotoxicity and better compatibility in vitro.Key words： acellular dermis; compatibility; improved method; in vitro cell; porosity無论是天然牙还是种植牙，牙龈缺损、过窄或过薄，都对美观性产生影响，且不利于牙周健康。
胎猪脱细胞主动脉作为小口径组织工程血管替代物的体内试验研究[摘要]目的：研究胎猪脱细胞主动脉（decellularized aorta of fetal pigs，dafp）的生物相容性，确定其是否有作为支架材料用于小口径组织工程血管移植的潜力。
方法：利用胰酶和核酸酶联合的脱细胞方法来制备胎猪主动脉脱细胞基质(dafp)，将其作为小口径组织工程血管的生物支架材料移植在成年犬单侧颈总动脉处，并监测其移植处的血流通畅情况，后期又通过组织学染色观察组织工程血管的组织学结构；扫描电镜观察血管的内表面结构；透射电镜观察其内表面的内皮细胞再生情况。
结果：组织学染色结果表明构建的小口径组织工程血管具有完整的内膜层及中膜层结构；扫描电镜结果显示组织工程血管内表面覆盖着完整的内皮细胞层。
结论：dafp有作为小直径组织工程血管支架用于体内移植的潜力。
[关键词]组织工程；血管移植；生物支架材料；细胞外基质[中图分类号]r318 [文献标识码]a [文章编号]1008-6455（2012）05-0773-03the vivo study on decellularized aorta of fetal figs can be substituted for tissue engineered small-diameter blood vesselzhang ying-bo,liu guo-feng,li qing-chun,yang da-ping (department of plastic surgery,the second affiliatedhospital of harbin medical university,harbin150086,heilongjiang,china)abstract: objective to study the biocompatibility of the dafp,determining it weather have a potential as a scaffold of tissue engineered small-diameter blood vessel graft. methods carotid artery of fetal pig was removed cells by using trypsin／edta,ribonuclease anddesoxyribonuclease.afterward， we transplanted the dafp into unilateral carotid artery of 6 adult dogs individually.both the dafp and the tissue which have been transplanted were evaluated with hematoxylin and eosin (h&e) staining,scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. results h＆e staining and electron microscopy confirmed that carotid arteries have intact monolayer endothelial cells. conclusion decellularized aorta of fetal figs have the ability to substitute for further small-diameter vascular tissue engineering.key words:tissue engineering， vascular graft， biological scaffold， extracellular matrix动脉粥样硬化及周围血管疾病是世界范围内危害人类健康的主要疾病，并且发病率逐年上升[1]，病情严重的患者常需要通过小口径血管(内径<6mm)移植的手段进行外科手术治疗。
异种脱细胞真皮基质临床应用研究与进展异种脱细胞真皮基质作为新型生物材料，是通过物理、化学及生物方法去除动物（目前主要为猪）皮肤组织的表皮细胞以及真皮层内的细胞成分，保留胶原等细胞外基质蛋白和基底膜而制成。
相关研究表明其具有快速血管化，低抗原性且性质较稳定等特点，已广泛应用于临床。
本文就异种脱细胞真皮基质的特点及其临床应用作一综述。
Abstract：The xenogenic acellular dermal matrix（Xeno-ADM）， a new biomaterial，remove epidermal cells and the cellular components of the dermal layer of the skin （now mainly pig）by physical，chemical and biological methods. Collagen，other extracellular matrix proteins and basement membrane are reserved in Xeno-ADM. Related studies have shown that ADM has the characteristics of rapid vascularization，low antigenicity and stable nature，and has been widely used in clinical treatment. The characteristics and clinical applications of xenogenic acellular dermal matrix are reviewed in this paper.Key words：xenogenic acellular dermal matrix；manufacture method；compatibility；clinical application由于异种脱细胞真皮基质（Xenogenic acellular dermal matrix，Xeno-ADM ）以下稱为ADM，在制备过程中去除了表达抗原的细胞成分，抗原性下降，排异反应减弱。
无机生物材料生物相容性研究进展姓名：李艳芳学号：20090413310042学院：材料与化工学院专业：材料科学与工程摘要：生物相容性是指材料与人体之间相互作用后产生的各种复杂的生物、物理、化学等反应的一种概念，是一种材料能否应用于人体治疗的基础。
本文主要介绍了金属生物医用材料、陶瓷生物医用及非金属复合生物医用材料的生物相容性研究进展，并概括介绍了无机材料的应用及其发展前景。
关键词：生物相容性金属材料陶瓷材料1前言生物相容性是指材料与人体之间相互作用后产生的各种复杂的生物、物理、化学等反应的一种概念。
植入人体内的生物材料及各种人工器官、医用辅助装置等医疗器械，必须对人体无毒、无致敏性、无刺激性、无遗传毒性和无致癌性，对人体组织、血液、免疫等系统不产生不良反应。
生物相容性表征生物医用材料的生物学性能，决定于材料和活体系统间的相互作用。
这个相互作用包括两个方面：一是宿主反应，即材料对活体系统的作用或活体系统对材料的反应，二是材料反应，即活体系统对材料的作用或材料对活体系统的反应。
由于生物医用材料必须和血液接触，因此它应具有抗凝血和抗血栓性能，不会引起血液凝固和溶血现象。
其次生物医用材料还要与周围组织相接触，要求不引起周围组织产生局部或全身性反应，因此它还必须具有良好的组织相容性[l]，如良好的内皮细胞化行为。
对材料与生物体相互作用机制的大量研究表明：生物医用材料表面的化学成分、结构、表面形貌、表面的能量状态、亲疏水性、表面电荷等表面化学、物理及力学特性均会影响生物材料的生物相容性，这些因素既相互独立又相互协同，构成了生物材料表面对细胞作用的复杂性[2]。
本文主要介绍了金属生物医用材料、陶瓷生物医用及非金属复合生物医用材料的生物相容性研究进展，并概括介绍了无机材料的应用及其发展前景。
2金属材料金属材料作为历史最悠久的生物材料，因其良好的力学性能，作为植入物、种植体和支架在骨科[3]、口腔修复[4]和心血管治疗[5]等领域一直有着广泛的应用。
脱细胞基质与血管内皮细胞体外相容性的研究郭铁芳 杨大平 韩雪峰 杜金荣 张 颖 【摘 要】 目的 将猪血管内皮细胞和异体猪血管脱细胞基质相结合,探讨开发一种制备血管移植物的新方法。
方法 分别利用0.1%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸钠(ED TA)和1.0%T riton X2100对猪主动脉作用24小时和176小时进行脱细胞。
异体猪血管内皮细胞分离出来并进行体外细胞扩增,再将脱细胞的血管内表面种植上血管内皮细胞。
通过光镜和扫描电镜检测脱细胞血管基质是否存在细胞成分和内皮细胞是否生长其上。
结果 酶2化学除垢剂的脱细胞方法几乎使细胞完全脱落,且基质纤维的三维结构变得疏松。
体外扩增的异体猪血管内皮细胞可以种植在脱细胞基质上并且具有伸展和增殖功能。
结论 T riton X2100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质与异体猪血管内皮细胞具有良好的生物相容性,能结合到一起并在体外生成血管移植物。
【关键词】 组织工程 血管移植物 细胞外基质 血管内皮细胞 种植EXPER I M ENTAL STUDY OF COM PATIB I L IT Y BET W EEN ACELL UAR IZED ALLOGEN I C M ATR IX AND EN-DOTHEL I AL CELL IN V ITR O GUO T ie2f ang,YA N G D a2p ing,H A N X ue2f eng,et a l.D ep a rt m en t of P lastic S u rg ery,the S econd H osp ita l of H a rbin M ed ica l U n iversity.H a rbin H einongj iang,P.R.Ch ina150086【Abstract】 Objective To develop a new m ethod fo r a tissue engineered vascu lar graft by com b in ing endo the2 lial cells and an acelluarized allogen ic m atrix.M ethods A cellu larized m atrix tubes w ere ob tained by a0.1%tryp sin and0102%ED TA so lu ti on fo r24hou rs and1%T riton X2100fo r176hou rs,respectively.Endo thelial cells w ere iso lat2 ed from alloao rta and expanded in vitro.F inally,the inner su rface of acellu larized m atrix w as reseeded w ith endo thelial cells.A cellu larity and reseeding w ere analysed by ligh t m icro scopy and scann ing electron m icro scopy.Results T he acellu larizati on p rocedu re resu lted in an al mo st comp lete removal of the o riginal cells and the loo se th ree2di m en si onal (3D)m atrix.T he acellu lar m atrix cou ld be reseeded w ith expanded endo thelial cells in vitro,and endo thelial cells had the po ten tial of sp read and p ro liferati on.Conclusion A cellu lar m atrix p roduces by T riton X2100and tryp sin po ssesses satisfacto ry b i ocompatib ility fo r allogen ic endo thelial cell.V ascu lar grafts can be generated in vitro by a com b inati on of endo thelial cells and allogen ic acelluarized m atrix.【Key words】 T issue engineering V ascu lar graft Ex tracellu lar m atrix V ascu lar endo thelial cell SeedingFounda tion Ite m s:N ati onal N atu ral Science Foundati on of Ch ina(30170970);N atu ral Science Foundati on ofH einongjiang P rovince(D0021) 血管疾病是我国目前死亡率最高疾病之一,血管移植是其主要的外科治疗手段。
目前临床最常应用血管替代物为自体大隐静脉,其中短期效果尚可。
但由于血液动力学等因素的改变而易发生血管内膜增生、管壁纤维化和血管瘤等,因此不能满足永久替代的要求而往往需要再次手术[1]。
涤纶(dacron)等人工材料,可部分模拟人体血管的某些功能,但与自身血管相比弹性系数低、顺应性及组织相容性差,可引起机体不同程度的免疫排斥反应。
我们应用胰蛋白酶和T riton X2100对猪主动脉进行处理,并以此为支架材料种植异体猪血管内皮细胞,构建新型的组织工程血管,为探索血管移植物的来源提供一条新的思路。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170970);黑龙江省自然科学基金资助项目(D0021)作者单位:哈尔滨医科大学附属第二医院整形外科(哈尔滨, 150086)1 材料与方法1.1 材料和试剂 于屠宰场获取80～100kg家猪主动脉。
T riton X2100, 型胶原酶(Sigm a);血管内皮细胞生长因子(endo thelial cell grow th facto r,ECGF);D2H ank’s平衡盐溶液,PB S溶液,胰蛋白酶(1∶250),乙二胺四乙酸钠(ED TA),胎牛血清(fatal bovine serum,FB S), M199培养基,L2谷氨酰胺(Gib ico)。
1.2 方法1.2.1 猪主动脉脱细胞的制备 获取猪的胸主动脉两根,保存在4℃D2H ank’s平衡盐溶液中。
热缺血时间少于10分钟。
剥去其中一根血管外膜,将血管浸入1%新洁尔灭溶液中浸泡30分钟消毒。
PB S冲洗若干遍,去除血管表面的新洁尔灭。
然后将血管置于50m l 离心管中,在37℃、5%CO2的环境下,0.1%胰蛋白酶、0.02%ED TA 作用24小时。
再用1%的T ritonX 2100溶液中26℃～28℃水浴振荡176小时。
再将血管用PB S 液反复冲洗数次以祛除残余物质,保存在4℃含Ca 2+、M g 2+的D 2H ank’s 溶液中,并取材作H E 染色和扫描电镜。
1.2.2 细胞的提取和扩增 用含有青、链霉素(100U m l )的D 2H ank’s 平衡盐溶液浸泡另一根猪主动脉10分钟后,剥去血管外膜,将其剪成2c m ×2c m 的组织块。
组织块内膜面朝下浸于用0.1% 型胶原酶中,胶原酶仅浸没过内膜面。
在37℃、5%CO 2孵箱中消化15～20分钟。
用含10%FB S 的M 199培养液终止消化。
收集消化液,离心(1000r m in )5分钟。
弃上清,D 2H ank’s 洗涤沉淀细胞两遍。
用M 199培养液制成细胞悬液,其中含10%FB S ,0.15%ECGF ,L 2谷氨酰胺300Λg m l 。
调节细胞密度为510×105 c m 2。
置入50m l 培养瓶中37℃、5%CO 2孵箱中培养。
每2～3天换液一次。
用0.25%胰酶和0.02%ED 2TA (PB S 为溶剂)传代培养。
取第2～5代血管内皮细胞用于种植和透射电镜检查。
1.2.3 材料的处理和细胞的种植 将脱细胞的猪主动脉在无菌条件下剪成直径为1.5c m 的组织块5块,置于24孔培养板中(内膜面朝上)紫外线灯下干燥24小时,使其微干。
再滴入1～2滴胎牛血清,置于37℃、5%CO 2孵箱中孵育1～2小时。
将血管内皮细胞用0125%胰酶和0.02%ED TA 常温下作用2～3分钟,见细胞变圆,间隙增大,轻微晃动培养瓶见有细胞已悬浮,即可用含10%FB S 的M 199培养液终止消化。
离心(1000r m in )5分钟后,用D 2H ank’s 洗涤细胞沉淀物两遍。
用M 199培养液制成细胞悬液,其中含10%FB S 、0.15%ECGF 及L 2谷氨酰胺300Λg m l 。
调节细胞密度510×106 c m 2,种植于预先放有脱细胞基质的24孔培养板中,置于37℃、5%CO 2孵箱中培养。
12小时换液一次,于种植后16小时取材作H E 染色和扫描电镜。
2 结果2.1 血管内皮细胞培养第2～5代血管内皮细胞生长状况良好,细胞呈扁平的短梭形或多角形,大小均匀,核仁清晰。
细胞单层呈典型的铺路石样镶嵌排列生长(图1)。
透射电镜检测可见典型的血管内皮细胞特征性细胞器W 2P 小体,其纵切面内有平行的细管包埋在高密度的基质中(图2)。
表明培养的细胞为血管内皮细胞。
2.2 组织学检查2.2.1 种植前脱细胞血管基质 随机抽取8个样本未见蓝紫染核物质和细胞碎片残留,但可见弹力纤维排列规整。
脱细胞血管基质已完全无细胞成分存在(图3)。
2.2.2 种植血管内皮细胞后脱细胞血管基质 随机抽取8个样本内膜面可见有不连续蓝紫染的细胞存在。
其余部分无核物质和细胞碎片残留。
血管内皮细胞已经种植在脱细胞基质上(图4)。
图1 第5代血管内皮细胞均呈扁平的短梭形或多角形,大小均匀,核仁清晰。
细胞单层呈典型的铺路石样镶嵌排列生长(×200) 图2 纵切面见平行细管包埋在高电子密度的基质中,箭头示W -P 小体(×40000) 图3 经胰酶和Tr itonX -100分别作用24、176小时后未见蓝染核物质和细胞碎片残留,仅见弹力纤维和胶原(HE ×200) 图4 脱细胞基质种植血管内皮细胞16小时后仅内膜面有不连续蓝紫染的细胞存在,其余部分无细胞存在(HE ×200)F ig .1 The 2nd and 5th passage of endotheli al cells showed f lat short -sp i ndle shape or polygon and un ifor m ity of size ,and nucleus was clear .The endotheli al cell layer showed slabstone appearance enchased arrange (×200) F ig .2 W -P s mall body i ndicated by the arrowhead was pole -like cell organelle .Its slited surface showed parallel tubule e mbedded i n h igh electron -den sity matr ix (×40000) F ig .3 A cellular ized matr ix tubes were obta i ned by a 0.1%trypsi n and 0102%ED TA solution for 24hrs and 1%Tr iton X -100for 176hrs ,and there was no blue -sta i ned nucleus and cell p ieces ,but the re ma i n i ng extracellular matr ix con sisti ng of collagen and elastic f ibers (HE ×200) F ig .4 Af ter 16hrs when endotheli al cellswere seeded on acellular matr ix ,HE sta i n i ng showed round endotheli al cells on the surface ,and there was no penetration of any cell type i n to the acellular matix (HE ×200)2.213 扫描电镜 种植前脱细胞血管基质的内皮细胞层被全部祛除,细胞外基质纤维粗细不等相互交织排列,呈现1～10Λm 的微孔(图5)。
