人脐静脉血管内皮细胞体外培养的方研究

汉防己甲素对人脐静脉内皮细胞VEGF mRNA和Flk1蛋白的影响（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的观察汉防己甲素对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells , HUVEC)中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor , VEGF)mRNA 和血管内皮生长因子受体-2(Fetal liver kinase，Flk1)蛋白表达的影响,探讨其可能的作用机制。

方法应用MTT法测定不同浓度(10-3、10-4、10-5、10-6M)Tet对HUVEC的抑制作用，用免疫组织化学和原位杂交方法分别检测血管内皮生长因子受体-2(Flk1)蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA在血管内皮细胞中的表达。

结果(1)Tet 能抑制HUVEC增殖且具有量效依赖关系;(2)Flk1蛋白、VEGF mRNA在1640对照组、Tet实验组中的表达率分别为(0.742±0.057，0.445±0.066)，(0.596±0.047，0.324±0.049)。

Tet明显降低Flk1蛋白、VEGF mRNA在内皮细胞中的表达(P0.05)。

结论汉防己甲素下调人脐静脉内皮细胞中VEGF mRNA和Flk1蛋白的表达，从而抑制人脐静脉内皮细胞增殖。

【关键词】汉防己甲素;人脐静脉内皮细胞;血管内皮生长因子受体;血管内皮生长因子Flk1 protein and VEGF mRNA in tetrandrine on human umbilical vein endothelial cellsLI Dai,LI Qing-chun.Department of Ophthalmology,Xianning College, Xianning 437100,China[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of tetrandrine (Tet) on the VEGF mRNA and Flk1 in the third passage human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) in vitro and discuss the drug effects of Tetrandrine in anti-angiogenesis.Methods Cultured HUVEC were exposed to different concentrations of Tet solution(10-3、10-4、10-5、10-6M) and investigated by MTT assay. Using immunochemistry to observe the expression of Flk1 and VEGF mRNA was examined by utlizing in situ hybridization (ISH) in cultured HUVEC.Results (1)Tet (10-3、10-4、10-5、10-6M) significantly suppressed the proliferation of HUVEC in vitro and showed a dose-dpendent tendency. (2)The rate of the expression of Flk1 and VEGF mRNA in Tet-treated group was 0.445±0.066，0.324±0.049, respectively and that in control group was 0.742±0.057, 0.596±0.047，respectively.Conclusion Tetrandrine at some concentrations can suppress the expression of Flk1 and VEGF mRNA in cultured HUVEC, and inhibit HUVEC’s proliferativeactivity. Tetrandrine is a potent antiangiogenic agent.[Key words] Tetrandrine; human umbilical vein endothelial cell; Flk1; VEGF眼部新生血管是许多种眼科疾病的常见并发症之一,常导致视力减退或盲，而血管内皮细胞生长因子(VEGF)在血管生成过程中起着重要作用[1],因此近年来,新生血管研究的体外实验大多都集中在防治血管内皮细胞生长因子和其特异性受体的相关研究上。

胶原酶脐带灌注消化法在人脐带静脉内皮细胞的原代分离培养中的作用谢明斌;刘梅林【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2009(049)051【摘要】目的探讨人脐带静脉内皮细胞原代分离培养方法,为血管内皮功能及其相关疾病的研究奠定基础.方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶脐带静脉灌注消化法,分离得到血管内皮细胞后,加入M199混合培养液,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养,以0.25%胰蛋白酶进行消化传代培养.细胞鉴定采用形态学方法、透射电镜法以及细胞Ⅷ因子免疫化学法.结果原代人脐静脉内皮细胞约24 h后完全贴壁,第3～4天融合成单层,呈铺路石状镶嵌排列;细胞透射电镜观察可见特征性Weibel-Palade小体以及细胞表面大量微绒毛;细胞Ⅷ因子抗原免疫组化以及荧光显示均呈阳性反应,证实所分离培养细胞为人脐带静脉内皮细胞.结论采用胶原酶脐带静脉灌注消化法可分离得到较为纯化的内皮细胞,并可在体外连续大量增殖传代,5代内的细胞均可用于研究.【总页数】3页(P10-12)【作者】谢明斌;刘梅林【作者单位】北京大学第一医院,北京100034;北京大学第一医院,北京100034【正文语种】中文【中图分类】R714.56【相关文献】1.人脐带静脉内皮细胞的分离及长期培养 [J], 周少元;郭辉至2.人脐带间充质干细胞的条件培养基对炎症因子致人脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用 [J], 段辉3.人脐带间充质干细胞培养上清液对甲状腺乳头状癌细胞诱导人脐静脉内皮细胞血管形成的影响 [J], 丁超; 董利阳; 郑婷婷; 刘佳梦; 康萍; 张助; 毛朝明4.胶原酶消化刮取再消化法分离培养犬静脉内皮细胞的实验研究 [J], 李刚;萧晗;唐军建;王峰;游庆军5.翻转消化法和灌注消化法分离培养兔耳缘静脉内皮细胞的比较 [J], 陈娟;王廷华;黄桂琴;易伟斌;徐岩泽;罗哲文;胡竹林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

复方血塞通滴丸对血管内皮细胞增殖作用的研究王建明;宋鸽;刘春凤【期刊名称】《中医药信息》【年(卷),期】2011(028)002【摘要】目的:研究复方血塞通滴丸对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖的影响.方法:制备含不同浓度的复方血塞通滴丸药液的细胞培养液(30mg·L-1,100mg·L-1,300mg·L-1)分别作用于培养的HUVEC细胞24h,48h.通过细胞形态学、MTT法检测复方血塞通滴丸对HUVEC的增殖的影响.结果:复方血塞通滴丸组光密度(OD)值明显高于对照组;48h 的OD值明显高于24h的OD值.结论:复方血塞通滴丸能够明显地促进HUVEC细胞增殖,且对浓度和时间有一定的依赖性.提示复方血塞通滴丸能够有效地改善血液循环,起到活血化瘀的作用.【总页数】4页(P68-71)【作者】王建明;宋鸽;刘春凤【作者单位】黑龙江中医药大学中医药研究院,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.碘促进血管内皮细胞增殖作用与MEK1相关性及碘对血管内皮细胞表达VEGF 影响的实验研究 [J], 李鹏飞;腾飞;庄银萍;祖茂衡;张庆桥2.MiR-495通过下调PCNA抑制人血管内皮细胞增殖的作用研究 [J], 郑华峰;陶晶;张斌;王纯;吴淳3.黄芪甲苷与阿魏酸合用调控JAK-STAT通路促进血管内皮细胞增殖作用的研究[J], 李玉梅;鲍慧玮;王楚盈;张亚杰;韩冬;潘建衡;方晶;黄金秋;刘仲康4.神经纤毛蛋白-1调控血管内皮细胞增殖迁移的功能作用和潜在机制研究 [J], 张煜;张洪伟;杨鹏;卢晨;黄尧;刘宇;胡佳5.养正祛瘀中药干预对子宫肌瘤患者组织中血管内皮细胞生长因子受体、雌孕激素受体表达水平的影响及细胞增殖中的作用机制研究 [J], 蔡卉;刘艺;徐静静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黄芪提取物对人脐静脉内皮细胞的促血管新生作用张燚;胡光;洪思佳;刘倩青;李铭源;王一涛【期刊名称】《中药药理与临床》【年(卷),期】2007(023)002【摘要】目的:研究黄芪提取物(RAE)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的促血管新生作用.方法:以体外培养HUVEC为模型,XTT法及细胞计数法检测不同剂量黄芪提取物对细胞增殖的影响;细胞迁移实验检测加药后细胞迁移能力;采用Transwell chamber进行细胞侵入实验检测黄芪提取物对细胞侵入能力的影响;管形形成实验观察加入黄芪提取物后细胞分化情况.结果:XTT法检测HUVEC在黄芪提取物浓度为12.5μg/ml时产生最大增殖效应,增殖率为42.04%.细胞计数法测得在黄芪提取物浓度为25μg/ml时细胞数目比对照组增多124.64%.同时发现在黄芪提取物浓度为25μg/ml时能够最大能力地诱导细胞侵入和管形形成,其侵入率为66.68%,管形分枝点增值率为44.38%;而在浓度为12.5μg/ml时能够最大限度地诱导细胞迁移,迁移率为74.94%.结论: 黄芪具有促进血管新生的作用.【总页数】4页(P34-37)【作者】张燚;胡光;洪思佳;刘倩青;李铭源;王一涛【作者单位】澳门大学中华医药研究院,澳门;澳门大学中华医药研究院,澳门;澳门大学中华医药研究院,澳门;澳门大学中华医药研究院,澳门;澳门大学中华医药研究院,澳门;澳门大学中华医药研究院,澳门【正文语种】中文【中图分类】R2【相关文献】1.三七总皂苷对人脐静脉内皮细胞的促血管新生作用 [J], 洪思佳;万建波;张庆文;张燚;胡光;刘倩青;李铭源;王一涛2.葛根素对人脐静脉内皮细胞的促血管生成作用及机制的研究 [J], 张杰;龚妙添3.重组人促红细胞生成素体外诱导人脐静脉内皮细胞血管新生作用的实验研究 [J], 姚晓艳;李红戈4.重组人促红细胞生成素对人脐静脉内皮细胞及鸡胚尿囊绒毛膜促血管生成的作用[J], 周乾毅;袁新初;程桂荣;张伟;杨逢春5.从调控血管内皮生长因子及其受体激活Notch信号通路角度探讨生地梓醇促血管新生及神经功能重塑作用 [J], 孙立平;周霞;刘炬;张佳乐;王祥煜;郭炳杉;刘伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

α-硫辛酸预处理对人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用张晶晶;邓后亮;季爱民【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2014(000)007【摘要】目的：观察α-硫辛酸（lipoic acid， LA）预处理对缺氧复氧损伤的血管内皮细胞的保护作用，并初步探讨其作用机制。

方法：体外培养人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）。

分为正常对照组、缺氧复氧模型组以及LA预处理组。

倒置相差显微镜观察各组内皮细胞形态；MTT 法检测细胞活力；不同试剂盒分别检测细胞内总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）、一氧化氮（nitric ox-ide， NO）含量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot检测cleaved caspase-3凋亡蛋白表达。

结果：缺氧复氧模型组的细胞存活率、TAOC、SOD活性及NO浓度显著低于正常对照组（P＜0．05），MDA水平、凋亡率及凋亡蛋白水平显著高于正常对照组（P＜0．05）。

LA能剂量依赖性地提高缺氧复氧血管内皮细胞的存活率、TAOC、SOD活性及NO浓度（P＜0．05），降低MDA水平、减少细胞凋亡（P＜0．05）。

结论：LA对血管内皮细胞缺氧复氧损伤具有明显的保护作用，而抗凋亡是其可能的作用机制之一。

%Objective To observe the protective effect of α-lipoic acid (LA) pretreatment on hypoxia/reoxyg-enation injury in vascular endothelial cells and preliminary explore its mechanism. Methods HUVEC were cultured intro and devided into controlgroup,hypoxia/reoxygenation model group and LA group. Cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope,cell viability was detected by MTT,total antioxidant capacity (TAOC),nitric oxide(NO),malondialdehyde (MDA),superoxide dismutase (SOD) activity or level were measured by various commercial kits respectively. Apoptosis of HUVEC in each group were detected by flow cytometry , cleaved caspase-3 level was measured by western blot. Results As compared to control group, the survival rate, TAOC, SOD, NO activity were significantly lower(P<0.05), and MDA level, apoptosis rate and apoptosis protein levels were significantly higher (P < 0.05) in model group. However,LA can increase the survival rate,TAOC, SOD,NO activity (P < 0.05),reduce MDA level and cell apoptosis (P < 0.05)in a dose dependent manner. Conclusion LA pretreatments provide protection against hypoxia/reoxygenation injury in HUVEC. LA exerts protective effects through inhibition of HUVEC apoptosis.【总页数】4页(P1053-1056)【作者】张晶晶;邓后亮;季爱民【作者单位】510282 广州市，南方医科大学珠江医院;510282 广州市，南方医科大学珠江医院;510282 广州市，南方医科大学珠江医院【正文语种】中文【相关文献】1.PEP-1-CAT预处理对H9c2细胞缺氧复氧损伤的保护作用 [J], 魏双;王家宁;唐俊明;黄永章;郭凌郧;张蕾;郑飞;孔霞2.七氟醚预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及相关分子机制的探究[J], 李治秋;赵正兰;李琴芳3.卡托普利晚期预处理对人内皮细胞缺氧复氧损伤保护作用机制的研究 [J], 徐慧;文薏;谭虹4.丹参三七不同配比对缺氧复氧损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用 [J], 曾桂凤;刘建勋;李澎;付绍平;肖红斌;梁鑫淼5.五甲基槲皮素预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的机制研究 [J], 万青;彭易安;刘丹;黄璜;刘季春;何明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

丹红注射液/滴注液保护内皮细胞免受氧化损伤的体外研究 满永* 丁莉* 国汉邦 王蕾 王抒 黎健△ (卫生部北京医院老年医学研究所，北京100730) [摘要] 目的：分析低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）和无血清培养刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)时细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4, NOX4）mRNA水平和细胞凋亡的变化；研究丹红注射液/滴注液保护内皮细胞免受氧化损伤的作用及机制。 方法：以MTT法观察丹红液对HUVECs生长的影响；应用RT-PCR检测NOX4的mRNA水平；用流式细胞仪分析细胞凋亡率；并以DCFH-DA法检测细胞内ROS生成量。 结果：高LDL和无血清培养等刺激HUVECs时，NOX4的mRNA表达上调，细胞内ROS生成增加，细胞凋亡增加。用丹红液预处理HUVECs可以拮抗LDL和无血清培养时的作用，降低NOX4 mRNA水平，抑制细胞内ROS生成和凋亡的发生。 结论：丹红液可以保护内皮细胞免受由LDL和缺血引发的氧化损伤。 [关键词]：人脐静脉内皮细胞 NADPH氧化酶 活性氧 丹红注射液

引言： 业已证明，血液中大量低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）在内皮下的沉积可导致内皮细胞损伤。LDL进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），引起氧化修饰LDL（oxidized low density lipoprotein, oxLDL）的形成，诱导内皮细胞凋亡[1]。在正常生理情况下，由于血液中存在抗氧化酶系统如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx），内皮细胞产生的ROS维持在较低水平，一旦大量LDL进入内皮细胞，则导致高水平ROS的产生和oxLDL的形成，并刺激内皮细胞产生ICAM-1和VCAM-1等粘附因子，造成炎症细胞浸润，加重血管内皮的炎症损伤。Lee[2]等发现无血清培养可增加ROS生成，导致细胞凋亡。这些研究提示ROS在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生过程中起重要作用。因此，探寻具有抗氧化作用的药物用于防治心脑血管病具有重要的临床意义和广阔的应用前景。本实验建立血管内皮细胞损伤模型，研究丹红注射液/滴注液保护内皮细胞的作用，侧重研究丹红液的抗氧化作用。

四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响刘真;魏运湘;于慧卿;马秀娟;王强;李武卫;李永新【摘要】目的观察四妙勇安汤对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧损伤模型的影响.方法实验分为3组,即正常组、模型组、四妙勇安汤组,后2组建立体外细胞缺氧模型,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察四妙勇安汤对缺氧内皮细胞存活率的影响,测定四妙勇安汤对缺氧内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响,并用免疫荧光法检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)生成量的表达.结果四妙勇安汤能显著增加MTT实验中各孔吸光度值,降低LDH漏出量,增加VEGF的生成量.结论四妙勇安汤具有保护缺氧的HUVEC损伤的作用,其作用机制与增加细胞活性、降低缺氧造成的细胞毒性、增加VEGF的表达、促进血管新生的作用有关.【期刊名称】《中国中医药信息杂志》【年(卷),期】2010(017)005【总页数】3页(P31-33)【关键词】四妙勇安汤;缺氧;人脐静脉内皮细胞;血管新生【作者】刘真;魏运湘;于慧卿;马秀娟;王强;李武卫;李永新【作者单位】石家庄市中医院,河北,石家庄,050051;石家庄市中医院,河北,石家庄,050051;石家庄市中医院,河北,石家庄,050051;河北医科大学,河北,石家庄,050017;石家庄市中医院,河北,石家庄,050051;石家庄市中医院,河北,石家庄,050051;石家庄市中医院,河北,石家庄,050051【正文语种】中文【中图分类】R289.11自从Hockel等[1]提出了“治疗性血管生成”的概念后,以促血管生长因子诱导心脑血管组织新生血管形成,已成为治疗性血管新生研究中最为活跃的领域。

组织缺血缺氧后首先受到影响的是内皮细胞,因此,对内皮细胞的研究成为了研究缺血缺氧性疾病的重要手段。

人脐静脉为体外获得内皮细胞的重要来源,故选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验对象。

现代药理研究表明,四妙勇安汤能够扩张血管,疏通及促进血液循环,使未闭塞的动脉及侧枝循环变粗、增多,已经广泛应用于治疗血栓闭塞性脉管炎。

银杏黄酮苷元对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响何艳;付永昕;吴立荣【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2010(35)2【摘要】目的: 体外观察银杏黄酮苷元(GA)对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖作用的影响,初步探讨其对内皮细胞的保护作用.方法: 分别设对照组、空白组和实验组;实验组设GA6.25、12.5、25、50、100、500 mg/L共6个浓度孵育ECV304 48 h,25 mg/L GA与ECV304共同孵育6、12、24及48 h共4个时间点,采用MTT比色法观察GA对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响.结果: 6.25～50 mg/L GA与ECV304共同培养48 h,细胞形态基本正常,细胞增殖率均大于100%,与对照组(未加药)比较差异显著(P<0.05),且各组细胞增殖率随药物浓度增加而增加,P＜0.05;GA 25 mg/L和脐静脉内皮细胞ECV304共培养6～24 h,各组细胞增殖率随作用时间延长而增加,各组间比较差异显著(P<0.05).结论: 银杏黄酮苷元促进人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的作用具有时间和浓度效应,提示GA具有保护血管内皮细胞的作用.【总页数】3页(P127-129)【作者】何艳;付永昕;吴立荣【作者单位】贵阳医学院附院,心内科,贵州,贵阳,550004;重庆市第三人民医院,心内科,重庆,400014;贵阳医学院附院,心内科,贵州,贵阳,550004【正文语种】中文【中图分类】R285.5;R329.412.3【相关文献】1.EDA-A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞 ECV304增殖及细胞周期的影响 [J], 雷科;王伦昌;李龙江;车团结;何祥一2.非白色假丝酵母菌代谢产物对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖的诱导作用[J], 陈斌;车团结;白德成;何祥一3.白假丝酵母菌对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞增殖的诱导作用 [J], 张琳;车团结;史晓艳;何祥一4.银杏黄酮苷元对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞P-选择素、LOX-1表达的影响 [J], 何艳;付永昕;吴立荣;刘兴德;方颖;李屏;李安敏;陈云5.川芎嗪对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响 [J], 徐晓玉;杨丽蓉;陈刚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

[收稿日期]2022-05-29　[修回日期]2023-01-30[基金项目]安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2020A0558);安徽省高校科学研究研究生项目(YJS20210538)[作者简介]张龙飞(1988-),男,硕士研究生,主治医师.[通信作者]高　涌,博士研究生导师,主任医师,教授.E⁃mail:Dr.gaoyong@;陈世远,主任医师,教授.E⁃mail:51293@[文章编号]1000⁃2200(2024)03⁃0281⁃06㊃基础医学㊃过表达vWF 对人脐静脉内皮细胞生物学影响的实验研究张龙飞,陈世远,冯奔驰,刘德朗,张秀杨,高　涌(蚌埠医科大学第一附属医院血管外科,安徽蚌埠233004)[摘要]目的:探讨过表达血管性血友病因子(vWF)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖㊁迁移㊁侵袭㊁凋亡及成管能力的影响㊂方法:设计构建5种过表达vWF 的质粒CRISPRa 载体,将HUVECs 分为实验组(5组)与对照组㊂将5种质粒分别转染实验组细胞,Western blotting 检测各组细胞vWF 的表达效果,选取优势组㊂通过细胞增殖实验㊁细胞划痕实验㊁细胞侵袭实验㊁细胞凋亡实验㊁细胞成管实验等,观察过表达vWF 对HUVECs 增殖㊁迁移㊁侵袭㊁凋亡及成管能力的影响㊂Western blotting 检测5个常见通路蛋白因子在2组细胞中的表达,探测可能相关的机制㊂结果:成功转染后各组HUVECs 的vWF 蛋白表达水平均明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P <0.05)㊂其中vWF⁃OE4组过表达量最高,故选取该引物序列进行后续实验㊂与对照组相比,vWF⁃OE 组细胞增殖减慢,细胞划痕48h 迁移率降低㊁Transwell 细胞侵袭率降低(P <0.05),细胞凋亡率㊁血管形成能力㊁HUVECs 生成小管的长度均增高(P <0.05),JUN㊁P53蛋白含量均增高(P <0.05)㊂结论:过表达vWF 对HUVECs 增殖㊁迁移㊁侵袭行为具有显著抑制作用,促进凋亡,成管能力增强㊂[关键词]布加综合征;血管血友病因子;人脐静脉内皮细胞[中图法分类号]R 363.2 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2024.03.001Biological effects of overexpression of vWF on human umbilical vein endothelial cellsZHANG Longfei,CHEN Shiyuan,FENG Benchi,LIU Delang,ZHANG Xiuyang,GAO Yong(Department of Vascular Surgery ,The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University ,Bengbu Anhui 233004,China )[Abstract ]Objective :To investigate the effects of overexpression of von Willebrand factor (vWF)on the proliferation,migration,invasion,apoptosis,and tube formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods :Five vWF⁃overexpressing plasmid CRISPRa vectors were designed and constructed,and HUVECs were divided into the experimental group (5groups)and control group.Five plasmids were transfected into the experimental group,and the expression effect of vWF in each group was detected by Western blotting,and the dominant group was selected.The effects of vWF overexpression on the proliferation,migration,invasion,apoptosis and tube formation of HUVECs were observed by cell proliferation assay,scratch assay,cell invasion assay,apoptosis assay,and cell tube formation assay.Western blotting was used to detect the expression of 5common pathway protein factors in the two groups of cells and explore the possible related mechanisms.Results :Western blotting showed that the expression level of vWF in HUVECs after successful transfection was significantly higher than that in the control group (P <0.05).Among them,the overexpression of vWF in the vWF⁃OE4group was significantly higher than that of other groups,so the primer sequence was selected for subsequent pared with the control group,the cell proliferation in vWF⁃OE group was slowed down,the cell scratch 48h mobilitywas decreased,the Transwell cell invasion rate was decreased (P <0.05);the apoptosis rate,angiogenesis ability and the length of HUVECs producing tubules were increased (P <0.05);the protein contents of JUN and P53were increased (P <0.05).Conclusions :Overexpression of vWF can significantly inhibit the proliferation,migration and invasion of HUVECs,promote apoptosisand enhance the ability of tube formation.[Key words ]Budd Chiari syndrome;von Willebrand factor;human umbilical vein endothelial cells 布加综合征(BCS)在我国主要以下腔静脉与肝静脉阻塞狭窄为主,且以隔膜型阻塞多见,在亚洲发病为2.40/百万至33.10/百万[1]㊂BCS 病人下腔静脉增生隔膜主要含有增生的血管内皮细胞和血栓等,但关于静脉腔内隔膜形成的机制及引起内皮细胞增殖和凋亡的分子机制目前尚未完全阐明㊂血管性血友病因子(vWF)主要由血管内皮细胞和巨噬细胞分泌,参与凝血机制以及静脉血栓的形成㊂研究[2]发现,vWF缺陷小鼠不会因下腔静脉的完全或部分阻塞而出现血流限制所导致的下腔静脉栓塞, 50%正常水平的vWF同样对下腔静脉血流限制小鼠有引起栓塞的作用㊂还有研究[3]通过小分子干扰RNA(siRNA)干扰脐静脉内皮细胞vWF的表达,发现细胞增殖增强,可促进血管生成㊂本课题组前期利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对皖北地区BCS病人与下肢静脉曲张病人血清蛋白进行鉴定与生信分析发现,vWF为其中一种差异明显的蛋白因子[4]㊂本研究通过构建过表达vWF质粒转染人脐静脉内皮细胞,检测过表达vWF对人脐静脉内皮细胞生物学影响,探讨其可能的机制,以期为解释BCS的发病机制提供新方向㊂1　材料与方法1.1　主要试剂材料　人脐静脉内皮细胞(HUVECs)由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供;vWF 过表达质粒载体由美国Invitrogen公司提供;内皮细胞专用培养基(ECM)购于美国Gibco公司;细胞毒性检测试剂盒(CCK⁃8)购于美国Biolite公司; Transwell试剂盒㊁侵袭试剂盒㊁Matrigel购自Corning 公司;凋亡试剂盒购自AAT公司;内皮细胞生长因子(ECGS)购于ScienCell公司;Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司;ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo公司;RT逆转录试剂盒购自MBI公司;高纯度质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;GAPDH抗体㊁vWF抗体㊁JUN抗体㊁Fas抗体㊁P53抗体购于Abcam公司(杭州);JNK1抗体㊁ERK 抗体购于CST公司(美国);山羊抗兔抗体(二抗)购自Thermo Fisher公司(美国);SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司㊂IX71荧光显微镜购自日本奥林巴斯株式会社;M2009PR酶标仪购自Tecan infinite公司;Guava easyCyte HT流式细胞仪购自Millipore公司;ChemiDoc XRS化学发光成像系统㊁icycler荧光定量PCR仪购自美国BiO⁃RAD公司㊂1.2　实验方法　1.2.1　细胞培养　HUVECs细胞培养基配制: DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%青链抗生素㊂细胞在37℃㊁5%CO2㊁湿润的细胞培养箱培养㊂当细胞增殖铺满90%时,0.25%胰酶消化分散,并传代㊂1.2.2　分组与处理　将HUVECs分6组,将5组过表达vWF质粒载体转染5组HUVECs(过表达vWF 质粒+HUVEC),1组为对照组㊂通过Westernblotting试验检测各组过表达vWF情况,选取优势组进行后续实验,并设立质粒空载体为阴性对照组㊂1.2.3　质粒载体构建　通过斯坦福大学的sgRNA 设计网站,在人源vWF基因的转录起始位点(TSS)上游50~400bp区域内分别设计5条sgRNA序列,并构建5组质粒CRISPRa载体(见表1)㊂表1　sgRNA序列与位置sgRNA名称sgRNA序列与TSS位点距离vWF⁃sgRNA1GGA AGA CCA GGG ATC AAG TGT GG175bp vWF⁃sgRNA2GGA TCA AGT GTG GGG GTG TAG GG165bp vWF⁃sgRNA3GAC CGG ATC CTT CAT ACC TGG GG405bp vWF⁃sgRNA4GAG GGC AAG GCA GTT AAT TAA GG126bp vWF⁃sgRNA5GTG TGG GGG TGT AGG GAT AGG GG158bp1.2.4　vWF sgRNA转染HUVEC细胞和Western blotting实验检测vWF蛋白表达　将HUVECs培养到对数生长期时,细胞计数为4×105cells/well,接种到6孔板内,并分组为ctrl组㊁vWF⁃OE1组㊁vWF⁃OE2组㊁vWF⁃OE3组㊁vWF⁃OE4组㊁vWF⁃OE5组㊂用无抗生素培养基培养24h,分别用以上构建的5种质粒转染细胞,孵育24h㊂收集细胞,RIPA强细胞裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,BCA试剂测定浓度㊂电泳转致PVDF膜上,封闭液室温封闭1h,转入抗vWF抗体(1∶500稀释)与抗GADPH抗体(1∶1000稀释)的封闭液中,4℃㊁24h后同山羊抗兔二抗(1∶5000稀释)共同孵育(室温)1.5h,并与化学发光底物结合5min㊂GADPH作内参, ChemiDoc XRS化学发光成像系统查看结果,与内参的灰度比值为目的蛋白的相对表达量㊂选取质粒过表达优势组行后续实验㊂1.2.5　细胞增殖实验　采用CCK⁃8试验检测细胞增殖能力㊂选取处于对数生长期的vWF⁃OE组与对照组细胞胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,接种于96孔板(细胞密度为2000cells/well, 100μL/well),每组3个复孔,放入37℃细胞培养箱进行培养㊂分别于0㊁24㊁48㊁72㊁96h取出,每孔加入10μL CCK⁃8溶液,再放入细胞培养箱中培养2h后根据试剂盒说明书,用酶标仪检测记录450nm处吸光度(OD450)值㊂1.2.6　细胞划痕实验　通过细胞划痕试验观察细胞迁移能力㊂将vWF⁃OE组与对照组细胞接种于12孔板中(细胞密度为2×105cells/well),每组3个复孔㊂次日细胞汇合度>90%,用10μL无菌移液枪头对直均匀划过细胞,PBS漂洗3遍,去除漂浮细胞,加入培养基并拍照(0h),置入37℃㊁5%CO2培养箱培养㊂选择24㊁48h取出拍照,测量24㊁48h细胞划痕域宽度,与0h比较,计数算出迁移率㊂1.2.7　细胞侵袭实验　选取vWF⁃OE组与对照组处于对数期的细胞,胰酶消化,制备无血清细胞悬浮液,并计数㊂无血清培养基加入上下小室,Matrigel 基质层水化后去除血清㊂上室加入100μL细胞悬液(6×104cells/well),下室内加入600μL含10% FBS培养基,37℃培养箱培养24h㊂倒扣小室于吸水纸以去除培养基,用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞,用PBS洗小室3遍,4%多聚甲醛固定30min㊂用0.1%结晶紫染色30min,PBS清洗后置入新24孔板,倒置显微镜拍照和细胞计数分析㊂1.2.8　细胞凋亡实验　采用Annexin V⁃APC单染色法检测vWF⁃OE组与对照组细胞凋亡情况㊂将2组细胞接种于6孔板,细胞融合度达约85%时,胰酶消化细胞,完全培养基重悬成细胞悬液,与上清细胞收集于同5mL离心管㊂1300r/min离心5min,弃上清,4℃预冷的D⁃Hanks(pH=7.2~7.4)洗涤细胞沉淀㊂1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次, 1300r/min离心3min,收集细胞㊂200μL1×binding buffer重悬细胞沉淀,加10μL Annexin V⁃APC染色,室温避光10~15min㊂根据细胞量,补加400~800μL1×binding buffer,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率㊂1.2.9　细胞成管实验　取2组细胞铺于6孔板(约2×105cells/well),待贴壁D⁃Hanks洗涤2遍,换无血清培养基培养24h,收集上清㊂将96孔板孔板及枪头-20℃预冷㊂取Matrigel胶4℃环境充分融化,铺于预冷的96孔板,每孔70μL,37℃凝固30min备用㊂胰酶消化细胞,用无血清培养基洗细胞2~3次,去除血清㊂用预先收集的目的细胞培养上清重悬为3×104cells/100μL,铺96孔板㊂37℃培养预设时间(2~4h)后,弃去旧液,每孔加入50μL Calcein⁃AM浓度为0.2μmol/L的培养基37℃孵育5~10min㊂倒置显微镜下随机选取3个视野观察管状结构形成情况,并测量细胞生成小管的面积和长度㊂1.2.10　Western blotting实验检测通路蛋白表达　收集生长状态良好的vWF⁃OE组和对照组细胞, RIPA强细胞裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,BCA试剂测定浓度,电泳转致PVDF膜上,室温封闭1h,转入对应一抗(1∶1000稀释)的封闭液中, 4℃㊁24h后与山羊抗兔二抗(1∶5000)共同孵育(室温)1.5h,并与化学发光底物结合5min㊂GADPH作内参,ChemiDoc XRS化学发光成像系统查看结果,与GADPH的灰度比值为目的蛋白的相对表达量㊂1.3　统计学方法　采用t检验㊁方差分析和q检验㊂2　结果2.1　各组HUVECs vWF蛋白表达量比较　通过Western blotting实验检测各组细胞vWF 表达,分析各组条带灰度比值提示vWF⁃OE4组细胞vWF表达量高于其他组,差异有统计学意义(P< 0.05~P<0.01)(见表2)㊂表2　各组细胞vWF灰度比值表(x±s)分组n vWF灰度比值(系数为10×)对照组3 1.45±0.32vWF⁃OE1组3 3.37±0.64*vWF⁃OE2组3 4.64±0.59*#vWF⁃OE3组3 6.06±0.52*#▲vWF⁃OE4组37.25±0.51*#▲vWF⁃OE5组3 3.83±0.57*■●F 44.11P <0.01MS组内 0.732 q检验:与Ctrl组比较*P<0.05;与vWF⁃OE1组比较#P< 0.05;与vWF⁃OE2组比较▲P<0.05;与vWF⁃OE3组比较■P< 0.05;与vWF⁃OE4组比较●P<0.052.2　vWF⁃OE组和对照组细胞CCK⁃8增殖实验结果比较　CCK8检测显示,vWF⁃OE组细胞在24~96h 的比较OD450值低于对照组(P<0.05)(见表3)㊂2.3　vWF⁃OE组和对照组细胞划痕实验迁移率比较　划痕实验结果显示,24h时,2组细胞迁移率差异无统计学意义(P>0.05)㊂48h时,vWF⁃OE组细胞迁移率明显低于对照组(P<0.01)(见表4)㊂2.4　vWF⁃OE组和对照组细胞侵袭实验结果比较 细胞侵袭实验显示,vWF⁃OE组在Transwell小室内孵育24h后侵袭的细胞数明显低于对照组(P<0.01)(见表5)㊂表3　vWF⁃OE组和对照组细胞CCK⁃8增殖实验结果比较(x±s)分组nOD450值 0h 24h 48h 72h 96h F P MS组内vWF⁃OE组30.277±0.0040.309±0.009　0.400±0.008*#　0.602±0.022*#▲0.967±0.052*#▲■357.91<0.010.001对照组30.268±0.0190.436±0.013*0.649±0.021*# 1.193±0.011*#▲1.891±0.022*#▲■4229.89<0.010.000 t 0.8214.0519.4341.4128.16 P >0.05<0.01<0.01<0.01<0.01 q检验:与0h比较*P<0.05;与24h比较#P<0.05;与48h比较▲P<0.05;与72h比较■P<0.05表4　vWF⁃OE组和对照组细胞划痕实验迁移率比较(x±s)分组n24h48h t PvWF⁃OE组30.43±0.070.60±0.11 1.62>0.05对照组30.56±0.08 1.00±0.0918.07<0.01t 2.05 4.87P >0.05<0.01表5　vWF⁃OE组和对照组细胞侵袭实验结果比较(x±s)分组n侵袭细胞数侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数vWF⁃OE组394.00±14.500.39±0.06对照组3245.00±24.79 1.01±0.12t 9.077.88P <0.01<0.01 2.5　vWF⁃OE组和对照组细胞凋亡率比较　2组细胞进行凋亡实验检测得出,vWF⁃OE组细胞的凋亡率(10.27±0.73)%,明显高于对照组(5.24±0.18)%(t=11.57,P<0.01)㊂2.6　vWF⁃OE组和对照组细胞成管实验结果比较 结果提示,vWF⁃OE组细胞生成小管的长度(94104±9017)μm均高于对照组(63904±7236)μm(t=4.52,P<0.05)㊂2.7　vWF⁃OE组和对照组细胞通路因子蛋白表达量比较　采用Western blotting实验检测2组细胞JUN㊁p53㊁ERK㊁JNK1㊁Fas5个通路蛋白表达量㊂结果显示,vWF⁃OE组JUN㊁p53蛋白表达量高于对照组(P<0.05),而2组Fas㊁ERK㊁JNK1细胞表达量差异无统计学意义(P>0.05)(见表6)㊂3　讨论 BCS是肝静脉或下腔静脉阻塞继而引起的一种以淤血性门静脉或下腔静脉高压为主要临床表现的疾病,其发病机制目前仍未有完全清楚的阐述,但已知受多种致病因素的影响㊂全球BCS的发病率约为1/10万;在我国BCS病人主要分布在黄河中下游以及皖北[5]㊁苏北地区的淮河流域,具有显著地域特征㊂我国和西方国家BCS病人的病因和临床特征存在很大差异,国外BCS病人主要是血栓形成有关的疾病,而我国BCS病人主要表现为肝静脉㊁下腔静脉膜型混合型阻塞,还有相当一部分病人表现为血管节段性下腔静脉狭窄,均可合并血栓形成㊂有学者[6]推测,BCS一部分可能因反复呼吸运动可导致下腔静脉膈部静脉内皮细胞活化和损伤,而受损的内皮细胞会分泌大量的vWF,使血浆的vWF水平大幅增高,因此vWF也可以作为血管损伤的诊断指标㊂本课题组前期研究发现皖北地区BCS病人血清中vWF为差异蛋白,且通过蛋白互作分析为有意义因子[4]㊂　表6　vWF⁃OE组和对照组细胞通路因子蛋白表达量比较(x±s)分组n目的条带灰度值和内参条带灰度值比值(系数为10×) p53 JUN Fas ERK JNK1 对照组3 6.04±1.98　11.26±2.29　8.74±2.2015.98±1.9220.15±5.21 vWF⁃OE组39.97±2.1318.14±3.269.95±3.2716.57±1.4822.91±6.07 t 2.34 2.990.530.420.60P <0.05<0.05>0.05>0.05>0.05 vWF又称因子Ⅷ相关抗原,是由内皮细胞及巨噬细胞分泌的一种大分子量糖蛋白,具有较强的黏附功能,是血浆的重要成分[7]㊂作为一种多结构域㊁多功能的蛋白质,vWF的功能和其蛋白质结构域密切相关,在人体中发挥着重要作用:vWF主要血小板膜糖蛋白Ⅰb(GPⅠb)⁃Ⅸ复合物及内皮下胶原结合,介导血小板在血管损伤部位的黏附起到修复损伤血管以起到止血作用;除此以外,vWF可介导血小板在损伤内皮细胞暴露的胶原表面黏附,协助血小板血栓形成;vWF与FⅧ结合形成复合物,使后者的半衰期延长,活性也更稳定[8-9]㊂另外,vWF 的合成㊁分泌和功能还受到体内肝素㊁硫苷脂类物质的影响,其还能与蛇毒蛋白结合调控vWF和膜受体蛋白之间的相互作用[10]㊂ISHIHARA等[11]实验发现,缺乏vWF的小鼠,血管生成生长因子减少,血管生成减少致局部伤口延迟愈合㊂有研究[2]通过siRNA干扰内皮细胞下调vWF基因表达发现细胞增殖能力和迁移能力表现都明显增强,而且内皮细胞外的vWF对内皮细胞同样有生理作用㊂血液中外源的vWF对血管内皮细胞仍有生物学影响[12]㊂本研究采用质粒转染技术上调HUVECs vWF 的表达,Western blotting结果显示各组vWF相比对照组的vWF蛋白表达水平明显上调,说明该质粒有效㊂之后通过细胞增殖实验㊁细胞划痕实验㊁细胞侵袭试实验㊁细胞凋亡实验㊁细胞成管实验等,观察过表达vWF对HUVEC增殖㊁迁移㊁侵袭㊁迁徙成管能力的影响,结果显示vWF表达上调后明显抑制了HUVEC细胞的增殖能力㊁迁移能力和转移能力㊂血管内皮细胞迁移是新生血管形成的基础和关键[13],而本研究也提示vWF表达对HUVEC细胞的增殖㊁迁移和转移能力有调控作用㊂细胞凋亡实验结果显示,vWF⁃OE组细胞凋亡率明显高于对照组,提示vWF表达上调能诱导HUVEC细胞凋亡㊂作为一种代谢活跃的细胞,血管内皮细胞可在体内外多种刺激因素的影响下发生凋亡㊂在新血管生成㊁分化连通和退化过程中都可见内皮细胞凋亡,新生血管内皮细胞凋亡被认为与血管退化有关,此外其还被认为在局部新生血管的发育和血管连通中发挥着至关重要的作用[14]㊂细胞成管实验结果显示,vWF表达上调后显著增强了HUVEC细胞管状结构形成能力,管状结构的数量明显增多,单视野平均管状结构的面积和长度都明显增加,这说明内皮细胞过表达vWF后会明显促进内皮细胞的血管新生㊂血管新生和血栓形成是极为复杂的过程,其主要可分为3个阶段,分别为血流阻断和缺氧㊁血管内皮细胞活化㊁炎症细胞募集㊂目前研究更多关注在机体慢性炎症过程以及其中炎症信号传导的作用[15-16]㊂vWF过表达通过何种机制影响血管内皮细胞的增殖㊁运动㊁凋亡和血管生成目前未有相关报道㊂本课题组进一步对转染质粒后的vWF⁃OE组和对照组细胞表达可能的相关通路因子蛋白进行检测,观察到vWF过表达可上调丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中p53㊁c⁃JUN蛋白的表达㊂MAPK信号通路是目前研究最多且最为广泛的一种对细胞周期运行和基因表达有重要调控作用的信号转导途径,控制着细胞的生长㊁增殖㊁存活㊁分化和死亡等过程,同时也参与血管新生和血栓形成[17]㊂目前研究发现3条并行的MPAKs信号通路,分别是ERK/c⁃JUN/p53信号通路㊁p38MAPK通路和JNK/ SAPKt通路,这三条通路均产生于胞质,被激活后进入细胞核而发挥作用㊂ERK//c⁃JUN/p53通路可使上皮细胞生长和增殖明显加快,从而可引起上皮细胞增生过度;其可调节血小板中线粒体通透性转换孔开放,使血小板活化和聚集;其还会促进组织因子释放,激活凝血级联瀑布反应,引发凝血酶的释放和活化,促进血栓形成和稳定[18-20]㊂综上所述,过表达vWF对静脉内皮细胞增殖㊁迁移㊁侵袭行为具有显著抑制作用,成管能力增强,证实了vWF对血管内皮细胞的生物学作用,vWF可能成为血管内皮损伤修复的新的诊断治疗指标,也为解释BCS中发病机制中内皮细胞的功能异常提供新的方向㊂但是,血管新生和血栓形成的过程是极其复杂的,其中涉及了大量的信号通路和调节因子,要完全阐明vWF高表达在其中的具体作用和机制还需要后续实验研究来证实㊂[参考文献][1]　YINGYING L,VALERIO DS,HONGYU L,et al.Epidemiology ofBudd⁃Chiari syndrome:a systematic review and meta⁃analysis[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2019,43(4):468. 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