大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

长 。培 养 第 ７天细 胞 Ｃ ３ Ｄ ４和 Ｃ １３均呈 阳性 ， 光共 聚焦 显 微 镜 观 察 显 示 Ｅ Ｃ可 以 同 时 吞 噬 ａ —Ｌ Ｌ并 结 合 Ｕ Ａ一１ Ｄ３ 激 Ｐ ｃ Ｄ Ｅ 。 论 糖 尿 病 大 鼠 骨髓 可 以分 离 培 养 出 内皮 祖 细 胞 ， 能 体 外 扩 增 ， 糖 尿 病 内皮 祖 细 胞 的 移植 研 究 奠 定 了基 础 。 并 为
关键词 糖尿病 骨髓 内皮 祖 细 胞
Ｃ ｌ ｒ ａ ｄＩｅ ｔ ｃｔ ｎｏ ｎ ｏ ｅａ Ｐ ｏｅ ｉ ｒ ｅｓ ｒｍ Ｂ ｎ ｒｏ ｆ ｉ ｅ ｃ ａ Ｈ ａ ｇ Ｑ ｒｎ ，Ｙ ｈＸ ｎ ｊｎ Ｌｕ ｙ 昭 ， ｕ ｕｅ ｎ ｎ ｆ ａ ｏ ｆ ｄ ｔ ｌ ｌ ｒ ｇｎ ｏ ｌ ｏ ｏ ｅ ｔ ｄ ｉ ｉ ｉ Ｅ ｈ ｉ ｔ Ｃ ｌｆ Ｍａ ｒｗ ｏ ａ ｔ ｔ Ｄ ｂ ｉＲ ． ｕ ｎ ｉ ｇ ａ ｉ ｕ ， ｉ ０ ｏ ｇ
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生和发展都是以内皮细胞受损为基础，肺微血管内皮细胞在病理条件下，不仅是炎症反应的主要靶细胞，更是活跃的炎症细胞和效应细胞。

其功能和结构的完整性对于维持正常肺功能至关重要，这种特殊的细胞类型是研究肺功能不全及许多肺部疾病发生机制的理想细胞模型来源[4]。

近年，从生物化学、细胞生物学及分子生物学等方面探究内皮细胞生理功能的研究课题日益增多，有助于更全面认识PMVECs并了解其相关机制，进而可对相关疾病进行预防和治疗[5]。

近20年，国内外对PMVECs的研究取得众多成果，但其养困难、成本高、重复性差、易污染等问题，降低了培养成功率，因此建立完整高效的PMVECs培养方法意义重大。

本文总结了PMVECs培养的一般方法，具体流程，见图1。

图1 皮细胞培养一般流程1 肺微血管内皮细胞培养法1.1 原代培养肺微血管内皮细胞原代培养是指从活体生物中将肺组织取下进行培养，在完成首次传代培养之前的细胞都称为原代培养[6]。

国内外研究报道的肺微血管内皮细胞的方法主要有2种，一是组织块贴壁法[7-10]，二是酶消化法[11]。

2种方法各有利弊，组织块法操作简单、细胞成活率高、成本低、可减少因酶消化造成的细胞损伤，但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻底会造成其他杂细胞污染等。

酶消化法培养周期快、细胞生长速率快，但是消化时间和酶浓度不好控制，细胞成活率可能会因为消化时间过长受到影响。

1.1.1 组织块贴壁法组织块贴壁法是指将取自活体生物的组织，在无菌条件下剪成1×1×1 mm3小块，平铺在培养器皿中，加入含胎牛血清的培养基在37 ℃5%CO2条件下培养的方法。

组织块贴壁法的一般操作步骤：先去除组织胸膜，将去除胸膜的肺组织剪下1～3 mm左右的肺组织边缘，切成1×1×1 cm3组织块，用基础培养基DMEM清洗多次，至少3次，均匀地贴在25 cm2的培养瓶中，放入5% CO2 37 ℃的培养箱中培养1 h，等组织块贴壁后，加入完全培养基DMEM（20%FBS、ECGS、肝素钠、双抗等），放入培养箱中16 h以上，去除未贴壁的组织块，加入新的培养基，以后每2～3 d更换1次培养基。

１ ． ２ 动 物 和试 剂 选用 ６ ～８周 龄 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ 雄 性大 鼠（ 约６ ０ ～１ ０ ０ ｇ ）
（ 上 海斯 莱 克 实 验 动 物 中 心 ） 。ＤＭＥ Ｍ 高 糖 培 养 基
（ Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ ， 美 国） ； 鼠尾 胶 （ 自制 ） ； 胰 蛋 白酶 （ １： ２ ５ ０ ，Ａｍｅ ｒ ｅ ｓ ｃ ｏ ， 美 国） ； 胎 牛 血清 （ Ｆ Ｂ Ｓ ， Ｇｉ ｂ ｃ ｏ ， 美 国） ； 兔抗 鼠 Ｃ Ｄ３ ４单 克 隆抗 体 、 兔抗 鼠 Ｃ Ｄ３ １单 克 隆抗 体 （ Ａｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ Ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｔ ｉ ｃ ａ Ｉ ｎ ｃ ， 美 国） ； 兔 抗 人
比例 ： Ｃ Ｄ３ ４ 、 Ｃ Ｄ ３ １为 １： ５ ０ ０ ， ＶＩ Ｉ Ｉ因子为 １： ２ ０ ０ 。
本文 ２ Ｏ １ ２ —１ ２ 一Ｏ ８收 到 ， ２ ０ １ ３ －０ １ —１ ６修 回 ， ２ Ｏ １ ３ 一Ｏ １ —１ ８接 受
矗曩厦学 杂 志
２ ０ １ ３ 年第 ２ ３ 卷第１ 期
圜 篓 一
篓
ＶＩ Ｉ Ｉ因子 相 关 抗 原 多 克 隆 抗 体 （ ＤＡＫＯ， 丹麦） ； 抗
兔及 抗 鼠 ＡＢ Ｃ试 剂 盒 、 Ｄ ＡＢ显 色 试 剂 盒 、 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ标 记羊 抗兔 Ｉ ｇ Ｇ（ Ｂ ｅ ｙ ｏ ｔ ｉ ｍｅ ， 中 国） ； 其 余化 学试 剂 为 国 产分 析纯 商 品 。 １ ． ３ 实验 用 肝素 的配 制
ｍ饵讲学 杂 志， ２ ０ １ ３ 。 ２ ３ （ １ ） ： ３ ９ － － － ４ ０
⑥ ２ ０ １ ３ Ｃ ＨＩ Ｎ Ｅ Ｓ Ｅ Ｊ Ｏ Ｕ Ｒ Ｎ Ａ Ｌ Ｏ Ｆ ＭＩ Ｃ Ｒ Ｏ Ｃ Ｉ Ｒ Ｃ Ｕ Ｌ Ａ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ

大鼠内皮祖细胞的分离培养与鉴定赵洪雯;余荣杰;李敛;刘宏;干磊;吴雄飞;曾玲【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2007(036)018【摘要】目的研究大鼠骨髓来源的内皮祖细胞的分离培养和鉴定方法.方法纤维连接蛋白提前包被培养瓶和培养板中的盖玻片.密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,EGM-2完全培养基,贴壁法,37℃, 5%CO2,饱和湿度的恒温培养箱中原代培养.部分培养瓶细胞消化后计数.其余培养瓶和培养板中盖玻片细胞继续培养,细胞近融合时传代,分别在第6、9、12和24天进行细胞鉴定.内皮祖细胞鉴定:免疫细胞化学的vWF和VEGFR-2染色;内吞DiI标记的乙酰低密度脂蛋白(DiI-AcLDL)和结合FITC标记的荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的激光共聚焦显微镜观察.结果培养细胞的形态学改变:骨髓单个核细胞种植24h后部分细胞开始贴壁、变大,倒置显微镜下贴壁细胞透亮度增强,并逐渐伸出伪足样突起,呈小杆状或梭形.培养第3天贴壁细胞开始增殖,呈"集落"样生长,外周梭形细胞较多.第6天梭形细胞显著增多,培养至第12天左右,梭形细胞首尾相连,呈"毛细血管"样排列.培养第6天的细胞数量级为106～107/瓶.内皮祖细胞的鉴定:激光共聚焦显微镜观察显示细胞DiI-acLDL和FITC-UEA呈红绿免疫双荧光阳性.培养第6天细胞VEGFR-2和vWF免疫细胞化学染色呈阳性.结论大鼠的骨髓单个核细胞可以培养为内皮祖细胞,且数量级达到106～107,可以满足动物实验研究的需要.【总页数】5页(P1836-1839,封2)【作者】赵洪雯;余荣杰;李敛;刘宏;干磊;吴雄飞;曾玲【作者单位】第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,肾科,重庆,400038;第三军医大学西南医院,骨科,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】R365;Q25【相关文献】1.大鼠外周血内皮祖细胞分离培养与鉴定 [J], 杜公文;高维陆;张辉;尹宗生2.大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及鉴定 [J], 戴小珍;王兰;潘克俭;何浪;李红;姜鹤群3.大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定 [J], 王红娟;王娟;李楠;高航;刘亢丁;4.大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定*☆ [J], 卫肖艳;张莉;林明;陈欢;彭博;彭园园;李富运;洪培馨;范伊凡5.大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定 [J], 卫肖艳;张莉;林明;陈欢;彭博;彭园园;李富运;洪培馨;范伊凡;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【摘要】目的本文建立一种简便、高效的成年大鼠心肌微血管内皮细胞分离及培养的方法.方法选取7~8周龄Wistar大鼠,麻醉后开胸取出心脏,采用离体心脏灌流和酶消化法进行心肌微血管内皮细胞的分离;取第3代细胞观察其增殖特征并绘制增殖曲线;用免疫细胞化学和免疫荧光对细胞的第Ⅷ因子相关抗原和CD31进行鉴定,利用基质胶检验其血管形成能力.结果体外培养心肌微血管内皮细胞呈多边形或梭形,具有典型的铺路石样生长特点;同时,第Ⅷ因子相关抗原和CD31呈阳性;具备血管形成能力.结论本方法培养的成年大鼠心肌微血管内皮细胞具有较高的纯度,方法简便易行,可用于心血管疾病基础及临床研究.%Objective To establish a simple and efficient method for isolation and culture of adult rat cardiac micro-vascular endothelial cells. Methods Wistar rats were anesthetized and thoracotomy was performed. Cardiac micro-vascular endothelial cells were isolated by heart perfusion and enzyme digestion. The morphology and growth curve of the third generation cells were examined by inverted microsc opy. Its molecular markers factor Ⅷ-related antigen and CD31 were detected by immunocytochemistry and immunofluoresence. The angiogenic ability was examined by matrigel. Results The primary cultured cardiac microvascular endothelial cells in vitro were polygonal or fusiform with typical paving stone-like growth characteristics. At the same time,the cells were positive stained by factorⅧ-related antigen and CD31 and showed angiogenic ability. Conclusions Cardiac microvascular endothelial cells cul-tured by this method possess high purity. The method is easy tooperate and can be used for laboratory and clinical research of cardiovascular diseases.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2018(038)004【总页数】5页(P530-534)【关键词】细胞培养;内皮细胞;成年大鼠;心肌微血管【作者】陈小燕;樊梦雅;李慧;蒋易楠;靖静;张海龙【作者单位】河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;郑州大学基础医学院,河南郑州450001;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004;河南大学医学院抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室河南省抗体药物国际联合实验室细胞与分子免疫重点实验室,河南开封475004【正文语种】中文【中图分类】R331心肌微血管是深入心脏内的终末细小分支，在心脏内分布广泛，结构上与其他血管不同，由单层内皮细胞和细胞外基质组成；微血管内皮细胞在表型与功能上均表现出不同于大血管内皮细胞的异质性，且其性质与功能在不同组织器官之间也具有显著差异[1]。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No .30370561);河北省自然科学基金资助项目(No .C2004000639)作者单位:075029　河北张家口,河北北方学院病理生理教研室第一作者简介:陈瑞华(1966-),男,汉族,张家口人,副教授。

主要从事危重病的病理生理学研究。

△通信作者:ncylxf@s ohu .com文章编号:100728568(2007)0120016204・实验研究・大鼠肺微血管内皮细胞的培养陈瑞华,赵自刚,牛春雨△,张　静,张玉平【摘要】　目的　建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞(P MVEC )的培养方法。

方法　从实验动物、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改进,应用W istar 雄性大鼠的肺组织,进行P MVEC 的原代培养并传代培养;通过倒置显微镜、扫描、透射电镜观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定。

结果　体外培养的大鼠P MVEC 呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,获得的血管内皮细胞纯度较高,抗Ⅷ因子阳性反应,成功建立了P MVEC 的原代培养方法。

结论　改进的植块培养法简便、可靠,获得的P MVEC 纯度高,生长状态良好,保持了内皮细胞的结构和功能,可用于其功能特性的进一步研究。

【关键词】　肺微血管;内皮细胞;细胞培养中图分类号:Q25 文献标识码:BCulture of Pul m onary M i crova scul ar Endotheli a l Cells i n Ra ts CHEN R u i 2hua,ZHAO Z i 2gang,N I U Chun 2yu,ZHAN J ing,ZHAN G Yu 2ping .D epa rt m en t ofPa thophysiololgy,Hebei N orth U n iversity,Z hang jiakou 075029,China【Abstract 】　O bjecti ve T o devel op a si m p le and rep r oductable method for the is olati on and p ri m aryculture of pul m onary m icr ovascular endothelial cells (P MVECs )of rats .M ethods The tissue bl ock pasted culture method was i m p r oved in experi m ent ani m al,culture -mediu m,tissue bl ock method,fetal bovine ser 2u m (F BS )and s p reading slide method .Rats P MVECs were p ri m ary cultured with lung tissue bl ock pasted methods using lung tissue of male W istar rats,and the cell mor phol ogy was observed using inverted m icr oscope and electr on m icr oscope,and identified using i m munohist oche m ical methods .Results The cultured P MVECs of rats in vitr o showed fusif or m shape or polygon,and the monolayer cultures dis p layed a typ ical cobblest one or pavingst one mor phol ogy and were inhibited when contacted each other,the P MVECs exp ressed fact or Ⅷass o 2ciated antigen.And the p ri m ary culture of P MVEC was established successfully .Conclusi on The pure pul 2monaryMVECs of rats can be attained rap idly and easily by the described method .The method is si m p le,eco 2nom ic and reliable,availability of these cells will facilitate further functi onal character studies .【Key words 】　Pul m onary m icr ovessel;Endothelial cell;Cell cultivati on 微血管内皮细胞衬附于血管内壁,定位于进行血液-组织交换的微血管,它不仅是构成血管组织间屏障的重要成分,而且在调节机体内环境的稳定、维持正常生理和免疫功能,以及介导疾病的发生、发展和转归等方面都发挥主要的作用。

Ｔｈｅ ＣＭ ＥＣｓ ｗｅ ｒ ｅ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｄ ｂ ｙ ｔ ｈｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏｄ ｏｆ ｐｌ ａ ｎｔ ｉ ｎｇ ｍｙ ｏ ｃ ａ ｒ ｄ ｉ ｕｍ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ．Ｉ ｔ ｓ ｓ ｐｅ ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｎｔ ｉ ｇｅ ｎ ｗｅ ｒ ｅ ｏｂｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ｂｙ ｉ ｍ ｍ ｕｎ ｏｃ ｙｔ ｏ ｃ ｈｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ．
ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｌ ｏ ｗ ｏ ｘ ｙ ｇ ｅ ｎ ｄ ａ ｍａ ｇ ｅ ｍｏ ｄ ｅ ｌ （ Ｉ ） ， ｗｉ ｔ ｈ ｎ ｏ ｒ ｍａ ｌ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ ｆ ｒ ｅ ｅ ｏ ｘ ｙ ｇ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ （ Ｎ） ． Ｉ ｎ ｖ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｓ ｔ ｍｉ — ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｅ ｌ ｌ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｓ ｂ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｈ ｙ ｐ ｏ ｘ ｉ ａ ， Ｍ ＴＴ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｖ ｉ ｔ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ， Ａｎ ｎ ｅ ｘ ｉ ｎ Ｖ —Ｆ Ｉ ＴＣ ａ ｎ ｄ Ｐ Ｉ ｄ ｏ ｕ ｂ ｌ ｅ ｍａ ｒ ｋ ｉ ｎ ｇ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ａ ｐ ｏ ｐ ｔ ｏ ｓ ｉ ｓ ｒ ａ ｔ ｅ ． Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ｃｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｒ ａ ｔ ＣＭ ＥＣｓ ｈ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｔ ｙ ｐ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｖ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ

新生大鼠心脏微血管内皮细胞的分离培养及鉴定
周燕琼;郭福晓;贾强用;张艳美;郑燕珊;李乐娜;石刚刚
【期刊名称】《汕头大学医学院学报》
【年(卷),期】2008(21)3
【摘要】目的:介绍一种改良的心脏微血管内皮细胞(CMECs)的分离培养及鉴定方法。

方法:应用酶消化法分离大鼠CMECs,再用差速贴壁进行纯化。

结果:用光学显
微境、免疫细胞化学法进行第Ⅷ因子相关抗原染色来鉴定CMECs,其纯度约98%。

结论:该法简单且经济。

【总页数】4页(P135-136)
【关键词】新生大鼠;心脏微血管内皮细胞,分离,培养,鉴定
【作者】周燕琼;郭福晓;贾强用;张艳美;郑燕珊;李乐娜;石刚刚
【作者单位】汕头大学医学院药理学教研室;汕头大学医学院第一附属医院泌尿风
湿病区
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R322.11
【相关文献】
1.改良大鼠心脏微血管内皮细胞的培养方法及鉴定 [J], 周蓉芳;李莉;严静
2.大鼠脊髓微血管内皮细胞的分离培养与鉴定 [J], 苑晓晨;李炳蔚;秦伟伟;武清斌;
荆瀛黎;李宏伟;刘淑英;修瑞娟
3.大鼠心肌微血管内皮细胞的分离培养和鉴定 [J], 滕丽新;刘胜学;谢庭菊;何作云
4.大鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离培养及鉴定 [J], 张磊;胡格;张涛;林红;索占伟;段慧琴;穆祥
5.SD大鼠心脏微血管内皮细胞的分离及培养 [J], 朱世辉;苏波;唐洪泰;李元义;刘世康;陈玉林;葛绳德
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亡， 高 ｅ Ｏ 提 Ｎ Ｓ的表 达 水平 ， 少 蛋 白质 的 硝 基 化程 度 。结 论 减
提示 ｈ ｘ ｒ ｉ ｅａ ｌ ｅ ｎ对脑 动脉 粥 样 硬 化 可 能有 一 定 抑 制作 用 。
ｈｘｒｌ ｅａ ｉ 有 效 抑 制 由 Ｏ ｅ ｎ能 Ｘ—Ｌ Ｌ引 起 的 脑微 血 管 内皮 细 胞 损 伤 ， Ｄ
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-596•安徽医科大学学报Ada Unwersitatis Medicinalis Anhut2621Apr；56(4)网络出版时间：2621-3-116：50网络出版地址：https：//k/ki.3W/kcms/dwPH34.1025.R.26216317.1521.html大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养刘倩，韩陈陈,罗婷婷，张雨，李浩，马场，魏伟摘要目的体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型。

方法无菌取大鼠股动脉血管，胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD30阳性细胞，并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-C法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力，以法、Mv/gW胶法检测其迁移和成管功能。

结果胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在2627-29-17接收基金项目：国家自然科学基金（编号：51562123、51330051、51273444）作者单位:安徽医科大学临床药理研究所，合肥230234作者简介:刘倩，女,硕士研究生；魏伟，男，博士，教授，博士生导师，责任作者,E-mVi：wwei@ahmu.efu.ch；马场，女，博士，副教授，责任作者，E-mail:mayane_ahmu@ 14~16d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，细胞呈现典型铺路石状。

流式检测其纯度为3&34%,分选后利用CD30进行荧光染色鉴定，细胞均为CD30阳性；PGE3可显著上调CD30阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能。

结论该研究采 用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型。

关键词大鼠;股动脉;原代血管内皮细胞;分离培养;鉴定中图分类号R394.26；R322.120文献标志码A文章编号1000-1492（2620）04-0566-05 doi：r6.19465/p cnki.isspl000-0492.2621.04.hl7根据血管的结构、功能和运输方向差异,分为动脉、静脉和毛细血管。

ｃｌ ｒ ｆ ｕ ｎｒ ｍｅｏａｅ ａ ｅｄｔｅ ａ ｃｌ （ ＭＶ Ｃ ） ｏ ｒｔ ｕｔ ｅｏ ｌ ａｙ ｉ ｖ ｕ ｒ ｎ ｏ ｌｌ ｅｓ Ｐ Ｅ ｓ ｆ ａ ．Ｍｅ ｏ ｓ Ｔ ｅｔｓｅｂｏｋ ｐｓ ｄ ｕ ｐ ｍｏ ｒ ｓ ｌ ｈ ｉ ｌ ｓ ｔ ｄ ｈ ｉ ｕ ｌ ａｔ ｈ ｓ ｃ ｅ
Ｃ Ｅ ｕ－ｕ ．Ｚ Ａ ｉ ８ ．Ｎ Ｕ ｈ ｎｙ ．Ｚ Ａ ｉｇ Ｚ Ａ Ｙ －ｉ ． Ｄ ｐ ｒ ｅ ｔห้องสมุดไป่ตู้ｆ Ｈ Ｎ Ｒ ｉ ａ Ｈ Ｏ Ｚ— ｈ ｇ Ｉ Ｃ ｕ —ｕ Ｈ Ｎ Ｊ ．Ｈ ＮＧ ｕｐｎ ｎ ｇ ｅａｔ ｎ ｍ ｏ
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陈瑞华， 自 牛春 雨 张 静 ， 赵 刚， ， 张玉平
【 摘要】 目的 建立简单有效地获取大鼠肺微血管内皮细胞（ Ｍ Ｅ ） Ｐ Ｖ Ｃ 的培养方法。方法 从实
验动物 、 培养基 、 植块方法 、 牛血清浓度等 方面对植块 培养法进行 改进 ， 用 Ｗｉａ 雄性 大 鼠的肺组 胎 应 ｓｒ ｔ 织， 进行 Ｐ Ｅ ＭＶ Ｃ的原代培养并传代培养 ； 通过倒置 显微镜 、 扫描 、 透射 电镜 观察其形 态 ， 进行免疫组 并 织化学鉴定 。结果 结论 体外 培养 的大 鼠 Ｐ Ｅ ＭＶ Ｃ呈梭形或 多角形 ， 形成单层 后呈典 型的鹅 卵石样或铺 路 石样排列 ， 获得的血管 内皮细胞纯度 较高 ， Ⅷ因子 阳性反应 ， 抗 成功 建立 了 Ｐ Ｅ ＭＶ Ｃ的 原代培养 方法 。 改进的植块培养法 简便 、 可靠 ， 获得的 Ｐ Ｅ ＭＶ Ｃ纯度高 ， 生长状态 良好 ， 保持 了内皮细胞 的结 构和 功能 ， 可用于其功 能特性的进一步研究。

黄连解毒汤有效成分对缺氧-复氧时脑微血管内皮细胞V C A M -1表达的影响袁拯忠1＊,朱陵群2,庞　鹤2,单泽松1,王硕仁2,高永红2,牛福玲2(1.温州医学院附属第一医院,浙江温州325000;2.北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室,北京100700)[摘要]　目的:研究栀子苷、黄芩苷和小檗碱对缺氧-复氧损伤时大鼠脑微血管内皮细胞的保护机制。

方法:建立离体大鼠脑微血管内皮细胞缺氧4h 复氧12h 损伤模型。

用0.128,0.064,0.032μm o l ·m L -1栀子苷,0.028,0.014,0.007μm o l ·m L -1黄芩苷和0.024,0.012,0.006μm o l ·m L -1小檗碱分别作用于损伤的细胞,采用免疫细胞化学方法和图象定量分析技术,检测平均吸光度和平均面积,比较各组血管细胞间黏附分子-1(V C A M -1)蛋白表达的变化;采用R T -P C R 方法检测并比较各组V C A M -1m R N A 表达的变化。

结果:模型组V C A M -1蛋白表达的平均吸光度值和平均面积以及V C A M -1m R N A 表达显著高于正常组(均P<0.01)。

所有给药组的平均吸光度值和平均面积均低于模型组,差异有统计学意义(均P<0.01)。

0.007μm o l ·m L -1黄芩苷组、0.012,0.006μm o l ·m L -1小檗碱组的平均吸光度值较正常组高,差异有统计学意义(P <0.05,P<0.01,P <0.01),其余各给药组与正常组的差异无统计学意义。

0.014μm o l ·m L -1黄芩苷组平均面积高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05),其余各给药组与正常组的差异无统计学意义。

各给药组m R N A 表达高于正常组且低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

脑微血管内皮细胞与体外培养神经干细胞共培养后Th1/Th2相关细胞因子的表达罗文芳1唐涛黎杏群林源罗杰坤钟鹏程刘清娥（中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南长沙410008）〔摘要〕目的体外观察脑微血管内皮细胞（MVECs ）对来自大鼠海马神经干细胞（NSCs ）免疫相关细胞因子表达的影响。

方法采用Tran-swell 建立神经干细胞与脑微血管内皮细胞共培养模型（NSCs +MVECs ），用荧光免疫化学和RT-PCR 测定NSCs 中与Th1相关的IFN-γ、IL-2及与Th2相关的IL-4、IL-10的表达。

结果两种细胞共培养后，神经干细胞呈INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10阳性；同时INF-γ、IL-2mRNA 的表达上调，而IL-4、IL-10mRNA 的表达下调，与空白对照组比较明显差异（P ＜0.01）。

结论脑微血管内皮细胞（MVECs ）有可能使神经干细胞的INF-γ、IL-2表达上调，IL-4、IL-10的表达下调。

〔关键词〕脑微血管内皮细胞；神经干细胞；Th1细胞因子；Th2细胞因子〔中图分类号〕R743.34〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0512-05；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.034The expressions of Th1/Th2related cytokines after co-cultured microvascular endothelial cells with neural stem cells in vitro LUO Wen-Fang ，TANG Tao ，LI Xing-Qun ，et al .TCM Research Insitute of Xiangya Hospital Central-South University ，Changsha 410008，Hunan ，China【Abstract 】Objective To investigate microvascular endothelial cells （MVECs ）on the expressions of IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10of NSCs in vitro.Methods Rat neural stem cells （NSCs ）aged 3 5day were adopted for amplification in vitro ，and co-cultured microvascular endothelial cells with neural stem cells.After 48h ，the expressions of IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10were assayed by immunohistochemistry and RT-PCR.Results After 48h of co-cultured ，the NSCs was positive of expressions in cytokines INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10；and the expres-sions of INF-γ，IL-2were increased ，the expressions of IL-4，IL-10were deceased （P ＜0.01）.Conclusions MVECs maybe up-regulate the expressions of IFN-γ，IL-2and down-regulate the expressions of IL-4，IL-10of NSCs.【Key words 】Microvascular endothelial cells （MVECs ）；Neural stem cells ；Th1cytokines ；Th2cytokines基金项目：国家自然科学基金资助项目（30472264）1南华大学附属第一医院中医科通讯作者：黎杏群（1933-），女，教授，主要从事中西医结合脑血管病及肿瘤病研究。

HBMEC (Human Brain Microvascular Endothelial Cells人脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。

大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。

如：1）脑微血管内皮细胞存在许多细胞间紧密连接，产生很高的跨内皮阻抗，延迟细胞旁的通量；2）脑微血管内皮细胞缺乏内皮细胞的窗孔结构，其液相物质胞饮水平较低；3）脑微血管内皮细胞具有不对称定位酶和载体介导转运系统，从而产生“两极分化”的表现型。

与外周内皮细胞相同，大脑微血管内皮细胞表面表达细胞粘附分子，调控白细胞进入大脑。

由于微血管内皮细胞的器官特异性，内皮细胞通常取源于疾病研究的相关组织。

大鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的重要成分，与外周血管内皮细胞不同，它具有高跨内皮阻抗（transendothelial electrical resistance，TER）、细胞间紧密连接、极少的胞饮小泡、缺乏窗孔结构以及含有选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征，从而使血脑屏障形成一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性的屏障[1]。

由于体外培养的脑微血管内皮细胞保持了较多的其体内固有的特点[1]，因此目前脑微血管内皮细胞体外培养模型已被广泛应用于血脑屏障的研究、脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究、新药筛选、脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究等领域。

而大多数体内实验采用大鼠为动物模型，而且大鼠具有较多的细胞生物学研究所需的抗体可用，因此进行大鼠脑微血管内皮细胞的培养具有重要的意义。

自从Panula等[2]首次成功培养大鼠脑微血管内皮细胞以来，国内外有关大鼠脑微血管内皮细胞的分离和培养方法已有较多的报道，我们发现国内的方法多以组织匀浆、两次尼龙网过滤分离脑微血管段为主[3,4]，也有采用酶消化、梯度离心及尼龙网过滤的[5]，但细胞得率均较低，而近些年来国外大多数方法采用以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培养[6~9,11,12]。

血管内皮细胞培养方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：血管内皮细胞是一种位于血管内壁的重要细胞，它们在维持血管结构稳定、调控血管张力和血液循环等方面发挥着重要作用。

对血管内皮细胞进行培养研究具有重要的生物学意义和临床应用前景。

下文将介绍一种常见的血管内皮细胞培养方法，希望能为相关研究工作提供一些帮助。

一、血管内皮细胞的来源：血管内皮细胞主要来源于人体的血管组织，通过合适的方法可以从血管中分离和提取。

通常来说，可以选择人体动脉、静脉等血管组织作为细胞来源，从中分离得到血管内皮细胞进行培养。

在实验动物中，也可以选择小鼠、大鼠等动物的血管组织来获取血管内皮细胞。

1. 血管组织的分离和处理：需要将血管组织从人体或动物中取出，并去除周围的结缔组织和肌肉组织。

然后，将血管组织切成小段，并用适当的消化酶进行消化处理，使内皮细胞从血管组织中释放出来。

2. 血管内皮细胞的分离和纯化：经过消化处理后，将获得的细胞悬液进行离心分层，采集含有内皮细胞的上清液。

然后，可以通过负性筛选或CD31抗体磁珠等方法将内皮细胞进行进一步的分离和纯化。

3. 血管内皮细胞的培养和传代：将得到的血管内皮细胞接种到预先涂有明胶或基底膜的培养皿中，加入适当的培养基和生长因子，将细胞放入细胞培养箱中进行培养。

随着细胞的增殖和扩张，可以进行细胞的传代，维持内皮细胞培养的稳定性。

4. 血管内皮细胞的鉴定与应用：在进行内皮细胞培养的过程中，需要对细胞进行鉴定，确认其具有内皮细胞的特征和功能。

通过免疫组化染色、PCR检测等方法，可以检测内皮细胞表面标记物和相关基因的表达情况。

血管内皮细胞在动脉粥样硬化、血管疾病等方面的研究应用也具有广泛的前景。

1. 培养环境的控制：血管内皮细胞对培养环境的要求比较严格，需要在无菌条件下进行培养，并保持适当的温度、湿度和CO2浓度等参数。

2. 培养基的选择：选择适合血管内皮细胞生长和扩张的培养基是培养过程中的关键。

微血管内皮细胞的体外分离培养方法概述微血管内皮细胞的体外分离培养方法概述＊段慧琴1，张永东2，穆祥1*(1.北京农学院动科系，北京102206；2.北京农业职业学院，北京102442)摘要：微血管内皮细胞在许多病理生理过程中起着关键性的作用。

应用体外培养的微血管内皮细胞，不仅广泛应用于微循环系统对不同生理或病理刺激的反应，也可阐明伴随微血管功能障碍和组织损伤的某些疾病的病理机制，所以分离培养动物及人各个器官组织微血管内皮细胞的报道日渐增多。

微血管内皮细胞分离方法主要有3种，包括酶消化法、机械分离法和磁珠分离法，每种方法各有利弊。

微血管内皮细胞一般通过其表面的血管紧张素酶、摄取乙酰基低密度脂蛋白和表达Ⅷ因子相关抗原进行鉴定。

目前从不同组织器官分离培养微血管内皮细胞的方法已经比较成熟。

关键词：微血管内皮细胞；体外；分离培养从1973年Jaffe E A等成功培养人的脐静脉内皮细胞至今，血管内皮细胞的研究已经取得了重要的进展，极大地丰富了人们对血管内皮细胞的认识。

研究资料已经证实，动脉起源的内皮细胞不同于静脉起源的内皮细胞，微血管内皮细胞不同于大血管的内皮细胞[1]，并且不同器官组织起源的血管内皮细胞也表现出不同的功能特性。

微血管内皮细胞所表现的组织器官特异性，使人们认识到微血管内皮细胞研究的重要性。

因此，研究发生于某一器官或组织的微血管病变，应该采用这一器官或组织的微血管内皮细胞作为细胞模型。

因此，微血管内皮细胞的培养技术越来越受到人们的重视，已经成为医学研究中不可缺少的重要手段。

但是，由于微血管内皮细胞的培养难度较大，研究成本较高，因而它的普及和应用都受到一定的限制。

近年来，内皮细胞生长因子的应用和免疫磁珠技术的发展，使微血管内皮细胞的培养和纯化变得相对简化，加之许多微血管内皮细胞系的建立，使得微血管内皮细胞的研究及应用得到迅速发展。

1微血管内皮细胞体外培养状况到目前为止，人体主要器官和组织的微血管内皮细胞已经培养成功。

大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定侯伟;魏红玉;罗彦彦;许淑茹;陆俊佳;畅荣妮;舒伟【摘要】目的:研究大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定方法.方法:取出生5～7 d左右的大鼠乳鼠的腹主动脉血管,用组织块法在含20％胎牛血清及内皮细胞生长添加剂和肝素的DMEM培养基中培养,倒置相差显微镜观察内皮细胞形态和生长特征,免疫荧光方法进行血管内皮细胞Tie2相关抗原的鉴定.结果:来自于大鼠乳鼠腹主动脉的血管内皮细胞在改良的培养基中进行体外培养,能够保持增殖和传代的能力,且Tie2抗原鉴定呈阳性.结论:成功分离大鼠乳鼠腹主动脉组织并且获得体外原代培养大鼠乳鼠腹主动脉内皮细胞.用组织培养方法可以获得较满意的血管内皮细胞.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)004【总页数】4页(P556-559)【关键词】大鼠乳鼠;血管内皮细胞;细胞培养;Tie2【作者】侯伟;魏红玉;罗彦彦;许淑茹;陆俊佳;畅荣妮;舒伟【作者单位】广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021;广西医科大学药学院有机化学与药物化学教研室南宁 530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁530021;广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R-33血管内皮细胞(endothelial cell，EC)是覆盖于血管腔表面的单层细胞，是血管结构和功能的基础，具有多种重要的生理功能。

EC不仅调节血管生成，还调节血液和组织之间的物质交换以及分泌许多细胞因子。

血管生成与恶性肿瘤的增殖、转移与浸润的关系是当前研究的热点，血管EC在肿瘤血管形成中起重要作用[1,2]，可以为抗肿瘤血管形成及其他血管依赖性疾病的研究提供条件。