平滑肌细胞培养-文献版解读

摘要器官移植长期以来受到捐献数量不足以及移植排斥的影响，组织工程作为再生医学的重要工具，目的就是为了解决器官移植的不足。

然而传统组织工程使用生物可降解材料或注射细胞悬液的方法也有诸多不足，生物可降解支架的生物相容性需要验证，某些生物支架会造成植入部位附近组织发炎增生，生物可降解支架的降解也会引起炎症反应。

其次，支架降解会留下一定空间，而这些空间通常会被增殖的细胞以及大量的胞外基质填满，但是过多的胞外基质以及支架降解残留物又会造成组织纤维化，从而产生病变。

因此，研究者们创造出新的组织工程的方法来制备组织，即使用温敏性高分子材料制备温敏性细胞培养基底，并以此制备细胞片应用于组织工程中。

本文首先探讨气道平滑肌细胞的原代培养与鉴定，接着通过使用聚异丙基丙烯酰胺以普通细胞培养皿为基础制备温敏性细胞培养基底，并在其上培养气道平滑肌细胞，以观察温敏性培养基底对气道平滑肌细胞生长的影响以及其调控细胞的黏附行为，并通过温敏性培养基底制备气道平滑肌细胞片。

主要目的是掌握大鼠气道平滑肌的原代培养和鉴定以及温敏性细胞培养皿的制备工艺，并为将来更深层次的研究打下基础。

本文主要实验结论如下：①使用水和异丙醇作为溶剂制备异丙基丙酰胺溶液，结果发现以水作为溶剂的异丙基丙酰胺溶液经照射后无法达到温敏性培养基底的标准，原因是异丙基丙烯酰胺在水里的溶解度过低，通过聚合无法使异丙基丙烯酰胺与普通培养皿表面形成良好的共价连结。

②利用西南医院辐照中心γ射线以及四川原子能研究院电子加速器对涂覆有异丙基丙烯酰胺单体的普通细胞培养皿进行辐照。

结果发现，使用γ射线辐照能够制备聚异丙基丙烯酰胺水凝胶，但无法制备温敏性培养基底。

原因是γ射线辐照所需时间过长，导致溶剂异丙醇溶剂已挥发完全。

相反，电子加速器辐照则很好地解决了这个问题。

③以异丙醇为溶剂配制不同质量浓度比例40%，45%，50%，55%的异丙基丙酰胺溶液，结果发现45%质量浓度下制备的温敏性培养基底细胞黏附性最佳。

小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。

方法改良酶消化法。

结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。

结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。

吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。

体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。

1100Human Brain Vascular Smooth Muscle Cells人脑血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞是许多动脉疾病的细胞水平的根源。

血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素。

最新研究表明血管平滑肌细胞表达的ICAM-1 和VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关.人血管平滑肌细胞的体外培养是血管研究中的重要模型，并将对血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息.细胞培养说明注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。

将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。

经过以下步骤后开始培养细胞1.准备多聚赖氨酸包被的培养瓶(2μg/cm2，推荐用T-75的培养瓶)。

向T-75瓶内加入10ml 无菌水，然后加入15μl多聚赖氨酸原液(10mg/ml,ScienCell cat. no. 0413).将培养瓶放入培养箱中过夜(至少在37°C中过一小时)2.准备完全培养基：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。

在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。

用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。

3.用无菌水冲洗多聚赖氨酸包被的培养瓶两次并向瓶内加入20 ml完全培养基。

将培养瓶放入超净台中，然后融化细胞。

4. .将小瓶放入37°C水浴中，轻轻地握住并旋转小瓶直到完全融化。

将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。

小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面。

用1ml eppendorf吸管轻轻重悬管内容物。

5.将管中内含物放入均匀的，多聚赖氨酸包被的培养瓶中。

推荐接种密度为5,000 cells/cm2。

注意：细胞融化后不推荐稀释和离心，因为这些操作比培养基中DMSO残留物对细胞的伤害大。

血管平滑肌细胞接种在多聚赖氨酸包被的培养瓶中能促进细胞帖壁。

胃肠道平滑肌细胞培养及鉴定高静;徐晓霞;陈平【摘要】胃肠道平滑肌原代细胞培养基本保留了体内生长特性,作为一种体外研究模型,在生理学、病理学、胃肠动力学和药物代谢动力学等较多研究领域显示出细胞株所不具备的优越性.本文就胃肠道平滑肌原代细胞的分离、培养、纯化和鉴定方法方面进行了综述,为研究消化系统疾病培养胃肠道平滑肌细胞方法的选择提供参考.【期刊名称】《哈尔滨医药》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】3页(P185-187)【关键词】胃肠道平滑肌细胞;分离;培养;纯化;鉴定【作者】高静;徐晓霞;陈平【作者单位】内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010;内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010;内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010【正文语种】中文【中图分类】R573胃肠道平滑肌组织在人和动物体内分布广泛，是构成人体消化道的重要空腔脏器，通过收缩蠕动来协助器官的功能发挥。

胃肠道平滑肌原代细胞由于刚刚从活体组织分离出来，生物学特性还未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，可反映出体内生长的一般性质，适合用于胃肠动力学、运动调节机制及药物研究等[1]。

但由于获得胃肠道原代细胞的过程较复杂、培养困难，使得原代细胞还不能成为实验材料的首选对象。

原代细胞是否培养成功主要与细胞的分离、培养方法有关，因此有效分离原代细胞并保持其相应的生物学特性，找到适合其生长的环境尤为重要。

胃肠道平滑肌细胞培养主要来自于SD乳鼠、小鼠、大鼠、豚鼠及家兔等，取材前务必将实验动物禁食12 h以上（未进食的可直接用于实验），分离材料时应在手术显微镜或解剖显微镜下进行，以达到分离完全的目的，分离后应用4℃含双抗（青霉素，链霉素）的PBS液反复冲洗，直至组织块发白，再用不含血清的培养基冲洗1～2遍，将洗好的组织剪成1～2mm3大小组织块，在剪碎的过程中要保持湿润，最好使用不含血清的培养基，使用的刀剪尽量锋利，预防对组织的撕拉等造成损伤，应尽量缩短取材的时间。

[1] 。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。

在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。

本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。

1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。

动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。

DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。

转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。

放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。

【摘要】目的：探讨哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法，了解其生长特性。

方法：制作慢性哮喘大鼠模型，用酶解离法、组织贴块法分别培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞，倒置相差显微镜观察其生长情况，用免疫组化SP法分析SMα-action抗原的表达。

结果：以酶解离法培养2～3 d可见细胞贴壁，7～9 d 可融合；以贴块法培养7～10 d组织块周围有细胞长出，10～14 d融合，传代后细胞“谷峰”生长明显。

SMα-action免疫组化SP法染色均呈阳性。

结论：两种方法均能培养出纯度较高的哮喘大鼠平滑肌细胞，其中酶解离法细胞产量高，纯度高，生长速度快，能为气道疾病细胞实验提供可靠的细胞模型。

【关键词】大鼠哮喘气道平滑肌细胞培养支气管哮喘(简称哮喘）是儿童最常见的一种慢性炎症性疾病，气道重塑是引起慢性哮喘患者气道不可逆或部分不可逆阻塞的病理基础[1]，是诱发气道高反应性和哮喘慢性化的主要原因。

平滑肌增生肥大是气道重塑的病理学特点之一[2]，故体外气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMC)培养是研究哮喘发病机制的重要手段。

ASMC培养常用的培养方法有贴块法和酶解离法[3-4]。

本研究用以上两种方法培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞，观察其生长特点，并进行比较。

1 材料和方法1.1 实验动物和试剂 4～6周龄雄性SD大鼠，购自上海动物中心。

DMEM 高糖培养基、0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液、特级胎牛血清购自法国Biowest 公司；D-Hanks液、青链霉素购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；I型胶原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA)购自美国Biosharp公司；大鼠抗α-actin单克隆抗体购自武汉博士德公司；SP免疫组化试剂盒(二抗)购自上海晶美生物工程有限公司。

1.2 慢性哮喘大鼠气道重塑模型的建立参考李昌崇等 [5-6]的方法复制哮喘慢性模型，致敏阶段：第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1.5 mL[内含OVA 1 mg和Al(OH)3 100 mg]；激发阶段：第15天开始以1% OVA生理盐水溶液雾化吸入，隔天一次，每次30 min，共60 d。

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1 细胞培养1.1.1 培养液配制DMEM(美国Gibco公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,美国Hyclone)。

1.1.2 培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3 大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4 原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1 细胞培养1.1.1 培养液配制 DMEM(美国Gibco公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素 (100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,美国Hyclone)。

1.1.2 培养器皿 25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3 大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4 原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。