血管平滑肌细胞及内皮细胞的体外培养

外泌体对不同细胞的调控修复作用研究进展张君涛;王平;张超;尚曼;焦建杰;张栋林;吴超超【摘要】外泌体是一种由细胞分泌至细胞外的膜性囊泡样微体,具有组织细胞信使的功能,在调控细胞生理功能和诱导修复方面具有重要作用.间充质干细胞是体内一类具有增殖、分化潜能的成体干细胞,被认为是产生外泌体能力最强的细胞.外泌体对软骨细胞、神经细胞、肿瘤细胞、心血管细胞等不同细胞均具有调控修复作用,从而发挥抑制软骨细胞退化、促进神经细胞再生、抑制肿瘤细胞增殖、保护心肌细胞和促血管新生,以及诱导基因重组使细胞去分化、重新启动再生功能等作用.外泌体广泛参与细胞之间的物质传递及信号交流,因此推测其可能分泌某些因子来实现损伤组织修复.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2017(057)044【总页数】3页(P104-106)【关键词】外泌体;软骨细胞;神经细胞;肿瘤细胞;调控修复【作者】张君涛;王平;张超;尚曼;焦建杰;张栋林;吴超超【作者单位】天津中医药大学第一附属医院,天津300380;天津中医药大学第一附属医院,天津300380;天津中医药大学第一附属医院,天津300380;天津医科大学;天津医科大学;天津中医药大学;天津中医药大学【正文语种】中文【中图分类】R34外泌体是一种由细胞分泌至细胞外、富含特异性微小RNA(miRNA)和转运RNA(tRNA)的膜性囊泡样微体，具有诱导、调控和修复细胞分化、抗肿瘤免疫、促血管新生等生理功能[1～3]。

Lai等[4]发现，间充质干细胞(MSC)在分化为不同组织细胞时产生许多囊性功能微泡，并首次证实为间充质干细胞外泌体(MSC-exosomes)。

Baglio等[5]通过实验分离由人骨髓和脂肪间充质干细胞分泌的外泌体，并通过电子显微镜标记、蛋白分析、小RNA测序等方法证实人骨髓和脂肪间充质干细胞分泌的外泌体富含特异性miRNA和tRNA。

外泌体通过三种方式作用于靶向细胞[6]：①直接与靶细胞的细胞膜融合，同时释放mRNA、miRNA进入细胞质；②通过内吞作用被靶细胞摄取；③识别细胞表面的特异性受体。

组织细胞培养概述组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。

其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。

细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。

器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。

组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。

细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。

（一）体外培养方式的分类体外培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。

传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。

原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。

如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。

（二）体外培养细胞的分型根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。

1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。

血管生成实验模型研究进展吴家明1,陆　茵1,2,郜　明1,张伟伟1(1.南京中医药大学中医药研究院,江苏南京　210029;2.江苏省方剂研究重点实验室,江苏南京　210029)收稿日期:2007-09-21,修回日期:2007-11-01基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 30371727,30772766);江苏省自然科学基金资助项目(No BK2003113)作者简介:吴家明(1980-),男,硕士生,研究方向:肿瘤血管生成与抗肿瘤转移研究,E 2mail:nj w ujia m ing@;陆　茵(1963-),女,教授,博士生导师,研究方向:肿瘤血管生成与抗肿瘤转移研究,通讯作者,Tel:025286798154,E 2mail:luyingreen@中国图书分类号:R 205;R 332;R 3632332;R 36413文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)01-0011-04摘要:抗血管生成已经成为治疗肿瘤转移、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎等疾病的重要策略之一。

血管生成模型作为一种研究工具在探讨血管形成机制、发现促进或抑制血管生成药物等研究中发挥十分积极的作用。

如何寻找适合的血管生成模型是研究人员在研究中常遇到的问题。

该文就主要常用模型做较全面的介绍,并对其优缺点进行评价。

关键词:血管生成;模型 血管生成(angi ogenesis )是指在原有的毛细血管和(或)微静脉基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖,从已存在的血管处以芽生或非芽生(套迭)形式形成新的、以毛细血管为主的血管系统过程[1]。

血管生成是许多促进或抑制血管生成的分子参与调节的一个平衡过程[2]。

血管生成过多与肿瘤、糖尿病性视网膜病变等疾病有关[3],抑制血管生成已经成为治疗这些疾病的重要策略。

因此寻找血管生成抑制剂成为研究热点。

血管生成研究需借助血管生成模型进行,血管形成的许多过程都可以在血管生成模型中模拟完成,包括内皮细胞增殖、迁移、毛细血管网状结构的形成等。

75第11卷 第6期 2009 年 6 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 11 No. 6 Jun . ，2009血管平滑肌细胞(VSMC)存在于血管内膜内皮细胞下,是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，在正常成人体内通过缓慢和轻度收缩来维持血管壁的张力,而血压在很大程度上是由血管张力维持的。

VSMC 的异常增殖和凋亡在高血压的发病中具有重要的作用。

1 高血压时血管平滑肌细胞的增殖VSMC 的增殖是血管硬化不可缺少的条件。

过度增殖的VSMC 导致的血管腔变小、管壁增厚在高血压的发病机理中起重要的作用。

目前已经发现了多种与VSMC 增生相关的细胞因子及一些相关的基因。

肾素-血管紧张素系统(RAS)在高血压发病学中起着重要作用。

该系统包括肾素、血管紧张素(Ang II)、血管紧张素转换酶(ACE)等。

Ang II 具有强大的血管收缩作用，并能促进血管平滑肌细胞增殖、肥大，使血管壁硬化，管腔狭窄。

它一方面通过强烈收缩血管，升高血压而促进动脉重建；另一方面还能直接促进VSMC 的肥大和胶原纤维增生导致血管重建。

它还可以促进心血管组织的许多过程。

包括：细胞的生长，迁移，分化以及凋亡。

因此，血管紧张素II 可能是影响心血管系统重构的重要因素之一[1]。

有趣的是血管紧张素II 在其处于生理浓度时就能促进原代培养的人皮下小动脉平滑肌细胞生长[2]。

Xu X 等[3]用血管紧张素II 处理从雄性SD 大鼠胸主动脉分离的平滑肌细胞，发现，可使组蛋白去乙酰化酶5（HDAC5）成时间和剂量依赖性的磷酸化。

血管紧张素受体-1、PKC、PKD1介导了HDAC5 的磷酸化。

另外，血管紧张素II 还刺激了HDAC5核转运。

结果，抑制PKD1和HDAC5 可显著减弱血管紧张素II 诱导的血管平滑肌细胞的增殖。

说明，血管紧张素II 诱导的VSMC 的过渡增殖可能是通过PKD1依赖的HDAC5磷酸化和核转运介导的。

血管老化的研究进展血管老化动脉粥样硬化性血管疾病是一种多因素疾病，年龄是动脉粥样硬化发生与发展的独立危险因素。

在动脉粥样硬化所有已知的危险因素中，对年龄的作用了解地相对较少。

已有的研究表明老年伴随血管老化，与年龄相关的动脉老化通常出现在阻塞性动脉粥样硬化血管事件之前，在动脉粥样硬化斑块中分离的血管内皮细胞和平滑肌细胞中，可发现衰老形态的细胞；给不同年龄段的动物喂以相同的致粥样硬化饮食，虽然会出现程度相同的高脂血症，但老年组动物动脉粥样硬化的斑块明显比年轻组严重［1］。

提示血管老化是年龄导致动脉粥样硬化血管疾病形成的关键环节。

本综述结合近年来的文献报道，探讨了血管老化的病理学研究进展。

1 老化血管结构和功能的病理学变化血管的生理发育完全约在20岁左右，此时的血管柔韧而富有弹性，完全适合机体供血的需要。

20岁以后，血管的发育状态维持相对稳定，直至中年期。

中年期后血管开始发生退行性变化。

这是一个缓慢的过程，个体存在较大的差异。

血管退行性变表现为随着增龄其长度和横断面的直径增长，即血管扩张和屈曲。

与此同时，血管壁发生了质的变化。

血管呈现生理性硬化，结果富有弹性的动脉壁伸展性降低，动脉供血功能减退，机体脏器功能随之逐渐降低，衰老过程开始。

1．1 血管内膜增厚大弹力动脉老化主要表现为血管壁的增厚，尤其表现在血管内膜出现明显的增厚和扩张。

研究发现这种老化血管内膜的增生是增龄引起，与动脉粥样硬化无关。

增龄引起的血管内膜的增厚与球囊扩张引起血管损伤而致的内膜增生是类似的。

外伤引起的内膜增生在老年大鼠明显强于年轻大鼠。

把老年大鼠的主动脉移植入年轻大鼠的体内，这种内膜的过度增生依然存在。

这些变化是由于血管内在因素引起的。

同20岁时相比，90岁时的冠状动脉内膜可增厚2~3成。

内膜增厚是动脉粥样硬化的危险因素，但是内膜增厚不一定会进展为动脉粥样硬化，在相当多的健康老年人存在血管内膜的增厚，但没有发现动脉粥样硬化的明确依据［2］。

[1] 。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。

在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。

本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。

1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。

动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。

DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。

转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。

放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1细胞培养1.1.1培养液配制DMEM(美国Corning Cellgro公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲胎牛血清)。

1.1.2培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。

关于内皮细胞和平滑肌细胞在微孔聚碳酸酯膜上共培养模型方法【关键词】平滑肌细胞关键词: 血管内皮细胞;平滑肌细胞;细胞培养;缝隙连接摘要:目的探讨主动脉内皮细胞（EC）和平滑肌细胞（SMC）共培养模型，为下一步研究两者之间的电生理活动提供基础. 方法采用微孔聚碳酸酯膜（polycarbonate filter membrane）作为载体，将EC和SMC接种于微孔膜的两侧，建立EC和SMC联合培养模型，模拟血管壁EC和SMC间的结构关系，采用倒置显微镜和透射电镜进行观察. 结果共培养的EC和SMC组织结构关系类似于体内，EC呈单层生长，而SMC呈多层生长，同类和异类细胞间都有缝隙连接形成，缝隙连接的形成与培养的时间有关，在SMC接种后24h，EC可以通过微孔与SMC形成缝隙连接. 结论此种EC和SMC共培养模型模拟了在体时EC和SMC之间的结构关系，可以用来研究两种细胞间的相互影响.Keywords:vascular endothelial cells;smooth muscle cells;cell culture;gap junctionAbstract:AIM To develop a method of endothelial and smooth muscle cells co-culture by which we can study the electrophysiologicalactivities between two kinds of cells.METHODS Endothelial and smooth muscle cells were grown on opposite sides of microporous polycarbonate filters.The interactions between cells were examined by inverted microscopy and transmission electron microscopy.RESULTS Status of theco-cultured cells was similar to that in vivo.Relative to theendothelial cells monolayer，the smooth mus-cle cells weremultilayer.There were many gap-junctions a-mong the endothelial cells and smooth muscle cells respec-tively.The heterocellular gap-junctions also existed between the two kinds of cells.The number of the myoendothelial junctions had respect to the co-culturing time.After SMCs were seeded on the filter，the ECs and SMCs formed the gap junctions through the micropores within24h.CONCLUSION This new co-culture method might be a promising in vitro model for studies of interactions between endothelial and smooth muscle cells.0 引言血管内皮细胞（endothelial cell，EC）和平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）之间的信号转导可以通过两种方式进行:①通过细胞间的体液性信息联系;②通过细胞间缝隙连接的接触性信息联系.前者涉及到一系列的细胞因子，由EC释放，而SMC上面有相应的受体［1］，如:内皮依赖性舒张因子（EDRF）.在缝隙连接中，同类或异类细胞之间通过缝隙可进行离子和代谢产物的传递等.血管EC和SMC间的缝隙连接具有方向性和电荷选择性，缝隙连接的多寡在血管的不同节段和不同的器官组织是不同的［2，3］ .这两种细胞的体液性及接触介导性信息联系对维持血管壁自身稳定有重要意义，这种信息联系的失衡可能与SMC的增生、动脉粥样硬化的发生有直接的联系［4］ .目前比较好地模仿生物体内EC和SMC关系的培养模型有微载体技术以及灌注跨毛细血管平滑肌内皮细胞共培养模型［5，6］，能够模仿体内的血流动力学环境，但其技术要求高，一般实验室不易实现.我们采用了微孔聚碳酸酯膜作为EC和SMC共培养的载体，该模型可以模仿体内EC和SMC的组织结构关系，在此基础上，利用倒置显微镜和透射电镜观察了两种细胞的生长情况和细胞间缝隙连接情况，为下一步研究两者间的电生理活动提供了保障.1 材料和方法1.1 材料牛主动脉取自健康屠宰小牛;SD大鼠仔鼠（第四军医大学实验动物中心）;1640培养基（Gibco）;加强小牛血清（Hyclone）;聚碳酸酯膜（10mm×15mm，厚12μm，孔径5μm，孔密度2800 mm-2 ，Millipore公司）;2g L-1 明胶（Gibco）.1.2 方法1.2.1 牛主动脉EC（BAEC）和仔鼠SMC的分离和鉴定按我们已建立的方法培养并鉴定牛主动脉EC和仔鼠胸主动脉SMC［7］，利用2～5代细胞进行实验.1.2.2 EC和SMC的共培养①聚碳酸酯膜的准备:取聚碳酸酯膜0.15MPa20min 高压消毒后备用，用前用明胶包被，培养箱内孵育3h，PBS浸洗后接种细胞;②共培养:按密度1×104 cm-2 将内皮细胞接种于聚碳酸酯膜的一侧，常规培养24h后翻转聚碳酸酯膜，将平滑肌细胞接种于膜的另一侧，24h后换液，以后每日换液1次，常规倒置显微镜观察，取接种后1，3和4d共培养标本进行透射电镜观察.1.2.3 透射电镜（TEM）标本的准备［8，9］取出两侧长有细胞的聚碳酸酯膜，用预热的PBS漂洗，然后在含25g L-1 戊二醛，0.1mol L-1 二甲胂酸钠溶液（pH7）里固定1h，20℃，再用10g L-1 四氧化锇固定1h，20℃，用1g L-1 的鞣酸染色，1h，20℃，来加强对比，然后用梯度乙醇逐级脱水，之后把标本浸于乙醇-EPON（1 1）中，1h，20℃，最后用EPON-环氧树脂包埋.用刀片将包埋块切成小块，垂直细胞层作超薄切片，用150目碳包被的铜网收集，然后用100g L-1 醋酸双氧铀和4g L-1 柠檬酸铅染色.2 结果2.1 SMC和EC在聚碳酸酯膜上生长情况细胞在接种2h后开始在膜上贴附延伸，接种1d后EC逐渐融合，呈单层生长，细胞呈多边形.SMC在接种1d后细胞之间开始融合，对数生长，至第2日可见SMC融合，EC外形呈明显伸长改变，细胞边界清楚.第3日SMC开始出现细胞分层生长，EC生长减慢.至第4日时两种细胞出现衰退现象.图1 －图6 略2.2 SMC和EC在聚碳酸酯膜上同类和异类细胞间缝隙连接形成的超微结构透射电镜结果显示，共培养1d后的EC和SMC在膜上呈单层生长状态，可观察到EC 之间的缝隙连接（Fig1），聚碳酸酯膜孔内可见细胞突起（Fig2），EC和SMC通过微孔之间形成缝隙连接（Fig3），在缝隙连接形成处可见两个细胞的质膜互相靠拢，其间有2～3nm的缝隙，其中可见电子密度较高的颗粒组成的虚线状结构.共培养后第3日时，可以看到EC穿过微孔生长到膜的另一侧（Fig4），到对侧与SMC形成缝隙连接，且缝隙连接形成的多少与共培养的时间有关，经过电镜观察到在接种SMC1d后，穿过微孔的EC有30%～40%可以与对侧的SMC形成缝隙连接，而在第3日就可以达到70%～80%.还可以观察到SMC呈现多层生长现象（Fig5）.至第4日时SMC明显发生退变，底层SMC开始分解（Fig6）.3 讨论EC和SMC的相互关系越来越引起大家的兴趣，人们正在努力寻求一种好的模型，能够模仿体内两者间的结构关系，便于在微观上研究二者的相互关系.本实验采用的聚碳酸酯膜作为EC和SMC共培养的载体，观察两种细胞之间的连接情况.实验中观察到EC保持了单层生长状况，而SMC可多层生长，而且两种细胞之间的缝隙连接也与体内相似.由于EC首先接种，且密度比较高，因此，1d后即形成单层生长，近于融合状态，且可以通过多聚碳酸脂膜间的微孔迁移到对侧生长，在滤膜另一侧接种SMC1d后，EC和SMC之间即可形成缝隙连接，且随着共培养时间的延长，两种细胞间形成的缝隙连接越多.表明利用该方法可以模拟在体时血管EC和SMC之间的组织结构关系，从而为进一步的研究奠定了基础.EC处于血管腔和中膜SMC层之间，尤其是在肌性血管中，血液流动速度很快，这就决定了EC和SMC之间的协调平衡对保证血管正常的张力具有重要意义.在流体切力作用下，EC把信息传递给SMC，目前认为有两种途径:①EC分泌一些特定的细胞因子，如:内皮依赖性舒张因子（EDRF）、内皮依赖性超级化因子（EDHF）、前列腺素（PG）、P物质（SP）等［10，11］;②通过EC和SMC两者之间的缝隙连接，EC可以把感受到的信息直接传递给SMC［3，12］，以保证血管的正常张力.流体对血管的作用是一种基本的生理刺激，自Furchget发现EC在血管张力调节中所起的关键作用以来，人们对内皮依赖性血管张力调节进行了广泛的研究，发现EDRF，EDHF等，但对 EC 如何感受流体、切应力的变化，并且将机械信号转导为电信号或化学信号的过程尚不十分清楚［13］，一些研究证实流体切应力大小的变化可以通过血管源性物质而调节血管张力［14］ .血管内血流量的调节主要位于肌性血管，并且发现EC和SMC之间广泛存在缝隙连接，且管径越细，这种结构越多，有的EC向SMC中伸起形成所谓的肌内皮结构（myo-en-dothelial junctions）.而当EC和SMC体内的缝隙连接逐渐被认识后［15，16］，人们就倾向于后一种途径了，认为EC把信息直接传递给SMC.Duling发现血管EC与SMC之间的缝隙连接具有方向性和电荷选择性，提出其在血管张力调节中可能起重要作用［2］，但目前关于这方面的研究相对较少.为观察流体切应力作用EC后SMC的电生理变化，我们设计了此共培养模型，该模型的优点可以模拟正常血管中EC与SMC之间的影响外，还可以将不同来源的EC和SMC组合培养，便于探讨不同器官和部分血管张力调节的异同.同时利用此模型可以实验各种因素作用EC后SMC的反映，更符合生理情况.目前能够很好模仿EC和SMC体内状况的模型是灌注跨毛细血管共培养模型，可以研究在流体切力作用下EC的形态变化及EC和SMC代谢变化，但其成本昂贵，操作复杂;另有微载体技术，它不能模拟在体时的流体力学环境，且两者在研究流体切力作用下EC和SMC之间电生理变化，从离子水平研究流体切力的作用，就显露出它们的局限性.本实验所采用的聚碳酸酯膜模型，结果表明可以模仿体内两者之间的关系，并且还可以在其基础上采用双层灌流装置，利用膜片钳技术来研究两者之间的电生理活动情况.参考文献［1］Garland CJ，Plane F，Kemp BK，Cocks TM.Endothelium-de-pendent hyperpolarization:A role in the control of vascular tone ［J］.Trends Pharmacol Sci，1995;16（1）:23-30.［2］Little TL，Xia J，Duling BR.Dye tracer define differential en-dothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteri-olarwall ［J］.Circ Res，1995;76（3）:498-504.［3］Jean-Louis B.Endothelial and smooth muscle cells hyperpolar-ized by bradykinin are not dye coupled ［J］.Am J Physiol，1990;258（3）:H836-H841.［4］Schwartz 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血管内皮细胞一平滑肌细胞共培养体系研究进展血管内皮细胞(endothelial cells, EC)和血管平滑肌细胞(smooth muscle cells, VSMC)的相互作用、相互影响维持血管生理功能和多种疾病的发生发展, EC-SMC联合培养模型是U前研究这2种细胞间相互影响的最佳方式。

作者对现有的EGSMC 共培养模型及共培养对这2种细胞结构和功能的影响进行综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据，也为建立更接近机体生理/病理状态的EC-SMC体外共培养体系提供参考。

标签：内皮细胞；平滑肌细胞；共培养；相互作用血管内皮细胞(endothelial cells, EC )和血管平滑肌细胞(smooth muscle cells, VSMC)是构成血管壁的主要细胞成分，2种细胞间的相互作用、相互影响是维持血管生理功能和血管壁自身结构稳定的关键，在病理条件下EC和SMC的相互作用同样可影响多种疾病的发生发展。

EC-SMC联合培养模型是忖前研究这2 种细胞间相互影响的最佳方式，对研究动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发病机制、血管壁生理及炎症反应等有重要意义。

本文就H前EC-SMC共培养模型和共培养模式下2种细胞的互相影响做一综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据。

1 EC-SMC共培养模型1」直接接触的共培养模式早在20世纪80年代，国外学者就开始尝试建立EC-SMC共培养的方法。

早期研究简单地将EC和SMC按一定的比例混合，种植在同一体系中，2种细胞能够混合生长，且相邻的EC和SMC之间形成连接［1］。

此模型较为原始，细胞混杂，EC和SMC没有形成生理状态下的结构层次，且2种细胞之间干扰较大。

在此基础之上，Davies等［2］引进了微载体技术, 即将2种细胞分别种植于微载体上，然后将微载体混合于同一体系，实验中相邻的微载体上同型或异型细胞间都形成接触连接。

血管平滑肌细胞分离及培养血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管中膜的主要细胞成分。

具有增殖、迁移、合成并释放细胞基质的能力，在血管性疾病的发生进展中有重要作用。

目前已了解到血管平滑肌细胞的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成形术后再狭窄等的主要病理表现。

利用体外培养血管平滑肌细胞可了解其正常和病态生物学特性及机制。

体外培养血管平滑肌细胞举行药物药理学方面的讨论。

体外培养血管平滑肌细胞可取材于不同动物及人胚胎或成体的不同部位的血管，按照讨论目的举行挑选。

血管平滑肌细胞分别培养办法较多，主要有簇拥细胞培养法、植块培养法、微血管培养法。

其中植块培养法可得到数量较多的平滑肌细胞而适用于药理讨论。

还可按照讨论需要将分别得到的平滑肌细胞举行蜕变培养、克隆培养、与内皮细胞共培养等。

【材料】 1．动物或人胚胎血管。

2．试剂 0.1%、0.1％,MEM 培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L，10万U/L和l00mg/L）。

Hanks 液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS04·7H20 0.20g, KH2P04 0.06g, NaHC03 0.35g，glucose 1.00g，0.02g)。

3．器皿及仪器细胞培养用器皿，手术器械，净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜等。

【办法】 1．簇拥细胞培养法（酶消化法）无菌术取颈或股动脉，于预冷Hanks液中洗涤3次，认真剥除血管表面结缔组织。

将血管纵向剖开移入另一装有0.1％胶原酶(D-Hanks配制）消化液的平皿中。

37℃消化30分钟后，认真剥离外膜及外层中膜并用小刀片轻轻刮除内膜，Hanks液冲洗后移入另一清洁的盛有消化酶平皿中（或剪成1 mm3组织块碎块，置离心管中）37℃消化2～3小时，时常轻晃，至组织呈絮状，收集细胞悬液并与5倍量含10％新生牛血清的培养基混合，终止消化。

大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【摘要】目的：建立一种可行的原代血管平滑肌细胞（VSMC）培养方法。

方法：严格无菌操作环境下取大鼠胸主动脉及腹主动脉中层组织，通过组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法进行传代，应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察，使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。

结果：原代培养第4~6天时，组织块周围开始有长梭形细胞爬出；第7~9天时，细胞爬出较少的呈网状生长，组织块周围细胞爬出较多的呈漩涡状生长，致密排列呈束状；第10~14天时，细胞呈典型的“峰—谷”样结构，相互融合达80%，此时传代细胞生长速度增快，细胞变大，折光性减弱，免疫荧光染色鉴定可见VSMC特异性的α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）表达，表达的阳性细胞在95%以上。

结论：成功建立一种可行的原代VSMC培养方法。

%Objective:To establish a convenient and efficient method for culturing primary generation of aortic vascular smooth muscle cells( VSMC)of rat. Methods:The aorta was isolated from SD rats under strict sterile conditions. The primary culture and subculture were obtained by tissue-piece inocu-lation and trypsin respectively. The cellular morphology was observed with inverted phase contrast mi-croscope and identified by immunofluorescence. Results:The VSMC grew out on days 4~6 and showed fusiform;On days 7~9,some cells grew to form mesh,and more cells grew in whorled pattern and form compact sarciniform;On days 10~14,cells appeared typical ″peak-valley″ structure,and became nearly 80% integrated. At this time,passage cells grew faster,and cells becamelarger,and their refractivity weakened. The typical α-Smooth muscleactin(α-SM-actin)in SMCS could be found by immunofluorescent staining,and the positive rate of α-SM-actin in SMCS was more than 95%. Conclusion:A reliable and feasible culture method for primary generationof VSMC has been estab-lished successfully.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2017(042)002【总页数】5页(P125-129)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;组织块贴壁法;免疫荧光;大鼠,Sprague-Dawley【作者】刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【作者单位】贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002; 贵州省人民医院心内科，贵州贵阳 550002;贵州医科大学，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R363.1目前，心血管疾病已成为我国城乡居民总死亡原因之首，这类疾病发病的病理生理基础为血管损伤及损伤后的修复不良，主要有冠心病和高血压，但其发病机制至今仍不清楚[1]。