脐动脉血管平滑肌细胞的分离与培养

原代肠系膜动脉平滑肌细胞的分离培养陈琛;阳芳;洪陈亮;杨丽;王珍;李洁;秦旭平【摘要】取大鼠肠系膜动脉,用I型胶原酶消化,并进行体外培养,倒置相差显微镜观察ASMC生长状态及特点;免疫组织化学进行细胞鉴定.大鼠肠系膜平滑肌细胞呈典型“峰-谷”样生长,该原代培养细胞对平滑肌特异性肌动蛋白表达阳性.传代细胞生长稳定,可为研究小血管平滑肌细胞特性提供一个较理想的模型.【期刊名称】《中南医学科学杂志》【年(卷),期】2018(046)002【总页数】5页(P201-205)【关键词】原代培养;肠系膜;动脉平滑肌细胞;大鼠;免疫组化【作者】陈琛;阳芳;洪陈亮;杨丽;王珍;李洁;秦旭平【作者单位】南华大学药物药理研究所血管生物学实验室,湖南衡阳421001;南华大学药物药理研究所血管生物学实验室,湖南衡阳421001;南华大学药物药理研究所血管生物学实验室,湖南衡阳421001;南华大学药物药理研究所血管生物学实验室,湖南衡阳421001;南华大学药物药理研究所血管生物学实验室,湖南衡阳421001;南华大学药物药理研究所血管生物学实验室,湖南衡阳421001;南华大学药物药理研究所血管生物学实验室,湖南衡阳421001【正文语种】中文【中图分类】R544动脉平滑肌细胞(ASMC)在不同的动脉或相同血管床的不同部位以及血管壁的不同层次等存在表型异质性。

细胞表型异质性表现为细胞形态学表型差异、平滑肌细胞特异性蛋白的表达差别和不同的生长能力。

与骨骼肌和心肌细胞不同，ASMC在分化终末时仍保持高度的可塑性，并能从收缩表型向增殖、分泌的表型转变[1]，而后者主要导致血管增长和重构，是血管适应动脉粥样硬化、高血压时病理生理刺激的基本要素[2]。

当血管生长在原代血清培养条件时血管肌细胞发生相似的表型调节。

因此原代培养的动脉平滑肌细胞能为更大范围的在细胞和亚细胞水平为研究细胞反应机理提供有效的模型。

已有相关研究对肠系膜动脉平滑肌细胞进行分离培养，如用组织块培养法[3](但分离纯化时间较长)，胰蛋白酶消化法[4]或多种酶消化法[5]，本研究采用Ⅰ型胶原酶消化分离肠系膜小动脉平滑肌细胞，为阻力血管相关疾病的研究提供可靠且充裕的细胞来源。

维普资讯
第 ４１卷
第 ２期
分 子 细 胞 生 物 学 报
Ｊ ｕ ａ ｆＭｏ ｅ ｕ ａ ｅｌＢ ｏｏ ｙ ｏ ｒ ｌｏ ｌ ｃ ｌ ｒＣ ｌ ｉｌ ｇ ｎ
Ｖ １ ｏ ．４１ ．Ｎｏ２ ．
Ａｐｒｌ ０ ｉ ２ ０８
２ ｏ 年 ４月 ｏ８
现 结 节 中有 大量碱 性磷 酸 酶表 达 。同时 ， 结 节形 成过 程 中伴 随有 大量平 滑肌 细胞 凋 亡 。我们 的研 在
究表 明 ，体 外培养 的脐 动 脉 来源 的平 滑肌 细胞 同主动 脉 来源 的平 滑肌 细胞 一 样 可 以 自发 成 骨细胞
分化 ． 而平 滑肌 细 胞 凋亡 可能 参 与 了该 过 程 。 关键词 ：血 管平 滑肌 细胞 成 骨细胞 分 化 血管 钙化 细胞 培 养 脐动脉
Ｃ Ｄ的主要原 因 ．而动脉 内膜 和 中膜 均发 生钙化 是 Ｖ Ｃ Ｄ患者动脉病变 的典型特征 。血管平 滑肌细胞是 Ｋ 参与动脉病变的主要 细胞成分 ， 的增殖 、 移以及成 它 迁 骨细胞 样分化 后诱导的血 管钙化 参与 了动脉病变的发
Ｑ Ｅ Ｅ培养箱 ； ｉｏ －Ｉ 倒置相差显微 镜 ； ｉｏ ＵＵ Ｎ ｋ ｎＵ Ｉ Ｉ Ｎｋｎ Ｃ ｏ ＰＸ４ ０ 数码相机 ； ５ ｏＬ Ｉ ０ ５ ４ ０型微孔板酶标仪 ； Ｅ Ｃ Ｌ ＩＡ Ｃ Ｏ Ｏ 病理切片机； ｉ ｃ ｉ ６ ０ Ｍ３ ５ Ｓ Ｈ ｔ ｈ － ５ 透射电子显微镜等。 ａ － ７
的 凋 亡现 象 ； 用免 疫 组化 染 色法研 究 了细胞 结节 中碱 性磷 酸 酶的表 达。 用 茜素 红 Ｓ染 色及 透射 采 采 电镜研 究 了脐 动脉 平 滑肌 细胞 的 自发钙 化 。 究发 现 ． 外培 养的脐 动 脉 平滑肌 细 胞传 代后 约 ７天 研 体

平滑肌细胞培养实验步骤解读原代平滑肌细胞培养Protocol实验准备：器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精步骤：1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验；4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。

将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。

用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。

分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中；5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。

冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞；6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。

人主动脉血管平滑肌细胞提取
1. 实验器材准备，准备好所需的培养皿、离心管、各种培养基和消化酶等实验器材。

2. 组织样本获取，从人体捐赠者或手术获取的组织样本中，选择主动脉组织进行提取。

确保样本来源合法，并且符合伦理标准。

3. 组织处理，将主动脉组织迅速转移到无菌的条件下，用生理盐水或其他缓冲液清洗组织，去除血液和杂质。

4. 细胞分离，使用适当的消化酶（如胰酶）对组织进行消化，以分离出平滑肌细胞。

消化时间和酶的浓度需要进行优化，以确保细胞的完整性和纯度。

5. 细胞培养，将分离得到的平滑肌细胞接种到培养皿中，使用适当的培养基进行培养。

培养条件需要控制温度、湿度和二氧化碳浓度等参数。

6. 细胞鉴定，通过形态学观察和特异性标记物的免疫细胞化学染色等方法，对提取得到的细胞进行鉴定，确保其为主动脉平滑肌
细胞。

7. 细胞保存，根据需要，可以将提取得到的细胞进行冻存，以备后续实验使用。

总的来说，人主动脉血管平滑肌细胞的提取是一项复杂的实验技术，需要严格控制实验条件和遵守相关伦理规范。

通过精心设计实验方案和严格执行操作流程，可以获得高质量的细胞样本，为心血管疾病研究提供重要的实验材料。

尚存 在较 远 的距离 【 ６ ０ 】 。要 寻求 经济中 ，尽 快用 磷 酸盐 缓 冲液 反 复 冲
量 的获 取细 胞 的方 法 ， 细胞 来源 最好 是 患 者 自 洗， 去 除脐 带表 面 和脐 静 脉 内淤 血 。用 细绳 结 体， 国外 已有 文 献报 道 ， 但 其 培 养要 求 高 ， 所获 扎 脐 带 一端 ，用 注 射 器 从 脐 静 脉 另 一 端 注 入 细胞 数量 有 限。由于人 脐带 内皮 细胞 和平 滑肌 ０ ． １ ％ Ｉ型胶 原 酶 约 １ ０ ｍＬ ， 再 将 注 液 端 结扎 ， 细胞 来 源 充 足 ， 方 法 与技 术 较 成 熟 可 行 ， 排 异 在 ３ ７℃ 、 体 积 分数 为 ０ ． ０ ５的 ＣＯ 培 养箱 中消 反应 较 轻 ， 是 目前体 外构 建 组织 工 程 血管 种子 化 １ ２ ｍｉ ｎ， 用 注 射器 将 脐 静 脉 内消 化 液抽 出 ， 细胞 的 主要来 源【 １ 佃。 但 血管 内皮 细胞 和平滑 再 加 入 含 ２ ０ ％胎 牛血 清 的 Ｍ１ ９ ９培养 液 终 止 肌 细胞 的提 取 、原 代细 胞 培养扩 增 比较 困难 ， 消化 ， 用培 养液 冲洗脐 静 脉两 次 ， 收 集 消化 液 ， 且 要 获得 高纯 度 的 内皮 细 胞 和平 滑 肌 细胞 必 １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ离 心 １ ０ ｍｉ ｎ ， 弃上 清 ， 磷酸 盐 缓 冲 需解 决成 纤维 细胞 的污染 问题【 １ ４ 】 。
Ｄ 一 ６ ３ ４ ５ ０ ） ； 超净工作台（ 苏 州 宏伟 空 调 净 化 设 备有 限 公司 ） 。
管 支架材料 ， 以 本 实 验 所 培 养 的
人 脐 带 内 皮 细 胞 及 平 滑 肌 细 胞 作 为种 子细胞 ． 联

血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞成分，具有调节血管管径和维持血管壁稳定的重要作用。

血管平滑肌细胞的原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的常用方法之一，同时也是研究血管再生和维修的基础。

1. 材料（1）动物组织：小鼠主动脉、人体脐带血。

（2）DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、0.1%胶原酶、1%抗生素-抗菌素、无菌PBS。

（3）T-25培养瓶、15毫升离心管、1毫升离心管、细胞计数板、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、培养皿等。

2. 方法①用消毒剂清洁手部等操作区域，将小鼠主动脉取出，去除外膜和内膜，将中层切成0.5毫米大小的小块。

②将小鼠主动脉碎片与0.25%胰酶和0.1%胶原酶混合液在37℃下消化3小时。

③将消化液离心，将沉淀用DMEM培养基混合后分装在T-25培养瓶中，添加10%胎牛血清和1%抗生素-抗菌素。

④将培养瓶放置在37℃的细胞培养箱中培养，每天更换一次培养基，至细胞达到80%-90%的密度时进行传代。

①将人脐带血收集入无菌离心管中，用相同容量的PBS混合，离心15分钟，去除上清液。

3. 结果经过数天的培养，小鼠主动脉或人脐带血管平滑肌细胞可在培养瓶中生长形成典型的“山川”式形态，细胞密度逐渐增加。

细胞在培养基中会分泌胶原和纤维蛋白等胶原成分，这些成分有助于维持细胞外基质的稳定性和促进细胞分裂生长。

经过多次传代后，细胞的生长速度将明显加快，并且会逐渐转化为诱导型平滑肌细胞，表达平滑肌肌动蛋白和舒张激肽受体等标记物质。

4. 结论血管平滑肌细胞原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的重要方法。

通过原代培养可以维持细胞的稳定生长，并且可以进行多次传代，以获得更多的细胞，更好地研究细胞功能。

本实验采用小鼠主动脉和人脐带血作为来源，通过胰酶和胶原酶的消化分离获得血管平滑肌细胞，然后进行培养，可得到较为纯净的细胞。

在培养的过程中，需要注意细菌、真菌和病毒的污染，以及细胞的密度和培养基的更换等。

血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是一类组成血管壁的细胞，对调节血管的收缩和扩张起着重要作用。

其原代培养是进行相关功能和分子机制研究的必要手段之一。

本文将从原代培养的优点，培养方法，细胞检测和应用等方面进行介绍。

一、原代培养的优点血管平滑肌细胞原代培养是从组织中分离出血管平滑肌细胞，并在体外环境中进行繁殖和生长的过程。

相比于细胞系，原代培养有以下优点：1.细胞纯度高；2.种群亲缘关系稳定；3.细胞表型稳定；4.研究结果具有可靠性和可比性；5.研究范围广泛。

二、血管平滑肌细胞原代培养的方法血管平滑肌细胞原代培养主要包括以下步骤：1.组织的消化和细胞的分离；2.细胞培养和子培养；3.细胞的验证与鉴定。

1.组织的消化和细胞的分离组织消化是细胞培养基础环节，主要利用一些酶类消化酶溶解组织细胞膜上的蛋白聚糖，使得以上葡萄糖酸、胶原酶等酶能够快速地分离出单个的细胞。

其中，血管平滑肌细胞的消化方式一般有两种：机械法和消化法。

机械法是使用刀片或振荡器等器械将组织切碎，并筛选出合适的细胞；消化法则是将组织切成小块，利用酶类溶解器，如胰蛋白酶、胶原酶等消化液，将细胞释放出来。

2.细胞培养和子培养细胞培养是指将原代培养得到的细胞在适切的培养条件下持续维持生长状态的过程，包括培养基的配制、细胞的分离和接种、试验原理与评价、细胞状态的维持以及检测鉴定等一系列过程。

此过程需注意的问题有细胞的密度、培养时间、细胞饱和度及细胞的分裂活性等。

3.细胞的验证与鉴定细胞原代培养过程中，细胞的鉴定与验证能够大致分为两个方面：构象和分子水平。

其中包括细胞表型的检测与鉴定、细胞的生长状态，如细胞生长曲线、生长速率以及细胞周期等标定，以及细胞的弹性、细胞结构性质等重要参数的检测。

三、血管平滑肌细胞原代培养的应用血管平滑肌细胞原代培养的应用范围较广，除了常见的药理学实验外，主要应用于以下方面：1.血管病理生理研究方面血管平滑肌细胞在血管病理生理研究中发挥着重要作用。

肌细胞 （ Ｓ ＭＣ ｓ ） ， 应用荧光光漂 白恢复技术 （ Ｆ Ｒ Ａ Ｐ ） 测 定血 管 Ｅ Ｃ ｓ 、 Ｓ ＭＣ ｓ 之 间的缝 隙连 接通讯 （ Ｇ Ｊ Ｉ Ｃ ） 功
能 。方法 ： 人脐动脉 Ｅ Ｃ ｓ 、 Ｓ ＭＣ ｓ 分 离培养 ， Ⅷ 因子 和 Ｓ Ｍ ｏ ｔ － ａ ｃ ｔ ｉ ｎ 相关抗 原鉴定 Ｅ Ｃ ｓ 和Ｓ ＭＣ ｓ ， 应用 Ｆ Ｒ Ａ Ｐ技 术测定血管 内皮细胞 、 平滑肌细胞之 间的 Ｇ Ｊ Ｉ ｃ功能 ， 记 录实 时成像结果 ， 应用动态 比（ Ｍ） 计算漂 白区域 内标记荧光 的分子 中动态分子 的 比例。结果 ： 第一组 Ｅ Ｃ ｓ 和Ｓ ＭＣ ｓ 单独培养 ， 选 择漂 白细胞 与周围至少 ３个 同种细胞相连接 ， Ｓ ＭＣ ｓ 被漂 白后平均 Ｍ 值为 ３ １ ． ７ ９± ５ ． ６ ９ ； Ｅ Ｃ ｓ 被漂 白后平均 Ｍ值为 ２ ３ ． ４ ３± ２ ． １ １ ； 第 二组 Ｅ Ｃ ｓ和 Ｓ ＭＣ ｓ混合培 养 ， 选择 Ｅ Ｃ ｓ和 Ｓ ＭＣ ｓ独立 相连 的 ２个 细胞 ， Ｓ ＭＣ ｓ 被 漂 白后 平均 Ｍ 值 为 １ ４ ． ４ ７± ３ ． ２ ８ ， Ｅ Ｃ ｓ 被漂 白后平 均 Ｍ值为 ６ ． ４ １ ４ － ０ ． ８ ０ 。结论 ： Ｆ Ｒ Ａ Ｐ实时动态恢 复曲线 可直 接观察 荧光恢 复强度及速度 ， 参照 Ｆ Ｒ Ａ Ｐ恢复 曲线 ， Ｍ 值可 做为组 间 Ｇ Ｊ Ｉ ｃ比较相对 定量 的可靠 指标 ， 通 过检 测证 实 Ｅ Ｃ ｓ 和Ｓ ＭＣ ｓ 之问存在 Ｇ Ｊ Ｉ ｃ ， 且荧光 由 Ｅ Ｃ ｓ 向Ｓ ＭＣ ｓ 方向的传递大于 由 Ｓ ＭＣ ｓ 向Ｅ Ｃ ｓ 方 向的传递 。 ［ 关键词 ］ 荧 光光漂 白恢复技术 ；缝隙连接通讯 ； 人 脐带动脉 ；内皮细胞 ；平滑肌细胞 【 中图分 类号］ １ １ ５ ４ ［ 文献标识码］ Ａ ［ 文章 编号］ １ ０ ０ ７ － ５ ０ ６ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ － ５ ０ ３ － ０ ４

兔血管平滑肌细胞原代培养我是某医学院的硕士研究生，课题涉及到兔血管平滑肌细胞的原代培养，实验开始非常不顺利，进行了几次实验均一无所获。

后来我在丁香园上发帖提问（/bbs/topic/16215850?tpg=1&ppg=1&age=0#0），得到了丁香园网友的热情帮助，在网友的帮助下，经过不断尝试改进，最后我终于得到了想要的血管平滑肌细胞，完成了实验并顺利毕业。

鉴于网上还有很多网友在提有关血管平滑肌细胞原代培养的问题，我现在将自己的毕业论文中细胞培养的部分共享，由于论文还没发表，部分图片不能公开，请见谅！欢迎转载。

①DMEM培养基的配制：在新购进的500ml DMEM/F12培养基内加入5ml双抗及适当比例的FBS(原代20%，3代后5%)，配制成完全培养基，4℃保存备用。

②兔SVMCs的原代培养：体重2kg～3kg的雄性日本大耳白兔，耳缘静脉注射空气栓塞处死后，置于操作台。

从腹部切开，分离腹部血管，暴露腹主动脉，无菌条件下切下约5cm长的动脉，装入含双抗的PBS中备用。

在超净台内将取材的血管在DMEM中漂洗数次，小心将外膜剥去，用双抗浸泡数分钟后，直接加入胰酶，在胰酶双抗混合液中用眼科剪将组织块剪碎，将双抗和胰酶混合后用1ml移液枪吸去，加入3ml培养基,用吸管吹打后将组织块和培养液吸入25cm2细胞培养瓶中，直接用移液器将液体大部分吸出，盖紧瓶口后瓶口向上竖立放入培养箱，约1.5h后加入DMEM/F12培养基(含20%FBS, 1%双抗)，每个培养瓶约2.0ml，缓慢将瓶身翻转，使培养基覆盖组织块，将瓶口拧松，放入CO2养箱，静置3d～4d观察。

这是手术中的图片，上面灰白的那根是腹主动脉。

这是超净台里剥开了一半的血管，要的是上面这部分，下面的是血管外膜及筋膜等，丢弃这是剪碎了的组织块，泡胰酶和泡双抗都是这么泡，后期我做的时侯比这个剪得还要碎:这是剪好后放到培养箱里的图片，瓶口向上立着的两瓶是我的。

血管平滑肌细胞分离及培养血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管中膜的主要细胞成分。

具有增殖、迁移、合成并释放细胞基质的能力，在血管性疾病的发生进展中有重要作用。

目前已了解到血管平滑肌细胞的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成形术后再狭窄等的主要病理表现。

利用体外培养血管平滑肌细胞可了解其正常和病态生物学特性及机制。

体外培养血管平滑肌细胞举行药物药理学方面的讨论。

体外培养血管平滑肌细胞可取材于不同动物及人胚胎或成体的不同部位的血管，按照讨论目的举行挑选。

血管平滑肌细胞分别培养办法较多，主要有簇拥细胞培养法、植块培养法、微血管培养法。

其中植块培养法可得到数量较多的平滑肌细胞而适用于药理讨论。

还可按照讨论需要将分别得到的平滑肌细胞举行蜕变培养、克隆培养、与内皮细胞共培养等。

【材料】 1．动物或人胚胎血管。

2．试剂 0.1%、0.1％,MEM 培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L，10万U/L和l00mg/L）。

Hanks 液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS04·7H20 0.20g, KH2P04 0.06g, NaHC03 0.35g，glucose 1.00g，0.02g)。

3．器皿及仪器细胞培养用器皿，手术器械，净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜等。

【办法】 1．簇拥细胞培养法（酶消化法）无菌术取颈或股动脉，于预冷Hanks液中洗涤3次，认真剥除血管表面结缔组织。

将血管纵向剖开移入另一装有0.1％胶原酶(D-Hanks配制）消化液的平皿中。

37℃消化30分钟后，认真剥离外膜及外层中膜并用小刀片轻轻刮除内膜，Hanks液冲洗后移入另一清洁的盛有消化酶平皿中（或剪成1 mm3组织块碎块，置离心管中）37℃消化2～3小时，时常轻晃，至组织呈絮状，收集细胞悬液并与5倍量含10％新生牛血清的培养基混合，终止消化。

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1 细胞培养1.1.1 培养液配制DMEM(美国Gibco公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,美国Hyclone)。

1.1.2 培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3 大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4 原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。

医学论文：胎儿脐动脉血管平滑肌细胞贴块培养方法的改进:动脉平滑肌医学论文：胎儿脐动脉血管平滑肌细胞贴块培养方法的改进【摘要】目的探讨胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的培养方法。

方法取无菌新鲜健康孕妇胎儿脐动脉，采用组织贴块法培养血管平滑肌细胞，并用αactin肌动蛋白免疫组化方法对培养的细胞进行鉴定。

结果运用此方法成功地培养出胎儿脐动脉血管平滑肌细胞，培养的细胞呈典型的“峰谷”样生长特性，用抗平滑肌α肌动蛋白(αactin)的单克隆抗体做免疫组化检测，低倍镜下可见细胞普遍呈阳性反应，高倍镜下可见αactin肌动蛋白在胞浆内均匀分布。

结论此方法取材容易，操作简单，费用低廉，为人动脉血管平滑肌细胞的培养提供了一种实用、可靠的方法。

【关键词】脐动脉；平滑肌细胞；细胞培养【Abstract】 Objective To explore the culture techniques of fetus umbilical artery vascular smooth muscle cells. Methods The human vascular smooth muscle cells were cultivated using the fetus umbilical artery by the explant attached method in vitro, and identified by immunohistochemical methods. Results The fetus umbilical artery vascular smooth muscle cells were cultured successfully by using the method. The cells grew into the typical hill valley characteristic They were identified by immunohistochemical methods of anti αactin, it proved that all cells almost were vascular smooth muscle cells.Conclusion This method is easy, convenient and cheap. It provides a useful and reliable method for culture of human vascular smooth muscle cells. 【Key words】umbilical artery,smooth muscle cell,cells culture 动脉血管平滑肌细胞的体外培养始于20世纪70年代，由Ross［1］和Chamley［2］用组织贴块法培养成功。