血管平滑肌细胞的培养及鉴定

酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞目的：采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞，为血管疾病，特别是为动脉粥样硬化研究提供大量的原代平滑肌细胞。

方法：无菌取老龄SD大鼠主动脉，0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离细胞，采用自然纯化、差速贴壁纯化平滑肌细胞，免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白。

结果：免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上。

结论：酶消化法分离获取SD大鼠平滑肌细胞方法简单，易掌握，采用本方法可稳定获得大量的平滑肌细胞供实验使用。

[Abstract] Objective: To investigate the method of culture aged Sprague-Dawley(SD) rat vascular smooth cells (VSMCs) through enzyme digestion for supplies larges amounts of primary cells for vascular diseases. Methods: VSMCs were isolated from aged SD rat thoracic aortas by enzyme digestion and cultured with the technique of differential anchoring velocity. The expression of α-SMA was dected by immunocytochemistry. Results: Immunohischemistry revealed that the purity of VSMCs exceeded 95%. Conclusion: VSMCs can be gained easily by enzyme digestion in vitro. This method can supply larges amounts of VSMCs for scientific research and experimentation.[Key words] Smooth muscle cells; Enzymatic isolation method; Immunohistochemical staining; α-actin随着对心血管疾病，特别是动脉粥样硬化研究的进一步深入，提供稳定、大量的老龄大鼠血管平滑肌细胞是进行这些研究的基本保证。

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。

方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。

结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。

结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。

【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed bymodified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。

1100Human Brain Vascular Smooth Muscle Cells人脑血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞是许多动脉疾病的细胞水平的根源。

血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素。

最新研究表明血管平滑肌细胞表达的ICAM-1 和VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关.人血管平滑肌细胞的体外培养是血管研究中的重要模型，并将对血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息.细胞培养说明注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。

将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。

经过以下步骤后开始培养细胞1.准备多聚赖氨酸包被的培养瓶(2μg/cm2，推荐用T-75的培养瓶)。

向T-75瓶内加入10ml 无菌水，然后加入15μl多聚赖氨酸原液(10mg/ml,ScienCell cat. no. 0413).将培养瓶放入培养箱中过夜(至少在37°C中过一小时)2.准备完全培养基：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。

在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。

用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。

3.用无菌水冲洗多聚赖氨酸包被的培养瓶两次并向瓶内加入20 ml完全培养基。

将培养瓶放入超净台中，然后融化细胞。

4. .将小瓶放入37°C水浴中，轻轻地握住并旋转小瓶直到完全融化。

将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。

小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面。

用1ml eppendorf吸管轻轻重悬管内容物。

5.将管中内含物放入均匀的，多聚赖氨酸包被的培养瓶中。

推荐接种密度为5,000 cells/cm2。

注意：细胞融化后不推荐稀释和离心，因为这些操作比培养基中DMSO残留物对细胞的伤害大。

血管平滑肌细胞接种在多聚赖氨酸包被的培养瓶中能促进细胞帖壁。

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定段超　陈鑫　邱志兵　许欢 【摘要】　目的　探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。

方法　采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。

结果　85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。

台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。

镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的“谷峰状”生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。

结论　正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。

【关键词】　大鼠;血管平滑肌细胞;原代培养;组织贴块法P r i m a r y c u l t u r e a n di d e n t i f i c a t i o no f r a t t h o r a c i ca o r t av a s c u l a rs m o o t hmu s c l ec e l l s D U A NC h a o ,C H E N X i n ,Q I UZ h i -b i n g ,X UH u a n .　D e p a r t m e n t o f C a r d i o t h o r a c i c S u r g e r y ,N a n j i n g F i r s t H o s p i t a l A f f i l i a t e dt oN a n j i n gM e d i c a l U -n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210006,C h i n a【A b s t r a c t 】　O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h e p r i m a r y c u l t u r e m e t h o d o f r a t t h o r a c i c a o r t a v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s (V S M C s ),t o a n a l y z ec e l l g r o w t h a n d b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n dt o p r o v i d e t e s t m a t e r i a l f o r t h e r e s e a r c ho f t h ep r o l i f e r a t i o n o f t h e v a s c u l a r d i s e a s e s .Me t h o d s T h e c u l t u r eo f r a t t h o r a c i c a o r t av a s c u l a r s m o o t h m u c l ec e l l s w a s d o n eb yt i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n .T h e c u l t u r e dc e l l s w e r e o b -s e r v e d a n d i d e n t i f i e d b y m o r p h o l o g y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w i t hp h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p ea n di m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s p e c -t i v e l y .T h e c e l l v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e dw i t h T y p a nb l u e .R e s u l t s 85%i n o c u l a t e d t i s s u e p i e c e s s u r v i v e d .P r i m a r y c u l t u r e d c e l l s c o u l d b e s u b c u l t u r e da f t e r 2w e e k s a n d s u c c e s s f u l l y p a s s a g e df o r m o r e t h a n 8t i m e s ,w i t h o u t n o t i c e a b l e c h a n g e s i nm o r p h o l o g y a n dg r o w t h c h a r a c t e r -i s t i c s .T h e p u r i t y o f t h e s i x t hp a s s a g e V S M C s w a sm o r et h a n 97%.T h ec e l l v i a b i l i t yw a s m o r et h a n 94%b yt r y p a nb l u e .T h ec u l t u r e d V S M C s s h o w e dt h e t y p i c a l “p e a ka n dv a l l e y ”m o r p h o l o g i c a l a p p e a r a n c e u n d e r m i c r o s c o p e .I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n gw i t ha n t i b o d y a -g a i n s t S M -α-a c t i n d e m o n s t r a t e d t h e s e c e l l s w e r e p o s i t i v e .C o n c l u s i o n T h e m e t h o d o f t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n c u l t u r e o f V S M C s i s s i m p l e ,e c o n o m i c a n de f f i c i e n t .I t p r o v i d e s a ni d e a l c e l l m o d e l f o r t h e r e s e a r c ho f t h e p r o l i f e r a t i o no f v a s c u l a r d i s e a s e s .【K e yw o r d s 】　r a t ;v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l ;p r i m a r yc u l t u r e ;t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n作者单位:210006　江苏南京,南京医科大学附属南京第一医院心胸外科 血管平滑肌细胞(v a s c u l a r s m o o t hm u s c l ec e l l s ,V S M C s )的增殖和迁移是血管增殖性疾病发病的核心环节,其病理学分子机制是近年来血管增殖性疾病的研究热点,也是目前防治的难点[1]。

脐动脉血管平滑肌细胞的分离与培养材料1) 培养基和维持平滑肌细胞生长的溶液a) 培养基: DMEM /F12b) 基本培养基的添加剂(final concentrations):100 U/mL penicillin,100 µg/mL streptomycin10% (v/v) FBS.通常消毒冷冻储备。

完全培养基4°C可达1 个月，常规细胞培养使用前预温到37°C。

分离过程用无FBS 的培养基。

c) Hanks’平衡盐溶液(HBSS, Sigma)：用于组织标本的收集培养基。

下面的添加剂在使用之前加入储备液中(final concentrations):100 µg/mL Gentamicin0.025 M HEPES20 mM bicarbonate0.001% phenol redHBSS 可分装储存于4°C最多2周。

d) Bicarbonate (4.4%, 0.52 M)-Phenol red (0.03%) solution:44 g NaHCO3 +30 mg phenol red in 1000 mL组织培养级的去离子水,高压灭菌消毒10 min at 115°C.15 mL分装4°C储存可达6 mo，2 aliquots used in 400 mL of medium.2)Penicillin and streptomycin stock solution (80X concentrate):480 mg penicillin+1.5g streptomycin sulfate in 200 mL组织培养级的去离子水0.5 µm滤膜预过滤，0.22 µm滤膜过滤消毒。

5 mL分装，–20°C储存，1 aliquot used in 400 mL of medium.3)Gentamicin solution (80X concentrate):750 mg gentamicin sulfate in 100 mL组织培养级的去离子水0.22 µm滤膜过滤消毒。

丁香园心肌细胞和平滑肌细胞的鉴定全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：心肌细胞是构成心脏肌肉的细胞，是一种自发性搏动的细胞。

在正常情况下，心肌细胞会以一定的顺序和频率收缩和舒张，从而推动心脏的血液循环功能。

而平滑肌细胞则是一种在动脉、支气管、胃肠道等器官中常见的细胞类型，具有收缩和舒张的能力。

在临床诊断中，正确地鉴定心肌细胞和平滑肌细胞对于诊断心脏病变和其他疾病至关重要。

一种常用的方法是通过形态学鉴定心肌细胞和平滑肌细胞。

心肌细胞通常具有分枝状的形态，细胞之间紧密相连，形成心脏的肌肉组织。

在显微镜下观察，心肌细胞的形态呈现出横纹和跨棒状，并具有明显的跨膜结构。

而平滑肌细胞则呈现出较为细长的形态，没有明显的横纹结构，且细胞之间独立存在，不像心肌细胞那样相互连接。

除了形态学特征外，心肌细胞和平滑肌细胞在功能上也有所不同。

心肌细胞具有自律性和传导性，能够自发性产生动作电位并传导至周围细胞，从而协调心脏的收缩和舒张。

而平滑肌细胞则主要负责器官的收缩和舒张功能，如血管的收缩和支气管的舒张等。

在实验室的研究中，可以通过记录细胞的电位变化和对不同药物的反应来鉴定心肌细胞和平滑肌细胞。

分子生物学技术也可以帮助鉴定心肌细胞和平滑肌细胞。

心肌细胞通常会表达心脏特异基因，如肌动蛋白、心肌肌钙蛋白等。

而平滑肌细胞则会表达平滑肌标志基因，如α-平滑肌肌动蛋白、α-平滑肌肌球蛋白等。

通过PCR、Western blot等技术可以检测这些基因的表达水平，从而鉴定心肌细胞和平滑肌细胞的身份。

正确地鉴定心肌细胞和平滑肌细胞对于临床诊断和治疗具有重要意义。

通过形态学、功能性和分子生物学的方法，可以准确地鉴定这两种细胞类型，为疾病的诊断和治疗提供科学依据。

丁香园将继续关注并推动心肌细胞和平滑肌细胞的研究，为医疗健康事业做出贡献。

第二篇示例：在医学领域，心肌细胞和平滑肌细胞是两种重要的细胞类型，它们在人体内发挥着不同的功能和作用。

在临床诊断和研究中，对心肌细胞和平滑肌细胞的鉴定十分重要，可以帮助医生诊断疾病、制定治疗方案，提高患者的生存率和生活质量。

[1] 。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。

在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。

本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。

1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。

动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。

DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。

转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。

放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1细胞培养1.1.1培养液配制DMEM(美国Corning Cellgro公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲胎牛血清)。

1.1.2培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。

大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的原代培养及鉴定敖锋;张自力;宋健【摘要】Objective To investigate the primary culture and identification of the smooth muscle cel s (SMC)from the medial of vascu-lar wal inrats.Methods SMC from the medial of vascular wal were cultured by modified tissue culture.The cel ular morphology was observed under inverted phase contrast microscope.SMC were isolated and identified with immunofluorescence.Results SMC were isolated successful y and cultured.The cel s had a typical peak val ey like growth,and showed fusiform.The positive rate of cel s i-dentified with immunofluorescence were more than 95%.Conclusion The modified tissue culture can isolateand cultivate SMC with high purity and good activity under in vitro conditions with simple,reliable method.%目的：探讨一种方便、快捷、大量原代培养大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的方法,为心血管疾病的体外研究提供可靠的实验材料。

方法利用改良的组织贴块法进行血管壁中膜平滑肌细胞原代培养,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,并用免疫荧光染色鉴定分离培养的细胞。

兔血管平滑肌细胞原代培养我是某医学院的硕士研究生，课题涉及到兔血管平滑肌细胞的原代培养，实验开始非常不顺利，进行了几次实验均一无所获。

后来我在丁香园上发帖提问（/bbs/topic/16215850?tpg=1&ppg=1&age=0#0），得到了丁香园网友的热情帮助，在网友的帮助下，经过不断尝试改进，最后我终于得到了想要的血管平滑肌细胞，完成了实验并顺利毕业。

鉴于网上还有很多网友在提有关血管平滑肌细胞原代培养的问题，我现在将自己的毕业论文中细胞培养的部分共享，由于论文还没发表，部分图片不能公开，请见谅！欢迎转载。

①DMEM培养基的配制：在新购进的500ml DMEM/F12培养基内加入5ml双抗及适当比例的FBS(原代20%，3代后5%)，配制成完全培养基，4℃保存备用。

②兔SVMCs的原代培养：体重2kg～3kg的雄性日本大耳白兔，耳缘静脉注射空气栓塞处死后，置于操作台。

从腹部切开，分离腹部血管，暴露腹主动脉，无菌条件下切下约5cm长的动脉，装入含双抗的PBS中备用。

在超净台内将取材的血管在DMEM中漂洗数次，小心将外膜剥去，用双抗浸泡数分钟后，直接加入胰酶，在胰酶双抗混合液中用眼科剪将组织块剪碎，将双抗和胰酶混合后用1ml移液枪吸去，加入3ml培养基,用吸管吹打后将组织块和培养液吸入25cm2细胞培养瓶中，直接用移液器将液体大部分吸出，盖紧瓶口后瓶口向上竖立放入培养箱，约1.5h后加入DMEM/F12培养基(含20%FBS, 1%双抗)，每个培养瓶约2.0ml，缓慢将瓶身翻转，使培养基覆盖组织块，将瓶口拧松，放入CO2养箱，静置3d～4d观察。

这是手术中的图片，上面灰白的那根是腹主动脉。

这是超净台里剥开了一半的血管，要的是上面这部分，下面的是血管外膜及筋膜等，丢弃这是剪碎了的组织块，泡胰酶和泡双抗都是这么泡，后期我做的时侯比这个剪得还要碎:这是剪好后放到培养箱里的图片，瓶口向上立着的两瓶是我的。

血管平滑肌细胞分离及培养血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管中膜的主要细胞成分。

具有增殖、迁移、合成并释放细胞基质的能力，在血管性疾病的发生进展中有重要作用。

目前已了解到血管平滑肌细胞的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成形术后再狭窄等的主要病理表现。

利用体外培养血管平滑肌细胞可了解其正常和病态生物学特性及机制。

体外培养血管平滑肌细胞举行药物药理学方面的讨论。

体外培养血管平滑肌细胞可取材于不同动物及人胚胎或成体的不同部位的血管，按照讨论目的举行挑选。

血管平滑肌细胞分别培养办法较多，主要有簇拥细胞培养法、植块培养法、微血管培养法。

其中植块培养法可得到数量较多的平滑肌细胞而适用于药理讨论。

还可按照讨论需要将分别得到的平滑肌细胞举行蜕变培养、克隆培养、与内皮细胞共培养等。

【材料】 1．动物或人胚胎血管。

2．试剂 0.1%、0.1％,MEM 培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L，10万U/L和l00mg/L）。

Hanks 液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS04·7H20 0.20g, KH2P04 0.06g, NaHC03 0.35g，glucose 1.00g，0.02g)。

3．器皿及仪器细胞培养用器皿，手术器械，净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜等。

【办法】 1．簇拥细胞培养法（酶消化法）无菌术取颈或股动脉，于预冷Hanks液中洗涤3次，认真剥除血管表面结缔组织。

将血管纵向剖开移入另一装有0.1％胶原酶(D-Hanks配制）消化液的平皿中。

37℃消化30分钟后，认真剥离外膜及外层中膜并用小刀片轻轻刮除内膜，Hanks液冲洗后移入另一清洁的盛有消化酶平皿中（或剪成1 mm3组织块碎块，置离心管中）37℃消化2～3小时，时常轻晃，至组织呈絮状，收集细胞悬液并与5倍量含10％新生牛血清的培养基混合，终止消化。

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1 细胞培养1.1.1 培养液配制DMEM(美国Gibco公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,美国Hyclone)。

1.1.2 培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3 大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4 原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。

大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【摘要】目的：建立一种可行的原代血管平滑肌细胞（VSMC）培养方法。

方法：严格无菌操作环境下取大鼠胸主动脉及腹主动脉中层组织，通过组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法进行传代，应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察，使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。

结果：原代培养第4~6天时，组织块周围开始有长梭形细胞爬出；第7~9天时，细胞爬出较少的呈网状生长，组织块周围细胞爬出较多的呈漩涡状生长，致密排列呈束状；第10~14天时，细胞呈典型的“峰—谷”样结构，相互融合达80%，此时传代细胞生长速度增快，细胞变大，折光性减弱，免疫荧光染色鉴定可见VSMC特异性的α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）表达，表达的阳性细胞在95%以上。

结论：成功建立一种可行的原代VSMC培养方法。

%Objective:To establish a convenient and efficient method for culturing primary generation of aortic vascular smooth muscle cells( VSMC)of rat. Methods:The aorta was isolated from SD rats under strict sterile conditions. The primary culture and subculture were obtained by tissue-piece inocu-lation and trypsin respectively. The cellular morphology was observed with inverted phase contrast mi-croscope and identified by immunofluorescence. Results:The VSMC grew out on days 4~6 and showed fusiform;On days 7~9,some cells grew to form mesh,and more cells grew in whorled pattern and form compact sarciniform;On days 10~14,cells appeared typical ″peak-valley″ structure,and became nearly 80% integrated. At this time,passage cells grew faster,and cells becamelarger,and their refractivity weakened. The typical α-Smooth muscleactin(α-SM-actin)in SMCS could be found by immunofluorescent staining,and the positive rate of α-SM-actin in SMCS was more than 95%. Conclusion:A reliable and feasible culture method for primary generationof VSMC has been estab-lished successfully.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2017(042)002【总页数】5页(P125-129)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;组织块贴壁法;免疫荧光;大鼠,Sprague-Dawley【作者】刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【作者单位】贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002; 贵州省人民医院心内科，贵州贵阳 550002;贵州医科大学，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R363.1目前，心血管疾病已成为我国城乡居民总死亡原因之首，这类疾病发病的病理生理基础为血管损伤及损伤后的修复不良，主要有冠心病和高血压，但其发病机制至今仍不清楚[1]。

东南大学学报（医学版）J Southeast Univ（Med Sci Edi）2011，Aug；30（4）：537-540mice［J］．Nature，1994，367（6464）：645-648．［4］BHATIA M，BONNET D，MURDOCH B，et al．A newly discov-ered class of human hematopoietic cells with SCID-repopulat-ing activity［J］．Nat Med，1998，4（9）：1009-1010．［5］LUCIA R V，DARIO G L，EMANUELA P，et al．Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells［J］．Na-ture，2007，445：111-115．［6］SWAMINATHAN S K，OLIN M R，FORSTER C L，et al．Iden-tification of a novel monoclonal antibody recognizing CD133［J］．Elsevier BV，2010，361（1-2）：110-115．［7］唐权，窦骏，顾宁．癌干细胞研究现状［J］．东南大学学报：医学版，2005，24（4），276-279．［8］SHMELKOV S V，st CLAIR R，LYDEN D，et al．AC133/ CD133/Prominin-1［J］．Int Biochem Cell Biol，2005，37（4）：715-719．［9］KOV S V，JUN L，st CLAIR R，et al．Alternative promoters reg-ulate transcription of the gene that encodes stem cell surface protein AC133［J］．Blood，2004，103（6）：2055-2061．［收稿日期］2011-02-18［修回日期］2011-03-15［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81070571）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2009279）［作者简介］刘晶（1985-），女，湖北随州人，在读硕士研究生。

血管平滑肌细胞的鉴定一、血管平滑肌细胞的背景说到血管平滑肌细胞，大家可能会想：“什么东西啊？这名字这么长，是不是又是个难懂的生物学术语？”别担心，放轻松，咱们先来解个锁，搞懂这事。

血管平滑肌细胞其实是咱们身体中血管壁里的“忠诚卫士”，在咱们的动脉和静脉里，肩负着非常重要的任务。

它们的任务不大，不小，不紧不慢，就好像咱们平时要时不时地停下来拉拉筋，活动活动，不然身体就容易累。

血管平滑肌细胞也类似，它们能够让血管壁随时舒展或收缩，调节血液流动的速度，保证血液流得又快又稳。

要是它们出了问题，血管的弹性和功能就会受影响，这就像是汽车轮胎突然没气了，可能会导致一系列的麻烦，最常见的就是高血压，甚至其他心血管疾病。

血管平滑肌细胞的工作真不是一般的“辛苦”，它们既不显山露水，却默默为咱们的身体健康保驾护航。

二、1.如何鉴定血管平滑肌细胞你说，咱们既然这么依赖这些细胞，那怎么知道它们到底是不是血管平滑肌细胞呢？其实也不难！在科学家们的眼中，血管平滑肌细胞有它自己的一套“身份证”，你知道吧，它们能通过一些特殊的标志来证明自己的身份。

举个例子，血管平滑肌细胞会表达一些特定的蛋白质，比如平滑肌肌动蛋白（αSMA）。

这个蛋白一出现，就说明“这个细胞是我没错！”科学家们通过在组织样本上做一些染色实验，看看细胞里有没有这种蛋白，就能判断它是不是血管平滑肌细胞。

就像侦探破案，找到了“凶手”的指纹一样，科学家也能通过这种方法，精准识别出血管平滑肌细胞。

2.使用免疫组化的方法想了解血管平滑肌细胞是不是在咱们的血管中发挥作用，免疫组化法绝对少不了。

这玩意儿可不简单，得用到一些很神奇的抗体。

这些抗体就像是血管平滑肌细胞的“探照灯”，能够把那些有特殊蛋白质的地方照得明晃晃，哪怕它藏得再深再隐秘。

免疫组化方法的关键就是“高精尖”的抗体，咱们可以通过它们精确地定位到血管平滑肌细胞的位置，看看它们是不是按时到岗，工作到位。

3.基因表达分析除开染色和免疫组化，基因分析也能帮咱们识别血管平滑肌细胞。