平滑肌细胞培养实验步骤

小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备徐丽华;严金川;伍超;逯朝阳;王中群;袁伟【摘要】目的:建立一种简单、高效的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)原代培养方法及体外钙化模型.方法:采用改良的组织贴块法培养小鼠VSMCs,经免疫荧光染色法鉴定后,将细胞随机分为对照组和钙化组.采用yon kossa染色及比色法检测两组细胞内钙含量.结果:培养3～5d时,可见细胞从组织块边缘爬出,7～10d后细胞融合成片;免疫荧光染色显示胞质表达特异性α-肌动蛋白;VSMCs培养至第2代细胞纯度达95％;与对照组相比,钙化组细胞的钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性明显增加(P均＜0.05).结论:改良的组织贴块法可获得高纯度的小鼠VSMCs;β-甘油磷酸钠在体外可有效诱导其钙化.%Objective:To establish a simple and efficient method for primary culture of mouse aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) and calcification model in vitro.Methods:The primary VSMCs were harvested by modified tissue-piece inoculation and identified by immunocytochemistry.The established VSMCs were randomly divided into control group and calcification group.Calcification of cells was assayed by von kossa staining and colorimetry method.Results:VSMCs migrated from explants of mouse aorta tissue after 3-5 days of culture.After 7-10 days,VSMCs grew to form a fusing monolayer.Immunofluorescence staining with specific mAb against mouse α-actin demonstrated VSMCs were positive.The cell purity of the 2nd generation of VSMCs was over 95％.Compared with the control group,the calcium content and ALP activity in the calcification group were increased significantly (both P ＜0.05).Conclusion:The method of modified explant-culture successfully established a effective model for primary culture of VSMCs,of which calcification in vitro could be induced by β-glycerophosphate.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(024)002【总页数】4页(P110-113)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;钙化【作者】徐丽华;严金川;伍超;逯朝阳;王中群;袁伟【作者单位】江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001【正文语种】中文【中图分类】R543血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁的重要组成部分，通过协调血管收缩和舒张，控制血管压力和流速。

巨噬细胞平滑肌细胞共培养
巨噬细胞平滑肌细胞共培养是一种体外细胞培养技术，用于研究巨噬细胞和平滑肌细胞之间的相互作用以及相关生物学过程。

在共培养中，巨噬细胞和平滑肌细胞被培养在同一培养皿中，它们之间可以通过分泌细胞因子、细胞间接触以及其他途径相互作用。

这种相互作用可以模拟体内情况，帮助科学家更好地理解细胞间相互作用的机制。

巨噬细胞平滑肌细胞共培养可用于研究多种生物学过程，包括炎症反应、血管平滑肌细胞增生、血管收缩和松弛、血栓形成等。

该技术也被广泛用于筛选药物、评估药效和研发新的治疗方法。

总之，巨噬细胞平滑肌细胞共培养是一种有用的实验技术，可以帮助科学家更好地了解细胞间相互作用的机制，为疾病的预防和治疗提供理论基础。

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离体小肠平滑肌生理特性实验报告一、实验目的1、学习哺乳动物离体器官灌流的实验方法。

2、观察和分析小肠平滑肌的生理特性，包括自动节律性、兴奋性、收缩性以及对各种刺激的反应。

二、实验原理小肠平滑肌具有自动节律性收缩的特性，其收缩活动受到神经、体液以及化学物质等多种因素的调节。

离体小肠平滑肌在适宜的环境中仍能保持其生理特性，通过给予不同的刺激，可以观察到小肠平滑肌的相应反应。

三、实验材料1、实验动物：＿____2、实验器材：恒温平滑肌槽、张力换能器、生物信号采集处理系统、手术器械、氧气袋等。

3、实验药品：台氏液、乙酰胆碱、肾上腺素、阿托品、HCl 溶液等。

四、实验步骤1、制备离体小肠平滑肌标本击昏实验动物，迅速剖开腹腔，取出一段小肠，置于盛有台氏液的培养皿中。

小心去除肠系膜和脂肪组织，将小肠剪成 2-3cm 的小段。

选取肠管平滑肌活性良好的部分，两端用线结扎，制成肠管标本。

2、安装实验装置将肠管标本一端固定在浴槽底部的固定钩上，另一端连接张力换能器，并将张力换能器与生物信号采集处理系统相连。

向浴槽中加入适量台氏液，保持恒温 37℃，并持续通入氧气。

3、观察小肠平滑肌的自动节律性收缩启动生物信号采集处理系统，记录小肠平滑肌的收缩曲线，观察其自动节律性。

4、观察小肠平滑肌对化学物质的反应向浴槽中依次滴加乙酰胆碱、肾上腺素、阿托品等药物，观察小肠平滑肌收缩曲线的变化。

5、观察小肠平滑肌对酸、碱刺激的反应向浴槽中滴加适量 HCl 溶液，观察小肠平滑肌的反应；随后用台氏液冲洗，待收缩恢复正常后，再滴加适量NaOH 溶液，观察其反应。

6、观察小肠平滑肌对温度刺激的反应升高或降低浴槽内台氏液的温度，观察小肠平滑肌收缩曲线的变化。

五、实验结果1、自动节律性收缩小肠平滑肌在台氏液中能够自发地、节律性地产生收缩和舒张活动，收缩曲线呈现一定的周期性。

2、对化学物质的反应滴加乙酰胆碱后，小肠平滑肌收缩幅度明显增大，收缩频率加快，表现为兴奋作用。

小肠平滑肌试验报告一、实验目的了解小肠平滑肌的收缩和松弛机制。

二、实验原理三、实验材料和方法材料：小白鼠、显微镜、小刷子方法：1.分离小鼠小肠：将小鼠剖腹，取出小肠并放入含生理盐水的培养皿中。

2.清除黏液：用小刷子沿小肠轻轻刷去黏液。

3.选择一段小鼠小肠，用显微镜观察其平滑肌。

4.直接刺激：用细针刺激小肠平滑肌，观察其收缩和松弛情况。

5.药物作用：加入不同的药物，如乙酰胆碱、肾上腺素等，观察其对小肠平滑肌的作用。

四、实验结果1.内源性调节：(1)神经调节：刺激平滑肌可以引起其收缩或松弛。

(2)内分泌调节：刺激平滑肌可以引起其收缩或松弛。

(3)自主调节：平滑肌具有自发性收缩和松弛的能力。

2.外源性调节：(1)乙酰胆碱：加入乙酰胆碱后，小肠平滑肌明显收缩。

(2)肾上腺素：加入肾上腺素后，小肠平滑肌开始松弛。

五、实验讨论1.神经调节主要通过神经末梢释放乙酰胆碱或去甲肾上腺素等神经递质来调节小肠平滑肌的收缩和松弛。

2.内分泌调节是通过内分泌物质的分泌来调节小肠平滑肌的收缩和松弛。

3.自主调节是指小肠平滑肌具有自发性收缩和松弛的能力，与细胞内钙离子浓度的变化有关。

4.乙酰胆碱作为一种神经递质，可以通过刺激乙酰胆碱受体，引起小肠平滑肌的收缩。

5.肾上腺素作为一种神经递质，可以通过刺激肾上腺素受体，引起小肠平滑肌的松弛。

六、实验结论小肠平滑肌的收缩和松弛机制主要通过内源性和外源性调节实现。

内源性调节包括神经调节、内分泌调节和自主调节；外源性调节主要是药物的作用。

乙酰胆碱可以引起小肠平滑肌收缩，肾上腺素可以引起小肠平滑肌松弛。

这些调节机制对于小肠正常消化和排泄功能的维持具有重要意义。

七、实验心得通过本次实验，我对小肠平滑肌的调节机制有了更深入的了解。

同时，我也学会了使用显微镜观察和操作小肠平滑肌。

这个实验对我的实验技巧和实验思维能力提升有着积极的影响。

未来我将继续学习相关知识，深入研究平滑肌的调节机制，为进一步探索相关领域做好准备。

胃肠道平滑肌细胞培养及鉴定高静;徐晓霞;陈平【摘要】胃肠道平滑肌原代细胞培养基本保留了体内生长特性,作为一种体外研究模型,在生理学、病理学、胃肠动力学和药物代谢动力学等较多研究领域显示出细胞株所不具备的优越性.本文就胃肠道平滑肌原代细胞的分离、培养、纯化和鉴定方法方面进行了综述,为研究消化系统疾病培养胃肠道平滑肌细胞方法的选择提供参考.【期刊名称】《哈尔滨医药》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】3页(P185-187)【关键词】胃肠道平滑肌细胞;分离;培养;纯化;鉴定【作者】高静;徐晓霞;陈平【作者单位】内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010;内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010;内蒙古医科大学附属医院消化内科,内蒙古呼和浩特 010010【正文语种】中文【中图分类】R573胃肠道平滑肌组织在人和动物体内分布广泛，是构成人体消化道的重要空腔脏器，通过收缩蠕动来协助器官的功能发挥。

胃肠道平滑肌原代细胞由于刚刚从活体组织分离出来，生物学特性还未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，可反映出体内生长的一般性质，适合用于胃肠动力学、运动调节机制及药物研究等[1]。

但由于获得胃肠道原代细胞的过程较复杂、培养困难，使得原代细胞还不能成为实验材料的首选对象。

原代细胞是否培养成功主要与细胞的分离、培养方法有关，因此有效分离原代细胞并保持其相应的生物学特性，找到适合其生长的环境尤为重要。

胃肠道平滑肌细胞培养主要来自于SD乳鼠、小鼠、大鼠、豚鼠及家兔等，取材前务必将实验动物禁食12 h以上（未进食的可直接用于实验），分离材料时应在手术显微镜或解剖显微镜下进行，以达到分离完全的目的，分离后应用4℃含双抗（青霉素，链霉素）的PBS液反复冲洗，直至组织块发白，再用不含血清的培养基冲洗1～2遍，将洗好的组织剪成1～2mm3大小组织块，在剪碎的过程中要保持湿润，最好使用不含血清的培养基，使用的刀剪尽量锋利，预防对组织的撕拉等造成损伤，应尽量缩短取材的时间。

离体小肠平滑肌运动实验报告离体小肠平滑肌生理特性实验报告人体机能学实验报告离体小肠平滑肌肌的生理特性实验结果：实验讨论：1、我们可以看到小肠从17℃转移到38℃的台氏液中，小肠平滑肌的收缩幅度、基线上移和频率增加，产生上述的主要原因是：小肠肠管的台氏液温度以38℃~40℃为宜，低于或高于这个温度，都会影响结果。

由于小肠管平滑肌对温度改变极为敏感，当温度降到30℃以下时，故代谢水平的降低，兴奋性减弱，可出现收缩曲线基线下移，频率变慢，收缩幅度变小。

2、在浴槽中加入乙酰胆碱后，可见离体肠管活动增强，幅度增加。

出现上述现象的机理，目前认为乙酰胆碱可与肌膜上的M受体结合，使得两类通道开放：一类为电位敏感性Ca2+专用通道，另一类为特异性受体活化Ca2+ 专用通道。

前一类通道对Ach敏感，小剂量Ach即引起开放；后一类通道对Ach相对不敏感，只有大剂量Ach才会引起开放。

这两类通道开放都使得肌浆中Ca2+增高，进而激活肌纤蛋白—肌凝蛋白—ATP系统，使平滑肌收缩，肌张力增加。

3、在浴槽标本管中加入阿品托溶液，2分钟后再加入乙酰胆碱（Ach ），发现小肠管张力和收缩力没有明显的变化，原因是阿托品是乙酰胆碱阻断剂，使乙酰胆碱的作用消失。

故加入乙酰胆碱后没有作用。

所以两者都加入观察到曲线无明显变化。

4、在浴槽中加入肾上腺素后，可见离体肠管活动减弱，描记曲线出现收缩频率变慢，幅度减小以及基线下移。

出现上述现象的机理，目前认为与肠肌细胞膜上存在α和β两中受体，α受体又分为α抑制型受体和α兴奋型受体有关。

肾上腺素作用于α抑制型受体，引起肠肌膜上一种特异性受体活化，使K+外流增多，细胞膜发生超极化，肠肌兴奋性降低，肌张力下降。

同时，肾上腺素还作用于β受体，①它的激活引起肠肌细胞膜中的cAMP合成增多，cAMP激活肠肌膜及肌浆网上Ca2+泵活动，使肌浆中Ca2+浓度降低，亦使肌张力降低；②β受体激活后还促使K+及Ca2+外流增加，加速膜的超极化，促进了肠肌肌张力的减低。

血管内皮细胞一平滑肌细胞共培养体系研究进展血管内皮细胞(endothelial cells, EC)和血管平滑肌细胞(smooth muscle cells, VSMC)的相互作用、相互影响维持血管生理功能和多种疾病的发生发展, EC-SMC联合培养模型是U前研究这2种细胞间相互影响的最佳方式。

作者对现有的EGSMC 共培养模型及共培养对这2种细胞结构和功能的影响进行综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据，也为建立更接近机体生理/病理状态的EC-SMC体外共培养体系提供参考。

标签：内皮细胞；平滑肌细胞；共培养；相互作用血管内皮细胞(endothelial cells, EC )和血管平滑肌细胞(smooth muscle cells, VSMC)是构成血管壁的主要细胞成分，2种细胞间的相互作用、相互影响是维持血管生理功能和血管壁自身结构稳定的关键，在病理条件下EC和SMC的相互作用同样可影响多种疾病的发生发展。

EC-SMC联合培养模型是忖前研究这2 种细胞间相互影响的最佳方式，对研究动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发病机制、血管壁生理及炎症反应等有重要意义。

本文就H前EC-SMC共培养模型和共培养模式下2种细胞的互相影响做一综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据。

1 EC-SMC共培养模型1」直接接触的共培养模式早在20世纪80年代，国外学者就开始尝试建立EC-SMC共培养的方法。

早期研究简单地将EC和SMC按一定的比例混合，种植在同一体系中，2种细胞能够混合生长，且相邻的EC和SMC之间形成连接［1］。

此模型较为原始，细胞混杂，EC和SMC没有形成生理状态下的结构层次，且2种细胞之间干扰较大。

在此基础之上，Davies等［2］引进了微载体技术, 即将2种细胞分别种植于微载体上，然后将微载体混合于同一体系，实验中相邻的微载体上同型或异型细胞间都形成接触连接。

组织块法培养兔主动脉平滑肌细胞（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：王青青, 李伟宏,常志杰，焦金菊【摘要】目的探讨培养兔主动脉平滑肌细胞的方法,为心血管疾病的病因机制研究提供有用的体外模型。

方法采用组织块贴壁、反转干涸方法培养兔主动脉平滑肌细胞并传代。

倒置显微镜下进行形态学观察及免疫细胞化学鉴定。

结果成功培养兔血管平滑肌细胞并传代。

倒置显微镜下细胞呈典型的“峰-谷”状。

免疫细胞化学染色呈棕黄色，均呈阳性表达，胞浆内可见纵行排列肌丝。

结论利用组织块贴壁、反转干涸方法成功进行兔主动脉平滑肌细胞原代培养, 具有简便易行、培养周期短、纯度高等优点,是心血管疾病良好的体外研究模型。

【关键词】血管平滑肌细胞; 原代培养; 兔Abstrct:Objective To discuss the method for primary culture of rabbit arterial smooth muscle cells.To provide useful vitro model for the etiopathogenisis of cardiac vascular diseases. Methods Rabbit arterial smooth muscle cells were cultured with tissue explants adherent and back to roll depletive method and could bepassaged.The form of rabbit arterial smooth muscle cells were observed under inverted phase contrast microscope and were identified with the method of immunocytochemistry. Results Rabbit arterial smooth muscle cells were cultured successfully with tissue explants adherent and back to roll depletive method and could be passaged.Under inverted phase contrast microscope,the growth of the cells showed a typical hill-and-vally pattern.After immunocytochemistry staining,all the cells cytoplasm were stained and positive.Lots of stained buffy actin filament bundles were observed in cell cytoplasm. Conclusions The culture techenique of tissue explants adherent method has the advantages of easy to operate, high efficiency to obtain VSMCs in a shorter cycle time, high purity and so on.They are good vitro model of cardiac vascular diseases.Key words:VSMCs;primary culture;rabbit近年来，越来越多的证据表明血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells ,VSMCs)增殖在冠状动脉粥样硬化、高血压病等疾病的发生发展中起重要作用。

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。

方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。

结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。

传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。

结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。

【关键词】气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，具有重要的生理作用。

ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。

Hirst等[2]认为应将平滑肌细胞作为研究哮喘的标靶。

体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。

本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如下。

1 材料和方法1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。

饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。

1.2 主要仪器和试剂倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

人主动脉平滑肌细胞提取步骤提取人主动脉平滑肌细胞（HASMC）通常涉及以下几个步骤：1.取材与预处理：取得新鲜的人体胸主动脉组织，通常来自手术切除或其他医学程序中获得的废弃标本，并迅速放入含冰的Hanks液或其他生理盐水溶液中以维持组织活性并减少酶活性。

2.组织清洗与分离：1)在无菌条件下，将动脉移至冰上进行操作。

2)使用解剖剪和手术刀片沿着血管长轴方向剪开主动脉。

3)用手术刀片轻轻刮除内皮细胞层，以获取不含内皮细胞的中膜组织。

3.酶消化与组织分散：1)将分离出的中膜组织切成适当大小的片段（约1 cm²），然后将其置于含有胰蛋白酶和EDTA混合液的酶消化液中。

2)将此组织块放置在恒温振荡器中，在37°C下进行消化，时间根据组织情况调整，一般为45分钟至1小时左右，直至观察到组织变透明、结构松散。

3)定时检查消化程度，一旦达到适宜的消化状态（细胞开始脱离组织块），立即停止酶消化。

4.终止消化与洗涤：1)用含Ca2+、Mg2+的HBSS或无钙镁的PBS溶液冲洗中止酶的作用。

2)将分离出的细胞继续剪碎，转移到6孔板内加入复合酶液进行二次消化，期间适时轻微摇动培养皿促进细胞释放。

3)当细胞开始游离出来后，加入含有较高血清浓度（如10% FBS）的平滑肌细胞培养基终止消化过程。

5.细胞收集与纯化：1)将消化后的细胞悬浮液通过低速离心（如800-1000 rpm，几分钟）来沉淀细胞。

2)去除上清液，将细胞沉淀重悬于新鲜的平滑肌细胞培养基中。

3)过滤或使用移液管吹打混匀去除未消化的组织碎片，将细胞悬液接种到预处理过的培养皿或培养瓶中。

6.细胞培养：1)将细胞置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养。

2)观察细胞贴壁及生长情况，当细胞汇合度到达一定程度时，根据需要进行传代或冻存。

以上步骤是基于实验室常规方法的一般流程，具体细节可能因实验条件和研究需求的不同而有所变化。