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原代培养：清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。
一般4~7天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，2~3周出现致密细胞层。
待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。
细胞传代：将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。
弃掉清洗液，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为2~4 min。
这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。
在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。
然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。
然后根据细胞密度, 以1: 2~4分瓶培养。
每2~3天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为7~10天)再传代。
hpsusan2006 wrote:我们培养血管平滑肌采用的也是组织块法，尝试想用消化酶消化老养不成，但组织块法从组织块爬出细胞挺费时间，要好几个礼拜，一旦细胞传代后速度就快了，方法和上面说的差不多（北国木棉）但是我们胰酶浓度用的0.2％的，可供大家参考，还用双抗液用的浓度100U/ml。
下面是一张组织块周围爬出的细胞。
我现在的方法是组织块法，效果还是理想的。
就我的经验而言，一般5－7天细胞就可以从组织中爬出来了。
但是那些一开始取材时就游离出来的细胞倒是最快长成集落（一般3到4天）。
有几点我个人的经验：1.取材要熟练，尽量缩短时间，如果可以把从取材到铺瓶的时间缩短到15分钟以内，那么最终的成功率会比较高。
时间拖得越长，最终的细胞长出来的时间越是慢甚至最后会失败。
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。
方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。
结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。
结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。
【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed bymodified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。
1．大鼠PASMCs的提取和原代培养(1)提取：对雄性SD大鼠用5％的水合氯醛经腹腔麻醉后，浸泡在75％的乙醇中5 rain。
将麻醉后的大鼠在超净工作台中固定好，无菌操作下迅速分离出心肺组织，置于盛有含有1％青链霉素的PBS培养皿中。
转移至无菌操作台中，漂洗心肺组织数次，眼科镊仔细剥离出肺动脉(包括肺动脉主干和左右肺动脉干)。
将已分离出的肺动脉用含1％青链霉素的HBSS冲洗数次，直至液体清亮为止，以尽量减少血细胞等的混入。
眼科剪纵向剪开肺动脉，内膜面朝上，用刀片来回轻刮2～3遍，去除内膜。
再将外膜面翻转过来，同样方法刮去外膜。
将中膜转移至盛有含20％胎牛血清的DMEM／F12的培养基中，用眼科剪反复剪成1 am×l mm×1 mm 的小组织块。
用滴管将小组织块转移至25T的培养瓶中，均匀的摆放与于瓶底，间距约0．5 cm。
加入3 mL含20％胎牛血清的DMEM／F12培养液，瓶底朝上，静置于37 oC、5％CO，的细胞培养箱巾孵育4～5 h。
待小组织块干涸后，轻翻转培养瓶，让培养液慢慢浸润瓶底上的小组织块，继续静置于培养箱中培养。
(2)原代培养：3—5 d后，有少量细胞从组织块周围游离出来；8—10 d后细胞融合成片，成峰．谷状分布，用胰酶消化传代。
一般2—3 d更换培养液，提取PASMCs 时用含20％胎牛血清的DMEM／F12，培养时用含15％胎牛血清的DMEM／F12。
采用生长状态良好的3～5代细胞进行后续实验。
取材、细胞原代及传代培养SD 大鼠肌注氯胺酮（22 mg / kg）麻醉后，作下腹部横切口，切取双侧输精管。
剥去外膜组织，小圆刀片刮除内膜，4 C PBS缓冲液（含青霉素100 U/ mI、链霉素100#g / mI）反复漂洗4 ~ 6遍，然后剪碎成1 mm3 大小的组织块。
先用0.1%的"型胶原酶消化作用10 min，倒去上清液，再加0.2% 的胰蛋白酶和0.1%的"型胶原酶消化20 min，使游离成单个细胞，600 > ! 离心5 min，收集消化的细胞，接种至25 cm2 培养瓶，加含20%胎牛血清的DMEM 培养液，置37 C含5%CO2孵箱中培养。
尼古丁对大鼠主动脉平滑肌细胞舒缩功能的影响刘继斌;秦小江;岳晗;伊淑贤;侯晓敏【摘要】目的:观察尼古丁对大鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)舒缩功能的影响.方法:体外培养大鼠原代主动脉VSMCs.用不同浓度尼古丁对大鼠主动脉VSMCs干预24 h后,用罗丹明-鬼笔环肽染细胞骨架,拍摄不同实验组的照片,通过测量不同细胞表面积的大小来反映细胞收缩水平;用胶原收缩法观察不同浓度的尼古丁对大鼠VSMCs收缩功能影响.结果:原代大鼠主动脉VSMCs被成功培养.用不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L)尼古丁处理VSMCs 24 h后,其骨架呈现显著收缩,细胞板状化明显增强,且呈浓度依赖性关系;10μmol/L为尼古丁对VSMCs的最适刺激浓度(P<0.01).胶原收缩法也显示,10μmol/L尼古丁对大鼠主动脉VSMCs有收缩作用,随着作用时间的增加,其收缩效应逐渐增强,作用60 min收缩作用最显著(P<0.01).结论:尼古丁对大鼠主动脉VSMCs具有较强收缩作用,其收缩作用具有浓度依赖性和时间依赖性.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2019(035)006【总页数】5页(P1142-1145,1152)【关键词】尼古丁;主动脉;血管平滑肌细胞;收缩功能【作者】刘继斌;秦小江;岳晗;伊淑贤;侯晓敏【作者单位】山西医科大学教务处,山西太原 030001;山西医科大学公共卫生学院,山西太原 030001;山西医科大学公共卫生学院,山西太原 030001;山西医科大学公共卫生学院,山西太原 030001;山西医科大学基础医学院,山西太原 030001【正文语种】中文【中图分类】R329.2+5;R541.9吸烟是加速心脑血管疾病发生的重要危险因素之一。
流行病学和实验研究表明，吸烟可增加机体炎症水平，导致高血压、脑血栓和动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生[1-3]。
[1] 。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。
在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。
本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。
1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。
动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。
DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。
转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。
放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。
血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞成分，具有调节血管管径和维持血管壁稳定的重要作用。
血管平滑肌细胞的原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的常用方法之一，同时也是研究血管再生和维修的基础。
1. 材料（1）动物组织：小鼠主动脉、人体脐带血。
（2）DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、0.1%胶原酶、1%抗生素-抗菌素、无菌PBS。
（3）T-25培养瓶、15毫升离心管、1毫升离心管、细胞计数板、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、培养皿等。
2. 方法①用消毒剂清洁手部等操作区域，将小鼠主动脉取出，去除外膜和内膜，将中层切成0.5毫米大小的小块。
②将小鼠主动脉碎片与0.25%胰酶和0.1%胶原酶混合液在37℃下消化3小时。
③将消化液离心，将沉淀用DMEM培养基混合后分装在T-25培养瓶中，添加10%胎牛血清和1%抗生素-抗菌素。
④将培养瓶放置在37℃的细胞培养箱中培养，每天更换一次培养基，至细胞达到80%-90%的密度时进行传代。
①将人脐带血收集入无菌离心管中，用相同容量的PBS混合，离心15分钟，去除上清液。
3. 结果经过数天的培养，小鼠主动脉或人脐带血管平滑肌细胞可在培养瓶中生长形成典型的“山川”式形态，细胞密度逐渐增加。
细胞在培养基中会分泌胶原和纤维蛋白等胶原成分，这些成分有助于维持细胞外基质的稳定性和促进细胞分裂生长。
经过多次传代后，细胞的生长速度将明显加快，并且会逐渐转化为诱导型平滑肌细胞，表达平滑肌肌动蛋白和舒张激肽受体等标记物质。
4. 结论血管平滑肌细胞原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的重要方法。
通过原代培养可以维持细胞的稳定生长，并且可以进行多次传代，以获得更多的细胞，更好地研究细胞功能。
本实验采用小鼠主动脉和人脐带血作为来源，通过胰酶和胶原酶的消化分离获得血管平滑肌细胞，然后进行培养，可得到较为纯净的细胞。
在培养的过程中，需要注意细菌、真菌和病毒的污染，以及细胞的密度和培养基的更换等。
01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1细胞培养1.1.1培养液配制DMEM(美国Corning Cellgro公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲胎牛血清)。
1.1.2培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。
1.1.3大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。
动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。
每次取材2~3只大鼠。
贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。
纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。
用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。
滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。
并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。
盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。
待有细胞从组织块周围游出后换液。
1.1.4原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。
加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。
血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是一类组成血管壁的细胞，对调节血管的收缩和扩张起着重要作用。
其原代培养是进行相关功能和分子机制研究的必要手段之一。
本文将从原代培养的优点，培养方法，细胞检测和应用等方面进行介绍。
一、原代培养的优点血管平滑肌细胞原代培养是从组织中分离出血管平滑肌细胞，并在体外环境中进行繁殖和生长的过程。
相比于细胞系，原代培养有以下优点：1.细胞纯度高；2.种群亲缘关系稳定；3.细胞表型稳定；4.研究结果具有可靠性和可比性；5.研究范围广泛。
二、血管平滑肌细胞原代培养的方法血管平滑肌细胞原代培养主要包括以下步骤：1.组织的消化和细胞的分离；2.细胞培养和子培养；3.细胞的验证与鉴定。
1.组织的消化和细胞的分离组织消化是细胞培养基础环节，主要利用一些酶类消化酶溶解组织细胞膜上的蛋白聚糖，使得以上葡萄糖酸、胶原酶等酶能够快速地分离出单个的细胞。
其中，血管平滑肌细胞的消化方式一般有两种：机械法和消化法。
机械法是使用刀片或振荡器等器械将组织切碎，并筛选出合适的细胞；消化法则是将组织切成小块，利用酶类溶解器，如胰蛋白酶、胶原酶等消化液，将细胞释放出来。
2.细胞培养和子培养细胞培养是指将原代培养得到的细胞在适切的培养条件下持续维持生长状态的过程，包括培养基的配制、细胞的分离和接种、试验原理与评价、细胞状态的维持以及检测鉴定等一系列过程。
此过程需注意的问题有细胞的密度、培养时间、细胞饱和度及细胞的分裂活性等。
3.细胞的验证与鉴定细胞原代培养过程中，细胞的鉴定与验证能够大致分为两个方面：构象和分子水平。
其中包括细胞表型的检测与鉴定、细胞的生长状态，如细胞生长曲线、生长速率以及细胞周期等标定，以及细胞的弹性、细胞结构性质等重要参数的检测。
三、血管平滑肌细胞原代培养的应用血管平滑肌细胞原代培养的应用范围较广，除了常见的药理学实验外，主要应用于以下方面：1.血管病理生理研究方面血管平滑肌细胞在血管病理生理研究中发挥着重要作用。
改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。
方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。
结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。
传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。
结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。
【关键词】气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，具有重要的生理作用。
ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。
Hirst等[2]认为应将平滑肌细胞作为研究哮喘的标靶。
体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。
本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如下。
1 材料和方法1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。
饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。
1.2 主要仪器和试剂倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。
大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【摘要】目的：建立一种可行的原代血管平滑肌细胞（VSMC）培养方法。
方法：严格无菌操作环境下取大鼠胸主动脉及腹主动脉中层组织，通过组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法进行传代，应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察，使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。
结果：原代培养第4~6天时，组织块周围开始有长梭形细胞爬出；第7~9天时，细胞爬出较少的呈网状生长，组织块周围细胞爬出较多的呈漩涡状生长，致密排列呈束状；第10~14天时，细胞呈典型的“峰—谷”样结构，相互融合达80%，此时传代细胞生长速度增快，细胞变大，折光性减弱，免疫荧光染色鉴定可见VSMC特异性的α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）表达，表达的阳性细胞在95%以上。
结论：成功建立一种可行的原代VSMC培养方法。
%Objective:To establish a convenient and efficient method for culturing primary generation of aortic vascular smooth muscle cells( VSMC)of rat. Methods:The aorta was isolated from SD rats under strict sterile conditions. The primary culture and subculture were obtained by tissue-piece inocu-lation and trypsin respectively. The cellular morphology was observed with inverted phase contrast mi-croscope and identified by immunofluorescence. Results:The VSMC grew out on days 4~6 and showed fusiform;On days 7~9,some cells grew to form mesh,and more cells grew in whorled pattern and form compact sarciniform;On days 10~14,cells appeared typical ″peak-valley″ structure,and became nearly 80% integrated. At this time,passage cells grew faster,and cells becamelarger,and their refractivity weakened. The typical α-Smooth muscleactin(α-SM-actin)in SMCS could be found by immunofluorescent staining,and the positive rate of α-SM-actin in SMCS was more than 95%. Conclusion:A reliable and feasible culture method for primary generationof VSMC has been estab-lished successfully.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2017(042)002【总页数】5页(P125-129)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;组织块贴壁法;免疫荧光;大鼠,Sprague-Dawley【作者】刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【作者单位】贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002; 贵州省人民医院心内科，贵州贵阳 550002;贵州医科大学，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R363.1目前，心血管疾病已成为我国城乡居民总死亡原因之首，这类疾病发病的病理生理基础为血管损伤及损伤后的修复不良，主要有冠心病和高血压，但其发病机制至今仍不清楚[1]。
