组织工程研究中关于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的培养

关于兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立作者：潘勇艾玉峰张琳西熊猛【关键词】血管平滑肌细胞关键词: 血管平滑肌细胞;三维培养;细胞培养/方法摘要:目的观察兔血管平滑肌细胞（VSMCS ）在三维培养系统中的生物学特性. 方法在兔主动脉中膜来源的VSM-CS 单层培养系统的基础上，将VSMCS 培养在胶原凝胶中，形成VSMCS 三维培养系统.并对细胞的形态结构、生长增殖及其影响因素进行研究. 结果①三维培养VSMCS 在凝胶形成后3～4h，形成多个细胞突起，呈星状.后继续伸展，呈梭形、纺锤形.②张力条件下，三维培养VSMCS 可呈一定的方向性排列.③三维培养VSMCS 与经典的单层培养相比，细胞活力无统计学差异.但细胞增殖受到一定程度的抑制. 结论运用VSMCS 三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态结构、生长增殖等方面，还可研究在张力条件下的细胞生物学特征，对组织工程化血管的研究将产生积极的影响.Keywords:vascular smooth muscle cell;three-dimensional culture;cell culture/methodsAbstract:AIM To study the biologic characteristics of rab-bit vascular smooth muscle cell（VSMCS ）cultured in“three-dimensional”cell culture system.METHODS Based on the monolayer cell culture system，we resuspended VSMCS de-rived from the media of arterial wall in a solution of polymer-izing collagen to develop a“three-dimensional”cell culture system.In this system，we studied the morphology，growth，proliferation and metabolism of VSMCS ，and the shape and arrangement of VSMC influenced by retraction of thesub┐strate.RESULTS ①After VSMCS were cultured in“three-dimensional”cell culture system for3～4hours，they formed many cell prominences.With cells extending，the shape of the cells changed from star to shuttle or spindle.②Under the conditio n of tension，VSMCS cultured in“three-dimensional”cell culture system took ondirectionally specific arrange-ment.③In contrast to the monolayer cell culture system，the livingness of VSMCS cultured in“three-dimensional”cell cul-ture system had no statistical difference，but collagen re-strained cell proliferation.CONCLUSION VSMCS “three-di-mensional”culture system will have a positive effect on the study oftissue-engineering vessel.0 引言血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCS ）位于动脉壁中膜，它对管壁的完整性和调节血管的紧张性起着重要作用.在经典的单层培养系统中，VSMCS 离开了在体内与细胞外基质共同构成的三维立体生长环境，因而所表现出的生物学特性与在体状态存在较大的差异.我们在VSMCS 单层培养的基础上，将兔主动脉VSMCS 置于胶原凝胶中，使其在体外与细胞外基质形成一个整体，观察其在三维状态下的生物学特征，为构造结构和功能与在体血管中膜相似的中膜组织，最终形成组织工程化血管提供实验依据.1 材料和方法1.1 VSMCS 培养 VSMCS 来自新西兰大耳白雄性家兔，体质量2.0～2.5kg（由本校实验动物中心提供）.30～40mg・kg-1 戊巴比妥钠静脉麻醉后，在无菌条件下，迅速将主动脉自胸腔取出，放入盛有D-Hanks液的平皿中.清洗凝血块，剥除外膜，将血管翻转使内膜面朝外，用刀片自上而下刮1～2遍，去除血管内皮细胞.然后用显微镊撕下血管中膜的平滑肌层，用显微剪将其剪碎（0.5～1mm3 ），接种于培养瓶中，在950mL・L-1 空气，50mL・L-1 二氧化碳，37℃，饱和湿度条件下放置2.5～3h，使组织块较牢固地粘附于瓶壁，加入含200mL・L-1 新生牛血清（Hyclone公司）的DMEM（Dulbecco’s modified minimal essential medium，Gibco公司）培养液，3～4d更换含100mL・L-1 新生牛血清的DMEM培养液1次.细胞生长形成致密单层时，细胞呈典型的峰-谷样表现（Fig1）.此时可用1.25g・L-1 胰蛋白酶（Sigma公司）消化，按1∶2比例分种传代培养，5～6d可继续分种传代1次.VSMCS 行α-激动蛋白抗体（中山公司）SABC法免疫组化染色鉴定（Fig2）.实验采用第2～4代细胞进行研究.1.2 胶原制备［1］实验所用胶原溶液为可溶性鼠尾腱胶原，其主要成分为I 型胶原.将体质量200～250g的SD大鼠尾部剪下，浸入70mL・L-1 乙醇溶液中，20min后在无菌条件下抽出尾腱并将其剪碎，置入0.5mL・L-1 的醋酸溶液中（约150mL/尾），在4℃条件下不时搅拌.48h后离心（10000r・min-1 ，11000g，LG10-2.4A，北京医用离心机厂）约1.5h，去渣.上清液用100g・L-1 NaCl溶液盐析，最后将沉淀的蛋白质溶于4℃1mmol・L-1 的HCl溶液中备用.Lowry法测定蛋白浓度为4g・L-1 .1.3 VSMCS 三维培养系统的建立［2］将第2～4代指数生长期VSMCS 用1.25g・L-1 胰蛋白酶消化，调整细胞悬液浓度为5×109 个・L-1 .按细胞悬液2V∶新生牛血清1V∶5×DMEM液2V∶胶原溶液5V的比例，4℃条件下将四种成分快速混匀，加入数滴1mol・L-1 NaOH调pH值至中性（培养液中酚红指示），形成VSMCS -胶原混悬液，并立即将该混悬液移入6孔培养板（Nunc公司）内，0.5mL/孔，置37℃培养箱内10min，混悬液即形成凝胶状，即VSMCS 三维培养系统.每孔加入2mL含100mL・L-1 新生牛血清的DMEM液，3d换液1次.1.4 观察指标①细胞形态学观察:在含VSMCS 凝胶块形成后4，12，24，48，72h和1wk时，在倒置显微镜下观察凝胶块中VSMCS 形态学的改变.将培养24h的凝胶块经30mL・L-1 戊二醛原位固定、脱水、干燥、喷金行S-2700型扫描电镜（HITACHI公司，西安交通大学电镜室）观察.②张力条件下的细胞形态学改变:在上述的VSMCS 三维培养24h后，用无菌注射器针尖轻轻将凝胶块与培养皿的周边部分分离，使胶原收缩并漂浮在培养液中，保持凝胶块的中心部分在整个培养过程中都贴附在培养皿的底部.在倒置显微镜下观察张力条件下凝胶块中VSMCS 形态学变化.③活细胞染色及细胞计数:将用MTT（四甲基偶氮唑，Gibco公司）配成的染液适量滴入培养液中，4h后，MTT被细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶还原成难溶性的蓝紫色结晶物，沉积在细胞内或细胞周围，使活细胞显蓝黑色，而死亡细胞则不着色.在倒置显微镜下逐个计数细胞，并以活细胞的百分率表示细胞活力（即每视野100个细胞的活细胞数）.胶原凝块用细菌胶原酶（4g・L-1 ，Sigma公司）消化成细胞悬液，用血球计数板在镜下行细胞计数.④统计学分析:所得资料应用t检验进行比较分析.2 结果2.1 三维培养的VSMCS 形态含VSMCS 的胶原网形成时呈透明状态，凝胶化后变得不透明，并形成可被握持的凝胶块，粘附在培养皿的底部及四壁上.在倒置相差显微镜下，可清楚地看到各个层次的细胞及其形态.VSMCS 在凝胶中的位置固定，并分布于不同的层次，说明此时VSMCS 已经粘附在胶原支架上.约3～4h，呈圆形的VSMCS 表面逐渐伸展延长，形成多个胞质突起，呈星状（Fig3），表明VSMCS 已开始与胶原纤维发生粘着.扫描电镜下可见VSMCS 的胞质突起粘附在呈无续网状分布的胶原丝上（Fig4）.随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈现梭形、纺锤形（Fig5）. 2.2 张力作用下的细胞形态学改变在凝胶与培养皿壁分离前，细胞生长无一定的方向性.当凝胶与培养皿壁分离时，凝胶块发生收缩，方向朝向中心部，在分离的瞬间，VSMCS 的胞质突起消失.随着时间的延长，细胞又逐渐出现胞质突起，但周边漂浮的凝胶块中的VSMCS 与贴附于器皿底的凝胶块中心中的细胞出现了不同的形态:周边部细胞以梭形、纺锤形，呈同心圆环状生长（Fig6）;中心部细胞生长与分离前无大的差异.伴随凝胶块的收缩，两部位的平滑肌细胞均变得愈加致密.有时互相交织呈网络.2.3 细胞的活力与增殖 VSMCS 在胶原形成的基质中培养10d后，观察细胞的形态学改变和细胞计数结果表明:胶原凝胶中细胞数无增加.说明在三维培养系统中，VSMCS 并未出现增殖现象.同时MTT染色结果表明:三维培养的VSMCS 能够保持足够的活力（86±5，n=10）.与10d前接种当日（90±3，n=10）相比较，细胞活力无显著性差异.3 讨论VSMCS 的体外培养始于20世纪70年代［3］ .它将血管中膜的VSMCS 从体内复杂的影响因素中分离，并置于一定控制因素的直接作用下，连续、直接地观察和研究活细胞的形态结构、细胞活动、生长增殖、物质代谢及其影响因素.然而，单层培养系统中的细胞呈二维方式生长，VSMCS 脱离了在活体状态下与细胞外基质共同构成的连续整体.近年来，大量研究表明，细胞外基质不仅在维持组织结构方面发挥重要作用，而且具有重要的生物学特性.细胞与细胞外基质相互依存，相互作用，才能维持细胞的正常形态，进行正常的代谢，增殖、分化、迁移及信号传递［4］ .因此，将VSMCS 培养在胶原这种细胞外基质成分中，使之构成一个整体，在模拟活体血管组织的环境中表达各种生物学特性，使体外研究结果能更加真实地反映体内情况，结果也必定具有更为重要的参考价值.图1 －图6 略胶原是细胞外基质最基本的结构，它以支架形式为细胞和其他细胞外基质成分提供结合部位.鼠尾腱胶原在结构和抗原性方面与人体组织的I型胶原基本相同，它的来源广泛，成分较为单一，制备较方便，VSMCS 在该基质中能长时间地保持活力，故被选用作为培养基质.VSMCS 的形态学变化充分反应了细胞与胶原纤维相互作用的过程.在早期，由于纤维排列的多向性，VSMCS 的胞质沿纤维运动并产生多向性突起，使细胞呈星状.随着两者的相互作用，纤维发生改构，其排列逐渐由多向性转变为单向性，VSMCS 的胞质突起也随之表现为双极性，细胞呈梭形，较单层培养系统中的细胞更具立体感.同时，在三维系统中，尽管存在血清的刺激作用，但因VSMCS 受到胶原基质的抑制作用，所以生长增殖为相对静息状态.含VSMCS 的胶原网架在一定浓度血清存在时可发生收缩反应［5-7］ .我们利用凝胶块的周边部分漂浮并发生收缩，使周围游离开的部分向中心聚集，产生张力作用.结果VSMCS 排列方向与此张力作用的方向垂直，表明细胞外基质的收缩影响了VSMCS 的形状和排列;VSMCS 的形状和排列与其所受的张力的方向存在密切关系.国内有关三维培养系统的研究，多运用成纤维细胞，而国外细胞外基质多采用纯化Ⅰ型胶原，关于以鼠尾胶为支架的VSMCS 三维培养研究未见报道.应用三维细胞培养系统研究VSMCS 生物学行为具有良好的临床应用价值.由于这一系统可以将细胞、细胞外基质以及参与血管形成过程的一些调控因素如激素、生长因子、各种药物等构成一个有机整体，从而使实验结果能更加真实地反映活体血管组织中膜的生物学特性，所以这一培养系统的应用和发展对组织工程化血管的研究将产生积极的影响.参考文献［1］Montesano R，Orci L.Tumor promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro ［J］.Cell，1985;42（2）:469-477.［2］Yang L，Lu KH，Wang Q，Ai YF，Wang SC.Three-dimensionculture of scar-derived fibroblasts in human skin collagen ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（5）:588-589.［3］Wang H，Liu B，Fu M.Primary-explant method of culturing human arterial smooth muscle cells ［J］.Hua Hsi I Ko Ta Hsueh Hsueh Pao，1995;26（1）:105-108.［4］Friedl P，Brocker EB.The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix ［review］［J］.Cell Mol Life Sci，2000;57（1）:41-64.［5］Stadler E，Campbell JH，Campbell GR.Do cultured vascular smooth muscle cells resemble those of the artery wall?If not，Why not ［J］?J Cardiovasc Pharmacol，1989;14（Suppl）:1-8.［6］Song J，Rolfe BE，Campbell JH，Campbell GR.Changes in three-dimensional architecture of microfilaments in cultured vas-cular smooth muscle cells during phenotypic modulation ［J］.Tissue Cell，1998;30（3）:324-333.［7］Thie M，Schlumberger W，Semich R，Rauterberg J，RobenekH.Aortic smooth muscle cells in collagen lattice culture:Ef-fects on ultrastructure，proliferation and collagen synthesis ［J］.Eur J Cell Biol，1991;55（2）:295-304.。

血管内皮细胞—平滑肌细胞共培养体系研究进展血管内皮细胞（endothelial cells，EC）和血管平滑肌细胞（smooth musclecells，VSMC）的相互作用、相互影响维持血管生理功能和多种疾病的发生发展，EC-SMC联合培养模型是目前研究这2种细胞间相互影响的最佳方式。

作者对现有的EC-SMC共培养模型及共培养对这2种细胞结构和功能的影响进行综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据，也为建立更接近机体生理/病理状态的EC-SMC体外共培养体系提供参考。

标签：内皮细胞；平滑肌细胞；共培养；相互作用血管内皮细胞（endothelial cells，EC）和血管平滑肌细胞（smooth muscle cells，VSMC）是构成血管壁的主要细胞成分，2种细胞间的相互作用、相互影响是维持血管生理功能和血管壁自身结构稳定的关键，在病理条件下EC和SMC的相互作用同样可影响多种疾病的发生发展。

EC-SMC联合培养模型是目前研究这2种细胞间相互影响的最佳方式，对研究动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发病机制、血管壁生理及炎症反应等有重要意义。

本文就目前EC-SMC共培养模型和共培养模式下2种细胞的互相影响做一综述，为在微观上深入研究二者的相互关系提供依据。

1 EC-SMC共培养模型1.1 直接接触的共培养模式早在20世纪80年代，国外学者就开始尝试建立EC-SMC共培养的方法。

早期研究简单地将EC和SMC按一定的比例混合，种植在同一体系中，2种细胞能够混合生长，且相邻的EC和SMC之间形成连接[1]。

此模型较为原始，细胞混杂，EC和SMC没有形成生理状态下的结构层次，且2种细胞之间干扰较大。

在此基础之上，Davies等[2]引进了微载体技术，即将2种细胞分别种植于微载体上，然后将微载体混合于同一体系，实验中相邻的微载体上同型或异型细胞间都形成接触连接。

这种方法很好地将2种细胞分离培养，使其能独立存在，从而为单独研究联合培养体系中某一种细胞提供了方便，但仍然不能反映生理状态下细胞的生长结构层次关系。

PHA在组织工程中的初步应用摘要：聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate或PHA）是一种新型的生物材料。

多项研究发现，PHA与多种细胞亲和性高，在组织中免疫反应低，无血凝反应，具有较强的的生物相容性和生物降解性，必将在组织工程中有广泛的应用。

关键词：PHA PHB 组织工程生物相容性The Preliminary Application of PHA in Tissue EngineeringLIANG Yan-sheng（Qingyuan technology college，Qingyuan 511517 China）Abstract：Polyhydroxyalkanoates (PHA) is a new type of biomaterial. Many studies have found that, PHA have high affinity with a wide variety of cells, have low immune responses and no hemagglutination reaction in tissues, have a strong biocompatibility and biodegradability. And they must have a wide range of application in tissue engineering.Keywords: PHA, PHB, tissue engineering, biocompatibility生物材料在组织工程中占据非常重要的地位，同时组织工程也为生物材料提出问题和指明发展方向。

由于传统的人工器官（如人工肾、肝）不具备生物功能（代谢、合成），只能作为辅助治疗装置使用，研究具有生物功能的组织工程人工器官已在全世界引起广泛重视。

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate或PHA）做为一种新型的生物材料，其在组织工程方面的应用逐渐成为研究的热点。

小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。

方法改良酶消化法。

结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。

结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。

吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。

体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。

小肠黏膜下层细胞及内皮细胞平滑肌细胞构建组织工程血管的初步研究王飞;魏红芳;胡成栋;张恩录;高爱芹;王瑞;李东风【摘要】目的：初步探究小肠黏膜下层（S IS ）细胞及内皮细胞、平滑肌细胞构建组织工程血管的实验方法、条件及可行性。

方法取20只家兔（6～8周大），于体外分离培养内皮细胞、平滑肌细胞并标记，最后进行组织工程化血管的自体移植。

结果实验结果表明于培养板中合成的支架材料呈现为白色、均匀质地；内皮细胞及平滑肌细胞可较好附着并植入SIS材料。

结论小肠SIS及内皮细胞、平滑肌细胞构建组织工程血管具有可行性，并具有十分重要的医学应用价值。

【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】2页(P517-518)【关键词】小肠黏膜;下层细胞;内皮细胞;平滑肌细胞【作者】王飞;魏红芳;胡成栋;张恩录;高爱芹;王瑞;李东风【作者单位】河北省邯郸市中心医院骨科 056001;河北省邯郸市中心医院麻醉科056001;河北省邯郸市中心医院骨科 056001;河北省邯郸市中心医院骨科 056001;河北省邯郸市中心医院骨科 056001;河北省邯郸市中心医院骨科 056001;河北省邯郸市中心医院骨科 056001【正文语种】中文天然血管具备天然成分及结构并具有良好的生物相容性，可以提供细胞需要的各种信号[1]，同时也可以有效促进细胞的黏附和保留分化功能。

因此，天然血管是组织工程血管支架的最佳材料。

小肠黏膜下层(SIS)是天然细胞外基质类生物衍生材料，通常由猪小肠制备，人工处理后的SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及少量Ⅴ、Ⅵ胶原构成，制备的SIS厚度约80 μm，具有无免疫原性、抗微生物活性、优良的生物力学性能，并能促进组织再生，是组织工程细胞外基质很有前途的生物材料[2-3]。

在此基础上，以异种SIS为细胞外基质预构成三维管道，将内皮细胞与平滑肌细胞在三维管道上联合培养，复合构建组织工程化血管的设想，在国内外杂志未见相关报道，其可行性值得探索。

血管内皮细胞培养方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）是血管内膜上的一种细胞，它们起着维持血管结构和功能的重要作用。

近年来，血管内皮细胞的培养方法逐渐成为生物医学领域的研究热点之一。

良好的血管内皮细胞培养方法不仅有助于研究心血管疾病的发生机制，还可以为新药的研发提供重要参考依据。

本文将详细介绍血管内皮细胞培养的方法和技巧，希望对相关研究人员和医学工作者有所帮助。

一、血管内皮细胞来源血管内皮细胞可以从多种来源获得，包括人类或动物的血管组织。

通常情况下，从人体的脐带血、外周血或组织中分离得到的血管内皮细胞具有较高的纯度和活性，适合于体外培养。

一些商业生物技术公司也提供血管内皮细胞的原代细胞培养服务，可以方便地购买到高质量的细胞用于研究。

二、血管内皮细胞培养基的选择血管内皮细胞培养基是培养血管内皮细胞的基本营养液，不同类型的细胞需要不同种类的培养基。

一般来说，常用的血管内皮细胞培养基包括Eagle's minimum essential medium（EMEM）、Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）和Medium 199等。

这些培养基通常含有必需氨基酸、维生素、矿物质、生长因子、胎牛血清等营养成分，可以提供适宜的环境促进细胞生长。

1、原代细胞的分离和培养将采集到的组织样本进行酶消化处理，分离出血管内皮细胞，并通过贴壁法或悬浮培养法将其传代培养。

在传代培养的过程中，需要定期更换培养基、观察细胞的形态和数量变化，以确保细胞的健康生长。

2、细胞的传代和冻存随着细胞的传代次数增加，细胞的增殖能力和活性逐渐下降，需要进行细胞的传代和冻存。

传代前需要对细胞进行细胞数计数和活力检测，传代后要及时观察细胞的形态和生长情况，确保细胞的健康状态。

3、细胞的实验处理在进行实验前，需要对培养的细胞进行处理，如细胞分裂抑制（如丙酮酸、羟基脲等）、细胞增殖刺激（如VEGF、EGF等）等。

细胞共培养焦亡-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细胞共培养是一种重要的实验手段和研究方法，它指的是在体外培养的细胞中同时存在多种不同的细胞种类。

相比于单一细胞培养，细胞共培养可以更好地模拟体内的生物环境，提供更加复杂和真实的研究模型。

这种方法在细胞生物学、医学研究以及药物开发等领域具有广泛的应用潜力。

在传统的细胞培养中，通常只使用一种单一细胞来进行研究。

然而，生物体内的生理过程往往涉及多种细胞类型的相互作用。

细胞共培养技术的出现填补了这种在体外研究中的缺陷，使得科研人员能够更好地研究细胞之间的相互作用和交流。

细胞共培养的意义不仅在于提供了更加真实的实验模型，还能够为科研和医学研究提供更加详尽的信息。

通过将不同类型的细胞一同进行培养，我们可以模拟出不同细胞之间的相互作用，进一步了解细胞在生理环境下的功能和表现。

这对于研究疾病的发生机制、寻找特定治疗方法以及筛选药物等方面都具有重要的价值。

在实际应用方面，细胞共培养也有着广泛的应用领域。

比如，在药物研发过程中，通过将药物与不同类型的细胞共同培养，可以评估药物对不同细胞类型的影响，以确定药物的安全性和疗效。

此外，在肿瘤研究中，细胞共培养可以帮助科研人员模拟肿瘤微环境，更加准确地研究肿瘤细胞的生长、转移和治疗反应等方面。

综上所述，细胞共培养作为一种重要的实验手段和研究方法，具有广泛的应用前景。

它不仅可以更好地模拟体内的生物环境，提供更加复杂和真实的研究模型，还能够为科研和医学研究提供更加详尽的信息。

在未来的发展中，细胞共培养将继续发挥重要作用，推动科学研究和医学进步。

文章结构部分的内容可以从以下几个方面进行阐述：1. 文章主题和框架概述：首先介绍文章的主题是关于细胞共培养及焦亡的研究，强调该研究领域的重要性和新颖性。

简要说明文章的框架，包括引言、正文和结论三个部分。

2. 引言部分：介绍整个文章的研究背景和目的。

强调细胞共培养是一个重要的研究领域，然后列举一些现有研究中的问题或者未解决的难题。

1100Human Brain Vascular Smooth Muscle Cells人脑血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞是许多动脉疾病的细胞水平的根源。

血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素。

最新研究表明血管平滑肌细胞表达的ICAM-1 和VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关.人血管平滑肌细胞的体外培养是血管研究中的重要模型，并将对血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息.细胞培养说明注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。

将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。

经过以下步骤后开始培养细胞1.准备多聚赖氨酸包被的培养瓶(2μg/cm2，推荐用T-75的培养瓶)。

向T-75瓶内加入10ml 无菌水，然后加入15μl多聚赖氨酸原液(10mg/ml,ScienCell cat. no. 0413).将培养瓶放入培养箱中过夜(至少在37°C中过一小时)2.准备完全培养基：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。

在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。

用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。

3.用无菌水冲洗多聚赖氨酸包被的培养瓶两次并向瓶内加入20 ml完全培养基。

将培养瓶放入超净台中，然后融化细胞。

4. .将小瓶放入37°C水浴中，轻轻地握住并旋转小瓶直到完全融化。

将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。

小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面。

用1ml eppendorf吸管轻轻重悬管内容物。

5.将管中内含物放入均匀的，多聚赖氨酸包被的培养瓶中。

推荐接种密度为5,000 cells/cm2。

注意：细胞融化后不推荐稀释和离心，因为这些操作比培养基中DMSO残留物对细胞的伤害大。

血管平滑肌细胞接种在多聚赖氨酸包被的培养瓶中能促进细胞帖壁。

【收稿日期】２００７－０３－２９【基金项目】国家自然科学基金项目（１０５７２０９６；１０７３２０７０）【作者简介】曹烨（１９８１－），女，山东威海市人，硕士研究生，从事血管力学生物学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｏｓｅ＿ｍｉｍｉ９２４５＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ【通讯作者】姜宗来，教授，博士生导师，Ｔｅｌ：（０２１）３４２０４８６３，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｌｊｉａｎｇ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ血管平滑肌细胞对联合培养内皮祖细胞黏附、增殖与形态的影响曹烨，严志强，白玲，王燕华，沈宝荣，姜宗来（上海交通大学力学生物学与医学工程实验室，上海２００２４０）【摘要】目的：探讨血管平滑肌细胞对联合培养的内皮祖细胞黏附、增殖与分化的影响。

方法：从人脐血中分离纯化内皮祖细胞并鉴定；建立内皮祖细胞和平滑肌细胞的联合培养模型；细胞粘附实验测定内皮祖细胞的粘附能力；形态学观察内皮祖细胞的分化与增殖。

结果：与血管平滑肌细胞联合培养的内皮祖细胞的粘附能力比单独培养时提高了６３％，长梭形细胞数量增加，同时克隆形成单位的数量下降了约６０％。

结论：血管平滑肌细胞促进了内皮祖细胞的粘附与分化，同时抑制了内皮祖细胞的增殖能力。

【关键词】联合培养；内皮祖细胞；血管平滑肌细胞；粘附；增殖；分化【中图分类号】Ｑ２【文献标识码】Ａ【文章编号】１００１－１６５Ｘ（２００８）０１－００６９－０４Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｉｎａｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍＣＡＯＹｅ，ＹＡＮＺｈｉ－ｑｉａｎｇ，ＪＩＡＮＧＺｏｎｇ－ｌａｉ，ｅｔａｌ．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｃｈａｎｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏＴｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２４０，Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（ＶＳＭＣｓ）ｏｎｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ（ＥＰＣｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＨｕｍａｎＥＰＣｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｃｏｒｄｂｌｏｏｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌａｂｅｌｅｄａｃ－ＬＤＬａｎｄｌｅｃｔｉｎ．ＩｎａＶＳＭＣ／ＥＰＣｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｔｈｅａｄｈｅｓｉｖｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＥＰＣｓｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙａｄｈｅｓｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｌｏｎｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓａｎｄｔｈｅｍｏｒｐｈｏｒｌｏｇｙｏｆＥＰＣｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＷｈｅｎＥＰＣｓｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＶＳＭＣｓ，ｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｏｆＥＰＣｓｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙ６３％，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｅｌｏｎｇａｔｅｄｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｕｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｌｏｎｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ６０％ａｂｏｕｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＴｈｅａｄｈｅｓｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＥＰＣｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｂｕｔｔｈｅｉｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＶＳＭＣｓ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ；ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ；ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｓｃｅｌｌｓ；ａｄｈｅｓｉｏｎ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ血管内皮衬贴于血管壁的内面，对于保持血管结构和功能的完整与稳定极为重要。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201680007913.3(22)申请日 2016.01.29(30)优先权数据2015-017839 2015.01.30 JP2015-065007 2015.03.26 JP2015-183940 2015.09.17 JP(85)PCT国际申请进入国家阶段日2017.07.28(86)PCT国际申请的申请数据PCT/JP2016/052571 2016.01.29(87)PCT国际申请的公布数据WO2016/121896 JA 2016.08.04(71)申请人 日产化学工业株式会社地址 日本东京都申请人 国立大学法人千叶大学(72)发明人 石井伊都子　金木达朗　北原真树　(74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256代理人 杨宏军(51)Int.Cl.C12N 5/077(2006.01) (54)发明名称血管平滑肌细胞的培养方法(57)摘要本发明提供一种血管平滑肌细胞的培养方法，所述方法包括下述步骤：在含有能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体的培养基组合物中，悬浮培养血管平滑肌细胞。

本发明还提供一种抑制血管平滑肌细胞的细胞增殖的方法，所述方法包括下述步骤：在该培养基组合物中悬浮培养血管平滑肌细胞。

本发明还提供一种血管平滑肌细胞的保存方法，所述方法包括下述步骤：使血管平滑肌细胞悬浮于该培养基组合物中。

该结构体包含例如脱酰基结冷胶。

权利要求书1页 说明书21页 附图3页CN 107208059 A 2017.09.26C N 107208059A1.血管平滑肌细胞的培养方法，所述方法包括下述步骤：在含有能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体的培养基组合物中，悬浮培养血管平滑肌细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中，悬浮培养处于已停止细胞增殖的状态的血管平滑肌细胞。

3.抑制血管平滑肌细胞的细胞增殖的方法，所述方法包括下述步骤：在含有能使细胞或组织悬浮而进行培养的结构体的培养基组合物中，悬浮培养血管平滑肌细胞。

兔血管平滑肌细胞原代培养我是某医学院的硕士研究生，课题涉及到兔血管平滑肌细胞的原代培养，实验开始非常不顺利，进行了几次实验均一无所获。

后来我在丁香园上发帖提问（/bbs/topic/16215850?tpg=1&ppg=1&age=0#0），得到了丁香园网友的热情帮助，在网友的帮助下，经过不断尝试改进，最后我终于得到了想要的血管平滑肌细胞，完成了实验并顺利毕业。

鉴于网上还有很多网友在提有关血管平滑肌细胞原代培养的问题，我现在将自己的毕业论文中细胞培养的部分共享，由于论文还没发表，部分图片不能公开，请见谅！欢迎转载。

①DMEM培养基的配制：在新购进的500ml DMEM/F12培养基内加入5ml双抗及适当比例的FBS(原代20%，3代后5%)，配制成完全培养基，4℃保存备用。

②兔SVMCs的原代培养：体重2kg～3kg的雄性日本大耳白兔，耳缘静脉注射空气栓塞处死后，置于操作台。

从腹部切开，分离腹部血管，暴露腹主动脉，无菌条件下切下约5cm长的动脉，装入含双抗的PBS中备用。

在超净台内将取材的血管在DMEM中漂洗数次，小心将外膜剥去，用双抗浸泡数分钟后，直接加入胰酶，在胰酶双抗混合液中用眼科剪将组织块剪碎，将双抗和胰酶混合后用1ml移液枪吸去，加入3ml培养基,用吸管吹打后将组织块和培养液吸入25cm2细胞培养瓶中，直接用移液器将液体大部分吸出，盖紧瓶口后瓶口向上竖立放入培养箱，约1.5h后加入DMEM/F12培养基(含20%FBS, 1%双抗)，每个培养瓶约2.0ml，缓慢将瓶身翻转，使培养基覆盖组织块，将瓶口拧松，放入CO2养箱，静置3d～4d观察。

这是手术中的图片，上面灰白的那根是腹主动脉。

这是超净台里剥开了一半的血管，要的是上面这部分，下面的是血管外膜及筋膜等，丢弃这是剪碎了的组织块，泡胰酶和泡双抗都是这么泡，后期我做的时侯比这个剪得还要碎:这是剪好后放到培养箱里的图片，瓶口向上立着的两瓶是我的。

血管平滑肌细胞分离及培养血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管中膜的主要细胞成分。

具有增殖、迁移、合成并释放细胞基质的能力，在血管性疾病的发生进展中有重要作用。

目前已了解到血管平滑肌细胞的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成形术后再狭窄等的主要病理表现。

利用体外培养血管平滑肌细胞可了解其正常和病态生物学特性及机制。

体外培养血管平滑肌细胞举行药物药理学方面的讨论。

体外培养血管平滑肌细胞可取材于不同动物及人胚胎或成体的不同部位的血管，按照讨论目的举行挑选。

血管平滑肌细胞分别培养办法较多，主要有簇拥细胞培养法、植块培养法、微血管培养法。

其中植块培养法可得到数量较多的平滑肌细胞而适用于药理讨论。

还可按照讨论需要将分别得到的平滑肌细胞举行蜕变培养、克隆培养、与内皮细胞共培养等。

【材料】 1．动物或人胚胎血管。

2．试剂 0.1%、0.1％,MEM 培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L，10万U/L和l00mg/L）。

Hanks 液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS04·7H20 0.20g, KH2P04 0.06g, NaHC03 0.35g，glucose 1.00g，0.02g)。

3．器皿及仪器细胞培养用器皿，手术器械，净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜等。

【办法】 1．簇拥细胞培养法（酶消化法）无菌术取颈或股动脉，于预冷Hanks液中洗涤3次，认真剥除血管表面结缔组织。

将血管纵向剖开移入另一装有0.1％胶原酶(D-Hanks配制）消化液的平皿中。

37℃消化30分钟后，认真剥离外膜及外层中膜并用小刀片轻轻刮除内膜，Hanks液冲洗后移入另一清洁的盛有消化酶平皿中（或剪成1 mm3组织块碎块，置离心管中）37℃消化2～3小时，时常轻晃，至组织呈絮状，收集细胞悬液并与5倍量含10％新生牛血清的培养基混合，终止消化。

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1 细胞培养1.1.1 培养液配制 DMEM(美国Gibco公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素 (100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,美国Hyclone)。

1.1.2 培养器皿 25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3 大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4 原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。