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4种水稻基因组DNA 微量提取方法对ISSR －PCR 试验的影响张静（江汉大学生命科学学院，湖北武汉430056）摘要［目的］找出适用于ISSR 试验的效果好、操作简便的水稻DNA 提取方法。
［方法］采用高盐十二烷基硫酸钠（SDS ）法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB ）法及2种型号试剂盒（DP305、DP320）法提取基因组DNA ，利用核酸蛋白检测仪及琼脂糖电泳法测定其纯度与浓度，并比较其作为模板用于ISSR －PCR 的效果。
［结果］发现SDS 法与CTAB 法提取的DNA 浓度与纯度均不高，在ISSR －PCR 中虽能扩增出条带，但结果不能重复；试剂盒DP305与DP320提取的DNA 浓度与纯度较好，其中试剂盒DP320效果更优，PCR 结果能稳定重复。
［结论］试剂盒DP320提取DNA 的方法是最适合水稻ISSR 试验的DNA 提取方法。
关键词DNA ；ISSR －PCR ；水稻中图分类号S188+．1文献标识码A 文章编号0517－6611（2011）24－14540－02Effect of Four Micro-extraction Methods of Rice Genome DNA on the ISSR-PCR Experiment ZHANG Jing （College of Life Science ，Jianghan University ，Wuhan ，Hiubei 430056）Abstract ［Objective ］The good and simple method of DNA extraction ，which was suitable for the ISSR amplification experiment ，was ex-plored．［Method ］The purity and concentration of the genomic DNA ，extracted with two methods of SDS and CTAB ，and two types of kits （DP305and DP320），were measured with the nucleic acid protein detector and agarose gel electrophoresis ，and then ，the efficiency of the IS-SR-PCR aplification based on them as template was compared．［Result ］It was found that the concentration and purity of DNA extracted with SDS and CTAB were not fine ，which could be amplified the formation of ISSR-PCR bands but there was a poor reliability．The application ofKit DP305and DP320could result in a fine extraction effect on both DNA concentration and purity ，among which ，the better result could be produced from Kit DP320with stable reliability．［Conclusion ］The DNA extracted with the kit DP320was most suitable for the rice ISSR ex-periment．Key words DNA ；ISSR-PCR ；Rice基金项目湖北省中青年人才项目（Q20104504）；武汉市高校科研项目（2009K067）。
【收稿日期】2009204221【基金项目】福建省科技厅资助项目(2008F50205)【作者简介】卢龙娣(19832),女,在读硕士研究生,从事肠道微生物学研究,Email:linl ongdi @;江胜滔,通讯作者,Email:windt om 2jiang@文章编号:10052376X (2009)0720588203【论 著】鸡肠道菌群总DNA 三种提取方法的比较卢龙娣1,江胜滔2,林跃鑫2(1.福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108;2.龙岩学院生命科学学院,福建龙岩 364000) 【摘要】 目的 比较不同方法提取鸡肠道菌群总DNA 的差异,为分子方法分析肠道菌群组成提供质量较高的DNA 模板。
方法 采用反复冻融法、酶裂解法和试剂盒法(E .N.Z .A St ool DNA Kit )来提取鸡肠道菌群的总DNA,并根据DNA 浓度及纯度、16S DNA 扩增产物和ER I C 2PCR 产物所反映的片段多态性4个指标,对这3种方法提取的DNA 质量进行比较。
结果 3种方法均能提取DNA,所得DNA 都可以用于16S DNA 的扩增,但后2种方法所得DNA 的ER I C 2PCR 结果能反映出更高的菌群多样性。
结论 试剂盒法和酶裂解法所提取的DNA 质量好,适合用于肠道菌群的分子生态研究。
【关键词】 肠道菌群;总DNA 提取;16S DNA;ER I C 2PCR【中图分类号】R446.4 【文献标识码】ACom par ison of three m ethods for tot a l D NA extracti on from i n testi n a l m i croflora of the fowlLU Long 2di 1,J I A NG Sheng 2tao 2,L I N Yue 2xin2(1.The College of L ife Sciences,Fujian N or m al U niversity,Fuzhou 350108,China;2.The College of L ife Sciences,L ongyanU niversity,L ongyan 364000,China )【Abstract 】 O bjecti ve To screen a method that could p r ovide a higher quality DNA te mp late for molecular analysis of compositi on of intestinal m icr ofl ora .M ethod Repeated freeze 2tha w method,lys ozy me method and E .N.Z .A St ool DNA Kit method were used t o extract t otal DNA fr om intestinal m icr ofl ora of the f owl .The quality of DNA extracted by the three methods was compared based on the concentrati on,purity,16S DNA PCR p r oducts and length poly mor phis m of ER I C 2PCR p r oducts .Result Total DNA extracted by any of the three methods could be used t o 16S DNA a mp lificati on .But the result of ER I C 2PCR of DNA extracted by the last t w o methods showed more m icr ofl ora diversities .Conclusi on The quality of t otal DNA extracted by E .N.Z .A St ool DNA Kit method and lys ozy me method were better than that of repeated freeze 2tha w method,s o can both be used t o study molecular ecol ogy of intestinal m icr ofl ora .【Key words 】 I ntestinal m icr ofl ora;Total DNA extracti on;16S DNA;ER I C 2PCR 动物肠道内的微生物种类繁多,数量巨大,它们与动物的健康紧密相连,所以有必要分析动物肠道菌群的组成。
PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用2006年第4期(总第105期)广西热带农业45PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用宋卡魏王星云张荣意(华南热带农业大学环植学院,海南儋州571737)摘要:PCR及其相关技术用于体外扩增DNA,RNA具有灵敏,快速,简便等优点,已经广泛应用于植物病原细菌的检测.本文综述了real—timefluoreseentPCR,REP—PCR,Irlq~luno—RCR,RAID—PCR,Nested—PCR等技术的原理及其在植物病原细菌检测和鉴定中的应用现状. 关键词:PCR植物病原细菌检测鉴定聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是1983年由美国PE_Cetus公司的KaryMullis等n发明,1985年公开报道的一种体外核酸扩增系统.PCR及其相关技术具有快速,灵敏,操作简便等优点,已广泛应用于分子生物学,医学,微生物学等领域.且在这些领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景.传统的PCR技术在植物病原细菌学的检测应用已经非常广泛12,3,4,5,61但是由于植物病害的多样性以及植物病原细菌的复杂性,使传统的PCR技术较难满足需要,由此专家学者们研制出了许多以PCR技术为基础的相关技术,如Real—timefluorescentPCR,rep—PCR,~nnluno—PCR,ITS—PCR等.这些方法使植物病原细菌的检测更加方便,快捷,灵敏,本文简要介绍一些PER相关技术的原理及其在植物病原细菌检测中的应用概况.1Real—timefluorescentPCR其原理是在常规PCR的基础上,增加1条双荧光标记的核酸杂交探针,即Taqman探针;随着实时PCR 反应体系的进行,每进行一次DNA扩增,就有一个探针被切断,同时荧光信号值被记录下来,且与扩增产物的量产生一对一的对应关系,产物的量越大,荧光信号就会越强,也即反应起始的模板数越高,就越容易达到一个荧光信号阈值,循环次数(Ct值)和反应体系的底物浓度就会形成一个严格的对应关系,根据标准曲线和Ct值,即可以准确地确定扩增基因的浓度….实时荧光PCR在全封闭状态下实现PCR扩增.荧光探针杂交,信号检测不需电泳和EB染色,可以有效地降低污染和假阳性的产生,具有操作简单,省时省力,精确性高,特异性强,安全快速,准确灵敏等优点.漆艳香等硌将玉米细菌性枯萎病菌16SrDNA基因克隆测序,根据该细菌与其它待测细菌菌株16s rDNA序列差异,设计出对玉米细菌枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针.进行实时荧光PCR检测,结果显示只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,且灵敏度较高,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR 就能检测到.根据此技术原理与路线,漆艳香等又分别构建了苜蓿萎蔫病菌,菜豆细菌性萎蔫病菌Bo]和香蕉细菌性枯萎病菌…的实时荧光PCR检测体系. 朱建裕等n根据梨火疫细菌中独特含有质粒pEA29, 设计了1对引物和3条探针,建立了梨火疫细菌实时荧光PCR的检测方法.2REP—PCR原核与真核生物中普遍存在着散布的重复DNA序列,这些序列由于发挥着生物体基本的功能作用,因此在进化中呈高度保守的状态.REP(repetitiveeX- tragenicpalindromic)和ERIC(enterobactefialrepetitivein- tergenicCOl2Sensus)属于这样的序列.研究发现,REP, ERIC等序列在微生物中广泛存在,随机分布且在进化中呈高度保守状态.因此,研究人员以REP,ERIC等序列为引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到不同带型,从而形成了被测菌基因组特异的指纹图谱,该技术称rep—PCR DNA指纹技术.该技术方法简单,快速,敏感和分辨率高,现普遍应用于流行病学中的致病菌株鉴定和确定广西热带农业2OO6年第4期(总第105期)细菌间的亲缘关系.S.V.Tsygankova等"对Xanthomonas,pseudumonas,Erw/n/a等病原菌进行鉴定时,发现所有被测的. campestr/s均能通过引物KRPN2扩增出一段约600bp 的片段,接着用引物SCAR进行扩增,在所有的.~tr/s上出现一条特异性条带,而在其他的被测菌株上不能出现.他利用这特点,进行rep—PCR,结果能有效,迅速地对被测菌株进行鉴定.J.Louws等[14在对339个Xant~monas进行鉴定时,也成功地应用了rep—PCR技术获得理想结果.在日本,Ralstoniasolanacearum小种4和小种1广泛存在于西红柿,马铃薯等植物上,除非进行致病性测试,否则很难将两者区分,MitsuoHorita等"s】人利用小种4中存在特异性序列(AKIF—AKIR)和(21F一21R),并将其作为引物,利用rep—PCR技术,最后得到了特异带型.该方法能够准确,快速,灵敏地进行致病菌株的鉴定.3Immuno—PCR免疫PCR是在酶联免疫吸附实验基础上建立起来的一种新方法,由Sano等【I酬在1992年首次报道,它同时具备抗原抗体反应的专一性和PCR的强特异扩增能力.它是将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上,用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色,根据扩增产物存在与否判断抗原存在情况.其一般程序是这样的,首先在酶联板上包被捕获抗原的抗体,然后加入待检抗原,再加入DNA分子标记的检测抗体,温育后充分洗涤,PCR扩增黏附于抗原/抗体复合物上的DNA分子,最后对PCR产物进行分析[17]o在该项技术的基础上,张红【l.等采用了免疫磁珠吸附与PCR相结合的技术,对瓜类细菌性果腐病病原快速检测,经研究表明,其技术检测时间周期为4h,最低菌悬液检出量为1×10cfu/ml,而且不需进行细菌DNA提取.该技术方法省时,快捷,准确,估计会在口岸检疫工作中起到重要的作用.4RAPD—PCRRARD技术由W////ams和Welsh首先提出(W////ams等1990),是利用一个随机序列的寡核酸作引物,通常为10个核甘酸,以生物基因组的DNA作模板进行PCR扩增反应,扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离,所得多态性可反映基因组DNA相应区域的多态性,因而可用于对不同类群细菌和不同致病变种亲缘关系的鉴定,系统进化发育的研究等等.姬广海等n用4o个引物对中国水稻条斑病菌,稻短条斑病菌和李氏禾条斑病菌等14个代表菌株进行了RAPD分析.HocquelletA等】应用RAPD方法检测了柑桔黄龙病亚洲种与非洲种基因的多态性并获得4个鉴别基因.XiaotingQia等在研究柑橘和咖啡上的致病菌Xylellafastidiosa时,发现传统的PCR法较难鉴别,他们应用了RAPD—PCR法,扩增产物存在Cf0I多态性,利用这特点较好的鉴别了该致病菌. Khoodoo等也充分使用了该方法,对天南星科等植物的细菌性枯萎病病原物不同致病变种Xanthomonas axonopodispv.dieffenbachiae进行遗传多态性分析,从而进行鉴定.5Nested—PCR巢式PCR(nestedPCR)是一种PCR改良模式,它由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成,首先对靶DNA进行第一步扩增,然后从第一次反应产物中取出少量作为反应模板进行第二次扩增,第二次PCR引物与第一次反应产物的序列互补,第二次PCR扩增的产物即为目的产物.王茂华等根据玉米细菌性枯萎病病菌ITS区域序列,选择特异性序列,设计了一对引物,该引物能从参试菌株中扩增出特异性条带,然后与扩增ITS区域的通用引物结合,建立了检测和鉴定该病菌的nested—PCR技术,该技术检测灵敏度达到了4个细菌细胞.吴琼等在研究该病菌时,通过对该病原菌及其近似种的16SrDNA的序列测定和分析,设计了该病原菌的特异性引物,最后采用nested—PCR技术,准确区分了该病菌及其近似种,且检测灵敏度在DNA水平上达到10ng,检测纯培养细菌达到2CFU/ml的水平.6展望PCR及其相关技术的进步极大的促进了植物细菌病害研究的发展,为植物细菌病害的研究注入了新鲜的血液,植物细菌病害的检测由最初的症状观察, 形态观察,生理生化分析,到血清学,免疫学的发展,再到今天的PCR检测,经历了由宏观到分子水平的过渡,检测技术的准确性,灵敏性,快捷性都在不断地提高.但是,PCR技术发展的同时,其在植物病原细菌检测方面也存在着一些不足,如PCR反应绝大部分只能利用病原物的核酸或纯培养物作为PCR模板,若以受侵染植物组织的核酸粗提液或材料浸泡液作为模板, PCR反应将会受到严重抑制;另外,一些尖端的PCR 技术方法还需要特配的仪器,这只能满足一些条件较好的单位,若想在全国的检疫系统,大学,研究院配备,还是有一定的难度,这就大大阻碍了应用PCR技2006年第4期(总第105期)广西热带农业47术检测细菌性病害的发展.总的来说,PER技术将向短时间,高精度,自动化,微量化,尽量减少人为因素的方向发展,这就需要根据实际情况实际操作,因为不同的研究目的需要适合的方法,然而任何一种方法都有其使用范围,对于不同目的的检测,所要得到的灵敏度,可靠性和高效性的最优组合,以及如何制定标准化方案,这都是我们面临的重要问题.不过,随着PER及其相关技术进一步的完善,我们有理由相信, 它会为植物病原细菌的研究创造更辉煌的未来.参考文献【1】MuUisKB.eta1.SpecificamplificationofDNAinvit- ro:thepolymerasechainreaction.ColdSpringHarbor SymmpBiol,1986,51:263～273【2】田亚南,柯穗,柯冲.应用多聚酶链式反应(PCR) 技术检测和定量分析柑桔黄龙病痛原【J】.植物病理,1996,26(3):243250【3】s.A.Slack,刘学敏.检测马铃薯环腐病茵的PER, ELISA和DNA杂交等方法的比较.国外农学一杂粮作物,1998,18(1):4952【4】王中康,殷幼平,ComstakJc等.Identificationand DetectionofXjantho1柏0nasalbilineanswithPCR.E.DApproaches.JournalofzhejiangAgficul- ruralUniversity,1998,24(5):537—546【5】魏兰芳,姬广海,张世光.云南马铃薯青枯病茵的PER检测【J】,西南农业大学,2002,24(1):72—74【6】任毓忠,李晖等.哈密瓜细菌性果斑病种子带茵的PcR检测.新疆农业科学,2004,41(5):329—332【7]HiguchiR,FoclderC,DoUingerG,eta1.Kinetic PERanalysis:real——timemonitoringofDNAamplifi- cationreactions.Biotechnology,1993,11(9):1023—1030【8】漆艳香,肖启明,朱水芳.玉米细菌性枯萎病菌165rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR.湖南农业大学,2003,6:183—187【9】漆艳香,赵文军,朱水芳.苜蓿萎蔫病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立[J】.植物检疫,2003,17(5):260—264[1O】漆艳香,肖启明,朱水芳.菜豆细菌性枯萎病菌165 rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PcR检测.仲恺农业技术学院,2004,17(4):10—17[1l】漆艳香,谢艺贤,等.香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光P(R检测方法的建立.华南热带农业大学,20o5,3(11):1—5【l2】朱建裕,廖晓兰,高必达,等.梨火疫细菌实时荧光PCR和诱捕PER—ELISA检测方法的建立.植物检疫,2003,1(17):710【13】S.V.Tsygankova,A.N.Ignatov,E.S.Boulygina,eta1.GeneticrelationshipsamongStxRiIlSofXan- thomonascang~tr/spv.campestrisrevealedbynovel rep—PCRprimers.EuropeanJournalofPlantPathol-ogy,2004(110):845—853【14】J.Louws.M.H.SehultzU.Rossbaeh.eta1.A ComprehensiveSpeciestoStrainTaxonomicFrame- workforXnathomonas.Phytopathology,2oo5(95):1O98一ll1l[15】MitsuoHorlta,KazutakaYano,KeniehiTsuehiya. PER—-basedspecificdetectionofRalstonia$olalizlceil1211~lace4strains.JGenPlantPatho1.20o4 (70):278283【16】SanoT,SmithCL,CantorCR.[1llmLlllO—PCR;very sensitiveantigendetectionbynlelansofspecificanti- body—DNAconjugates.science,1992,258(5079):l20[17】黄留玉.PER最新技术原理,方法及应用.化学工业出版社.2005.1:174—180【l8】张红,周志诚等.瓜类细菌性果腐病痛原IAS—PER检测研究.新疆农业大学.2005.28(2):43～46[19】姬广海,孔繁明等.水稻上三种条斑病细菌DNA 的多态性初析.植物病理,1999,5:120—125【20】HocquelletA.BoveJtvI.GamierM,IsolationofDNA fromtheuncultured"cand/datusL/berobacter''species associatedwitheitrisHuonglongbingbyRAPD.CurrentMierobioolgy1I938:176—182【21]Xiaoting.Qin,ViecnteS.Miranda,eta1.AnEvaluation oftheGeneticDiversi~ofXy~llafastidi~aIsolated fromDiseasedCitrusandCoffeeinS.Paulo,Brazil.Phytopathology,20ol(91):599—605【22】Khoedco,M.H.R,andJaufeerally—Fakim,Y. 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食品中肠球菌的检测原理
食品中肠球菌的检测原理主要有两种方法：
1.培养方法：将食品样品加入含有肠球菌特异性培养基的培养皿中，经过一段时间的孵育后，观察培养皿中是否出现典型的肠球菌菌落。
该方法主要基于肠球菌对特定培养基的生长反应，具有选择性和差异性。
2.分子生物学方法：该方法主要是基于肠球菌的DNA分子，通过PCR技术进行检测。
首先从食品样品中提取肠球菌的DNA，然后使用特异性引物扩增肠球菌的16S rRNA基因或其他特定基因片段。
最后通过电泳分离扩增产物并检测扩增产物的大小，从而确定食品中是否存在肠球菌。
这两种方法在实际应用中往往结合使用，培养方法可以提供肠球菌的数量和活性信息，分子生物学方法可以更加准确地确定肠球菌的种类和数量。
FQ-PCR检测人肠道乳酸杆菌的研究冯玉奎;郑长青;孙英姿;高波【摘要】目的应用荧光定量PCR技术对健康人粪便内乳酸杆菌进行定量分析,建立乳酸杆菌的荧光定量PCR检测方法.方法依据乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,应用荧光定量PCR技术检测乳酸杆菌的16SrDNA,对粪便中的乳酸杆菌进行定量检测和分析,并和用传统方法所获得的结果进行比较.结果结果显示荧光定量PCR检测乳酸杆菌和传统方法检测乳酸杆菌之间无显著性差异(9.3±1.5 vs 8.9±1.3 copy.,P＞0.05).结论荧光定量PCR技术比传统方法特异性高、敏感性强,更省时和省力.【期刊名称】《实用医药杂志》【年(卷),期】2011(028)001【总页数】3页(P64-66)【关键词】实时荧光定量PCR;乳酸杆菌;定量检测【作者】冯玉奎;郑长青;孙英姿;高波【作者单位】266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科;266071,山东青岛,济南军区青岛401医院输血科;266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科;266071,山东青岛,济南军区青岛第二疗养院检验科【正文语种】中文【中图分类】R446.5乳酸杆菌（Lactobacillus）是在乳酸菌中与动物关系最密切的菌属，动物和人类从口腔到直肠始终有该菌存在，是动物肠道中占优势的菌群之一。
当动物消化道中乳酸杆菌的比率下降，则动物消化机能紊乱，严重者导致动物肠炎、下痢等疾病。
乳酸杆菌的数量变化往往预示着人身体状态发生变化。
因此确切了解乳酸杆菌变化及对乳酸杆菌进行精确定量对疾病的诊断有着重要的意义[1-4]。
本研究依据乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物，以常规PCR产物经克隆后的质粒DNA为标准品，经光谱定量、梯度稀释后制备标准曲线。
抽提肠道菌群的细菌基因组DNA，用实时荧光定量PCR技术定量分析样品中乳酸杆菌数量。
该项目完成后，有望建立一种高灵敏度的乳酸杆菌及肠道菌群定量检测体系，该检测体系将为定量检测乳酸杆菌提供有效的实验手段，并为相关检测试剂的研制奠定基础。
一、实验背景随着生物技术的发展，细菌基因组研究已成为微生物学领域的重要研究方向。
通过对细菌基因组进行深入研究，我们可以了解细菌的遗传信息、生物学特性以及与人类健康的关系。
本实验旨在通过提取细菌基因组DNA，进行PCR扩增、测序和生物信息学分析，探讨细菌的基因组结构和功能。
二、实验过程1. 细菌基因组DNA提取实验中，我们选取了常见的细菌菌株作为研究对象，采用酚-氯仿法提取细菌基因组DNA。
具体步骤如下：（1）将细菌培养至对数生长期，收集菌液。
（2）加入适量的SDS和蛋白酶K，充分混匀，进行细胞裂解。
（3）加入酚-氯仿，混匀，离心分离。
（4）取上清液，加入等体积的异丙醇，混匀，离心沉淀。
（5）用75%乙醇洗涤沉淀，干燥，溶解于TE缓冲液中。
2. PCR扩增为了获得细菌基因组中的特定基因片段，我们采用PCR技术进行扩增。
具体步骤如下：（1）设计特异性引物，用于扩增目标基因。
（2）配制PCR反应体系，包括模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶等。
（3）进行PCR扩增，包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。
（4）扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
3. 基因组测序将PCR扩增产物进行纯化，然后进行测序。
测序结果经过比对和组装，得到细菌基因组的完整序列。
4. 生物信息学分析利用生物信息学软件对测序结果进行注释、比较和分析，了解细菌基因组的结构和功能。
三、实验心得1. 实验过程中，我们充分认识到细菌基因组研究的重要性。
通过对细菌基因组的深入研究，我们可以揭示细菌的生物学特性、进化关系以及与人类健康的关系。
2. 在实验操作中，我们学会了酚-氯仿法提取细菌基因组DNA、PCR扩增、测序和生物信息学分析等关键技术。
这些技术为今后的研究奠定了基础。
3. 实验过程中，我们遇到了一些问题，如DNA提取效率低、PCR扩增产物不稳定等。
通过查阅文献、请教老师和同学，我们找到了解决问题的方法，提高了实验成功率。
4. 实验过程中，我们深刻体会到团队协作的重要性。
应用pcr技术鉴定细菌的原理
使用PCR技术鉴定细菌的基本原理是:
1. 提取待检测细菌的基因组DNA作为模板。
提取方法有机械破碎法、SDS裂解法等。
2. 设计特异性引物,针对目标细菌的特有基因序列设计合适的引物。
如16S rDNA等。
3. PCR反应体系配置。
配置PCR预混液,包含DNA聚合酶、dNTP、缓冲液等。
加入模板DNA和引物。
4. PCR反应程序。
程序包括变性、退火、延伸等阶段,循环25-35次,扩增目标序列。
5. 电泳检测。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,检测是否有特异性条带。
6. 特异性分析。
对PCR产物进行序列分析,确保扩增序列与目标细菌一致。
7. 敏感性分析。
优化PCR条件,确定检出限量,满足实际检测需求。
8. 重复性分析。
对不同来源样本重复实验,评价方法重复性。
9. 绘制标准曲线。
利用标准品浓度序列确定定量关系。
10. 结果判定。
根据条带强度、melting曲线或标准曲线判定Unknown样品中的目标细菌含量。
通过优化设计和操作,PCR技术可以高特异性、高敏感性地检测identify细菌,用于临床检验和食品检测等领域,成为细菌检测的重要技术手段。
