微生物的分离纯化：平板分离法

实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。

2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。

二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。

在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。

三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。

2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。

3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。

四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。

具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。

（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。

（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。

然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。

微生物纯培养—分离纯化方法汇总含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（mixed culture）。

如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（pureculture）。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。

得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。

１、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。

单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。

首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。

３、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。

用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。

划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。

富集培养法的方法和原理非常简单。

我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。

如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。

通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。

５、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。

然后快速冷却，并进行接种。

接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。

另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。

微生物菌种的分离和纯化方法Last revision on 21 December 2020从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。

1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。

当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。

大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。

所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。

这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。

固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。

最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。

这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。

稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。

如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。

随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。

微生物菌种的分离和纯化方法1.空气平板法空气平板法是一种常用的微生物菌种分离方法。

将待分离的微生物样品进行适当的稀释并均匀涂布在含有经过固化的琼脂平板上，然后放置在适宜的温度下进行培养。

微生物在平板上呈现为单个菌落，每个菌落都代表一个来自单一细胞的微生物。

通过挑取单个菌落，将其再次传代培养，最终可以得到纯净的菌种。

2.稀释平板法稀释平板法也是一种常用的微生物菌种分离方法，在空气平板法的基础上进行了改进。

先将待分离的微生物样品按一定比例稀释，然后将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上。

由于稀释后的样品中菌落之间的距离更远，因此每个菌落代表的是来自更少数的微生物细胞，得到纯净的菌种的几率更高。

3.前体菌种法前体菌种法是一种通过选择性培养基将目标微生物分离出来的方法。

选择性培养基可以通过添加特定的抗生素、酸碱度调节和特定营养物等来抑制其他微生物的生长而促进目标微生物的生长。

将待分离的微生物样品进行适当的稀释后接种在选择性培养基上，利用培养基的选择性促使目标微生物生长并抑制其他微生物的生长，最终得到纯净的菌种。

4.形态学分离法形态学分离法是一种根据微生物在形态和结构上的差异进行分离的方法。

先选择合适的培养基和培养条件，将待分离的微生物样品进行培养。

在培养过程中，观察并挑选出形态和结构上有明显差异的微生物，然后将其进行单菌维持培养，并通过形态特征进一步分离和纯化菌种。

5.生理生化特性分离法生理生化特性分离法是一种根据不同微生物菌株在代谢和物质转化方面的差异进行分离的方法。

根据微生物菌株的生理生化特性，如生长速度、氨基酸利用能力、产酸产气等，将微生物菌株进行初步分离，然后通过进一步的生化鉴定和特性测试，最终得到纯净的菌种。

总结起来，微生物菌种的分离和纯化方法有很多种类，选择合适的方法依赖于待分离的微生物特性和研究目的。

这些方法在微生物学的研究中起到了关键作用，为了获得纯净的微生物菌种提供了有效的手段。

实验五微生物的分离和纯化
实验目的：
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

实验原理：
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。

本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。

单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。

实验器材：
1．菌种米曲霉 (Aspergillus oryzae)。

2．培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。

3．溶液或试剂 10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。

4．仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。

环境中微生物的检测和分离纯化一．实验原理1.微生物的分离与纯化土壤中含有丰富的微生物，可以从中分离纯化得到很多有价值的菌株。

微生物常用的分离方法是平板分离法，根据某种微生物对生长条件的不同要求供给它适宜的培养环境，再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直到得到纯菌株。

2.平板菌落计数法将待测样品经适当稀释后，其中微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中含的菌落数。

二．实验材料与试剂1.土壤稀释溶液2.取液器（1000ml 1支），培养箱，培养皿（12个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000ml无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。

三．实验步骤（一）.无菌平板制备1.采用叠皿法把牛肉冻蛋白膏培养基倒入灭好菌的培养皿中，制作无菌平板（二）.周围环境中微生物的检测2.取一平板，分成6个区，做好标记。

同一个人同一根手指头按如下要求用力一致进行操作：分别用未洗过的手指头，自来水打湿的手指头，自来水认真洗过的手指头，洗手液洗过一遍的手指头，洗过两遍的，洗手液洗过又用酒精棉球消毒后的手指头在六个区上涂抹。

（平板1）3.取一平板，分区，分别用使用过的纸巾，硬币，旧纸币，餐卡在不同区拖动。

（平板2）4.在培养基上方抖动头发数次。

（平板3）5.取一平板，分区，用无菌接种环分别蘸一滴自来水，河水，豆浆在不同区划线。

（平板4）6.用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线。

（平板5）7.取两个平板，一个打开在实验台上放置30分钟，另一个在酒精灯火焰边打开皿盖1分钟。

（平板6）8.取一平板，打开盖，咳几下。

（平板7）（三）.从土壤中分离微生物1.采土样2.制备土壤稀溶液3.涂布吸取100ml稀释好的土壤稀溶液，较均匀地滴在平板上，再用无菌涂棒涂布均匀，涂1—2分钟4.培养将培养基平板倒置于37℃下培养24小时5.菌落计数四．实验结果1.平板1：从未洗到用酒精消毒总体趋势是菌落数越来越少，用自来水洗过和用洗手液洗过一遍的菌落数差不多；平板2：旧纸币和硬币的菌落数要多；平板3：抖头发的地方附近长出许多菌落；平板4：自来水菌落最多，其次是河水，河水的菌落分布成“牛”字形，和当时划线的形状一样，再其次是豆浆；平板5：划线的地方长出许多菌落；平板6：放在试验台上的平板长出各种形状的菌斑菌块，在酒精灯旁的基本没有菌落；平板7：咳几下的基本没有菌落。

实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。

而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。

3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。

3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。

3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。

4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。

5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。

并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。

5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。

划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

一、实验目的1. 熟悉平板划线分离培养法的基本原理。

2. 掌握平板划线分离培养的操作步骤。

3. 学习如何从混杂的微生物中分离纯种细菌。

4. 了解无菌操作技术在微生物实验中的重要性。

二、实验原理平板划线分离培养法是一种常用的微生物分离纯化方法。

其原理是将微生物样品涂布于固体培养基表面，利用微生物在培养基上的生长特性，通过划线操作，逐步稀释微生物，最终获得单菌落，从而实现微生物的分离和纯化。

三、实验器材1. 微生物培养箱2. 无菌操作台3. 玻璃棒、接种环、镊子等无菌操作工具4. 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基5. 菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合菌悬液6. 无菌培养皿、酒精灯、记号笔等四、实验步骤1. 准备工作- 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴锅中加热至融化。

- 将融化的培养基倒入无菌培养皿中，待冷却至约50℃时，均匀涂布于培养皿底部。

- 待培养基凝固后，用记号笔在培养皿底部标记A、B、C、D四个区域，分别代表菌源区、过渡区、过渡区、关键区。

2. 划线操作- 在无菌操作台中，用接种环挑取少量菌种，从A区开始，按无菌操作法划线至B区、C区，最后划线至D区。

- 划线过程中，每次划线前需用火焰灼烧接种环，以避免污染。

3. 培养- 将划线平板倒置放入培养箱中，在适宜的温度下培养24小时。

4. 观察与记录- 观察平板上的菌落生长情况，记录菌落的形态、大小、颜色等特征。

- 根据菌落特征，挑选典型单菌落进行进一步鉴定。

五、实验结果与分析1. 菌落特征- 在平板划线分离培养过程中，观察到A区菌落较多，B、C区菌落数逐渐减少，D区菌落数量明显减少，且多为单菌落。

- 通过观察，挑选出典型单菌落进行进一步鉴定。

2. 结果分析- 平板划线分离培养法是一种有效的微生物分离纯化方法，通过逐步稀释微生物，最终获得单菌落，从而实现微生物的分离和纯化。

- 在实验过程中，无菌操作是保证实验成功的关键。

任何一次操作不当都可能导致污染，影响实验结果。

微生物纯种的分离方法自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。

要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。

下面介绍几种纯种微生物的分离方法。

平板划线分离将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环沾取少量待分离的材料，在培养基表面平行或分区划线(图5-5)，然后，将培养皿放入恒温箱里培养。

在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。

液体稀释法将待分离的样品经过大量稀释后，取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面，培养后就可能得到单个菌落。

利用选择培养基进行分离不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。

用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。

菌丝尖端切割这种方法适于丝状真菌。

用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端，将它们移到合适的培养基上培养后，就能得到新菌落三、细菌的分离与计数（一）背景知识介绍1.细菌的分离与纯化自然界的细菌总是以杂居的方式存在，如土壤、水、空气等都分布着种类繁多的细菌。

我们如何知道这些杂居的细菌是哪种细菌呢？这就需要将这些带菌的材料中混杂的细菌，经过稀释，使其分散成单个存在的菌体，在固体培养基平板上，长成肉眼可见并具有一定特征的菌落。

这些菌落分离出来，进行纯培养。

所谓纯培养即在一个培养物中，所有的细菌都是由一个细菌分裂繁殖而产生的后代。

这种获得单一菌株纯培养的的方法称为细菌的分离。

常用的分离方法有稀释法和划线法。

（二）课题提出：我们的身体和周围的环境有大量的细菌，细菌与我们的生活和健康密切相关。

但是，自然存在的细菌都混杂在一起，我们要想研究和了解各种细菌的形态结构和功能，就要对其进行分离纯化，才能进行深入的研究。

如对一些致病菌的研究，食品卫生的研究，微生物工业的研究等。

在研究过程中，有时需要调查和检测细菌密度，则需要统计细菌的数量。